Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1 Болезнь альцгеймера 7
1.2 Фронто-темпоральные деменции и паркинсонизм, связанные с хромосомой 17 12
1.3 Гипотезы нейрональной дегенерации при болезни альцгеймера и фронто-темпоральных деменциях, связанных с хромосомой 17 14
1.4 ассоциированный с микротрубочками белок TAU 19
1.4.1 Белки, ассоциированные с микротрубочками 19
1.4.2 Структура белка tau 19
1.4.3 Функции белка tau 20
1.5 Образование агрегатов белка TAU 22
2. Цели и задачи исследования 27
3. Материалы и методы 28
3.1 Микробиологические методы 28
3.1.1 Культивирование бактерий 28
3.1.2 Приготовление электрокомпетентных клеток 29
3.1.3 Трансформация компетентных клеток 29
3.2 Молекулярно-генетические методы 30
3.2.1 Выделение плазмидной ДНК 30
3.2.1.1 Минипреп 30
3.2.1.2 Максипреп 31
3.2.2 Выделение геномной ДНК из ткани хвоста мыши 31
3.2.3 Определение концентрации ДНК 32
3.2.4 Гель-электрофорез ДНК 33
3.2.5 Модификация ДНК 33
3.2.5.1 Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции 33
3.2.5.2 Дефосфоршшрование ДНК CIP-фосфатазой 34
3.2.5.3 Амплифицирование ДНК в полимеразной цепной реакции 34
3.2.5.4 ТОРО-клонирование 36
3.2.5.5 Выделение ДНК из агарозных гелей 36
3.2.5.6 Лигирование 37
3.2.6 Секвенирование ДНК 37
3.3 Культуры клеток 38
3.3.1 Клеточные линии 38
3.3.2 Питательные среды и пассажирование клеток 38
3.3.3 Замораживание и оттаивание клеток 39
3.3.4 Подсчет клеток в гемоцитометре 39
3.3.5 Выделение и культивирование клеток мышиных нейронов 40
3.3.6 Выделение и культивирование клеток мышиных фибробластов 41
3.3.7 Стабильная трансфекция клеток с помощью DOTAP 41
3.3.8 Иммунофлуоресценция 42
3.3.9 Тест на люциферазу 43
3.4 Биохимические методы 44
3.4.1 Определение концентрации белка по Брэдфорду 44
3.4.2 Приготовление клеточных лизатов 44
3.4.3 Экстракция белка по методу Дэвиса 45
3.4.4 Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле 45
3.4.5 Окрашивание гелей Coomassie Brilliant Blue R-250 46
3.4.6 Вестерн блот 47
3.4.7 Иммунное окрашивание и негативное контрастирование протеинов 48
4. Результаты 49
4.1 Клонирование 49
4.2 Стабильная экспрессия ki8, к18/дк280, к18/дк280/і277рл308р в клетках нейробластомы мыши 52
4.2.1 Экспрессия К18 и мутантов в клетках 52
4.2.2 Зависимость экспрессии tau-гена
от концентрации доксициклина 55
4.2.3 Агрегация tau 57
4.2.4 Электронная микроскопия 60
4.2.5 Окрашивание высокомолекулярных агрегатов tau с помощью тиофлавина 62
4.2.6 Ингибирование индукции путем удаления доксициклина из культуральной среды 68
4.3 Скрининг лекарственных веществ 70
4.4 Первичные нейронные культуры 70
4.5 Выявление саркозил-нерастворимых агрегатов in vivo 75
5. Обсуждение результатов 76
6. Выводы 81
7. Список литературы 83
Список принятых сокращений
- Гипотезы нейрональной дегенерации при болезни альцгеймера и фронто-темпоральных деменциях, связанных с хромосомой 17
- Приготовление электрокомпетентных клеток
- Дефосфоршшрование ДНК CIP-фосфатазой
- Окрашивание высокомолекулярных агрегатов tau с помощью тиофлавина
Введение к работе
Болезнь Альцгеймера является одним из самых распространенных дегенеративных заболеваний нервной системы. На клеточном уровне для этой болезни характерны нейрофибриллярные сплетения, состоящие из спиралеобразных филаментов белка tau. Аналогичные нейрофибриллярные структуры наблюдаются при группе заболеваний, обьединениых под общим названием фронто-темпоральные деменции и паркинсонизм, связанные с хромосомой 17 (FTDP-17). Была установлена однозначная корреляция образования этих структур со степенью развития деменции и показано, что их накопление приводит к гибели нейронов.
На сегодняшний день описано лишь небольшое количество работ по созданию клеточных моделей для изучения молекулярных механизмов нейрофибриллярной патологии. Ни одна из предложенных моделей на основе полноразмерного белка tau не была адекватна, поскольку в них присутствовали лишь отдельные филаменты при отсутствии характерных нейрофибриллярных сплетений.
Новизна нашего подхода при создании клеточной модели заключалась в использовании конструктов, содержащих только Repeat-регион tau, поскольку из литературных данных известно, что этот участок является центральным ядром патологических нейрофибриллярных сплетений. Для получения клеточной модели были использованы охарактеризованные в нашей лаборатории конструкты, приводящие к образованию филаментов in vitro.
Гипотезы нейрональной дегенерации при болезни альцгеймера и фронто-темпоральных деменциях, связанных с хромосомой 17
Образование нейрофибриллярных клубочков и амилоидных бляшек является особенностями болезни Альцгеймера на клеточном уровне. Однако следует подчеркнуть, что, если образование нейрофибриллярных плетений можно разделить на 6 стадий, коррелирующих с клиническими признаками, то количество амилоидных бляшек и их появление в различных частях головного мозга больных людей, сильно варьирует [10]. Несмотря на то, что состав белков бляшек и клубочков описан, однако причина их образования до сих пор неясна. Для объяснения патогенеза болезни Альцгеймера на молекулярном уровне предложены различные гипотезы, из которых наиболее интересными являются современная гипотеза роли нейрофибриллярных клубочков и давно известная гипотеза амилоидного каскада [41].
Гипотеза амилоидного каскада. Гипотеза амилоидного каскада (рис.5) была предложена более 10 лет назад. Основным предположением этой гипотезы является, что 6-амилод (АВ), главный компонент амилоидных бляшек, является инициатором дегенеративных процессов. Гипотеза амилоидного каскада утверждает, что отложения AS стоят в причинной связи с клиническими симптомами болезни Альцгеймера. Показано, что АБ-пептид образуется при физиологическом расщеплении мембранного белка АРР, Расщепление АРР может осуществляться двумя путями: амилоидогенным путем, при котором освобождаются АВ-пептиды, и неамилоидогенным путем с образованием sAPPa - не патологической формы АРР [42].
Предполагается, что нарушение регуляции расщепления АРР является ключевым патогенетическим звеном заболевания. Превалирование аномального процесса амилоидогенеза возникающее в начале болезни, приводит к повышенной продукции более длинного пептида А642, который формирует ядро амилоидной бляшки и инициирует все последующие патологии. Было показано, что А642 обладает нейротоксическим эффектом, и эта токсичность может иногда непосредственно приводить к гибели нейронов, потере синапсов и к деменции.
Следует отметить, что А6д2 может вызывать гиперфосфорилирование tau [43-45] , приводящее к его агрегации и образованию нейрофибриллярных сплетений внутри нейронов, к гибели нейронов и деменции.
Несмотря на то, что большинство мутаций, вызывающих болезнь Альцгеймера, приводят к нарушению регуляции амилоидогенеза, гипотеза амилоидного каскада, утверждающая, что именно аномальный амилоидогенез является причиной нейрональной дисфункции и гибели нейронов, не была подтверждена в исследованиях на трансгенных мышах и культурах нейронов [46]. Показано, что присутствие АВ может лишь усиливать нейродегенерацию, но не вызывать ее. Трансгенные мыши, экспрессирующне АВ, имели большое количество амилоидных бляшек, но нейрофибриллярных сплетеними в нейронах обнаружено не было. Опыты с первичными нейронными культурами показали, что А6 вызывает дегенерацию в нейронах мышей, несущих ген tau, но не в нейронах tau knockout мышей [46].
Таи гипотеза
Таи гипотеза является одной из современных популярных гипотез нейродегенеративных заболеваний. Согласно этой гипотезе причины нейродегенеративных процессов в нейронах и их отмирание связано с образованием внутриклеточных нейрофибриллярных сплетений, образованных из агрегатов белка tau (рис. 6). При нарушении фосфоршіирования белка tau или наличии некоторых мутаций в его структуре ослабляется связывание его с микротрубочками (МТ), то есть увеличивается количество "свободного" tau внутри клетки [42]. "Свободный" tau агрегирует и из этих агрегатов образуются нейрофибриллярные сплетения. Дополнительным негативным последствием уменьшения связывания tau с МТ является их деполимеризация и дисфункция [56]. Имеются данные, что на увеличение количества "свободного" tau могут влиять другие факторы, как, например, токсичность АІЇ42- Предполагается, что процесс агрегации tau, в отсутствие мутаций, может быть результатом повышенного фосфор ил ирования, воздействия протеаз или полианнонов [15].
Исследования, проведенные на биопсийном материале [47], показали отсутствие взаимосвязи в пространстве и во времени между амилоидными бляшками и нейрофибриллярными сплетениями. Эти же исследования показали, что нейрофибриллярные сплетения, возможно, предшествуют амилоидным бляшкам или, что менее вероятно, формируются независимо. Сходные результаты были получены в другой лаборатории [48], где также не было обнаружено корреляции между количеством агрегированного tau и АВ42- Вероятно, более значимым процессом в патогенезе болезни является не образование АВ42, а накопление гиперфосфорилированного и агрегированного белка tau [49]. Доказательством этому служат иерархическое распространение процесса нейродегенерации, корреляция прогрессирования болезни и нарастания симптомов с распространением именно нейрофибриллярной патологии [50].
Приготовление электрокомпетентных клеток
Все использованные штаммы E.coli выращивали в стерильной питательной среде Luria-Bertani (LB; 1% (w/v) NaCl, \% (w/v) гидролизат казеина, 0.5% (w/v) дрожжевой экстракт, рН 7.0) при 37С. Для штаммов, резистентных к карбенициллину, в среду добавляли 50мкг/мл карбенициллина.
Небольшое количество замороженной культуры клеток DH5a высеивали в колбу Эрленмейера с 50 мл среды LB. Культуру инкубировали в течение 16-18 часов в инкубаторе при 37С на шейкере. На следующий день 5мл выращенной культуры пересеивали в 1 литр среды LB и инкубировали при 37С на шейкере до тех пор, пока культура не достигала середины логарифмической фазы роста и не содержала 6-8 х 107 жизнеспособных клеток/мл. Затем культуру охлаждали 30 минут во льду, клетки осаждали центрифугированием при 750g 15 мин при +4С. После этого клеточный осадок дважды промывали в 1 литре холодной стерильной дистиллированной воды. Остатки воды тщательно удаляли, клеточный осадок ресупендировали в 2 мл 10% ледяного глицерина. Клетки замораживали в жидком азоте и хранили при -80С.
Для трансформации плазм идной ДНК в клетки Е. coli использовали метод электропорации. Электропорацию компетентных клеток проводили помощью Electro Cell Manipulator (фирма ВТХ). Параметры электропорации: 1.8 кВ, 25iF, 200 Ом; зазор ячейки 0.2см (время импульса 3.5-4.5 мсек.). Все процедуры проводили при +4С. К аликвоте ДНК добавляли 50 мкл компетентных клеток, после чего пробу подвергали действию электрического импульса. Затем клетки суспендировали в среде SOC содержащей 0.5% (w/v) дрожжевого экстракта, 2% (w/v) триптона, 10 М NaCl, 2.5 мМ КС1, 10 мМ MgC12, 20 мМ MgS04, 20 мМ глюкозы, и инкубировали с использованием шейкера при +37С в течение 1 часа. После центрифугирования (500x g, 5 мин при комнатной температуре) клетки из осадка высевали на чашки Петри с агаром LB, содержащие 50 мкг/мл карбенициллина и инкубировали в течение 16-18 часов в инкубаторе при 37С.
Плазмидігуїо ДНК (минипреп) выделяли с помощью Concert Rapid Plasmid Miniprep System (GIBCO) по методу, указанному в инструкции изготовителя.
Одиночную колонию с чашки Петри инокулировали в 5 мл среды LB (50мкг/мл карбенициллин), культуру выращивали 14-18 часов при +37С на шсйкере. 4 мл культуры центрифугировали при 250g, +4С, в течение 15 мин. Осадок ресуспендировали в 210 мкл раствора G1 (50 мМ Трис-HCl, рН 8.0; 10 мМ EDTA, 20 мкг/мл Rnase А). Затем к ресуспендированным клеткам добавляли 210 мкл раствора G2 (200 мМ NaOH, 1% (w/v) SDS) и инкубировали 5 минут при комнатной температуре. Затем добавляли 280 мкл раствора G3 и центрифугировали 10 минут, при 1200g при комнатной температуре. Надосадочную жидкость переносили в колонки и центрифугировали 1 минуту, при 1200g при комнатной температуре. После этого колонку промывали 500 мкл раствора G4. ДНК элюировали в 50 мкл раствора ТЕ (100 мМ Трис-HCl, рН 8.0; 1 мМ EDTA) и центрифугировали 1 минуту при 12000g при комнатной температуре.
Для стабильной трансфекции эукариотических клеток N2a плазм идную ДНК выделяли с помощью EndoFree Plasmid Maxi Kit (QIAGEN) по методу, указанному в инструкции изготовителя.
Клетки высевали в колбу Эрленмейера с 100 мл среды LB (50 м кг/мл карбенициллин), ночную культуру выращивали 14-18 часов при +37С на шейкере» затем центрифугировали при 250g, +4С, в течение 15 мин. Осадок ресуспендировали в 10 мл раствора Р1 (50 мМ Трис-HCl, рН 8.0; 10 мМ EDTA; 100 мкг/мл Rnase А). К ресуспендированным клеткам добавляли 10 мл раствора Р2 (200 мМ NaOH; 1% (w/v) SDS) и инкубировали 5 минут при комнатной температуре, после чего добавляли 10 мл раствора РЗ (З М ацетат калия, рН 5.5). Клеточный лизат помещали на QIAfilter Midi Cartridge, инкубировали 10 минут при комнатной температуре, затем фильтровали. К отфильтрованному лизату добавляли 2.5 мл раствора ER и инкубировали во льду 30 минут. Лизат наносили на колонку QIAGENip 500, уравновешенную 10 мл раствора QBT (750 мМ NaCI; 50 мМ MOPS, рН 7.0; 15% (v/v) изопропанол; 0.15 % (v/v) тритон Х-100), Колонку промывали дважды 30 мл раствора QC (1 М NaCI; 50 мМ MOPS, рН 7.0; 15% (v/v) изопропанол). Плазмидную ДНК осаждали 15 мл раствора QN (1.6 М NaCI; 50 мМ MOPS, рН 7.0; 15% (v/v) изопропанол), после осаждения добавляли 10.5 мл изопропанола и центрифугировали 30 минут, при 20000g при +4С. Осадок промывали в 5 мл 70% этанола, сушили на воздухе и ресуспендировали в 100 мкл раствора ТЕ (100 мМ Трис-HCl, рН8.0; 1 MMEDTA).
Дефосфоршшрование ДНК CIP-фосфатазой
Клетки культивировали в инкубаторе при следующих условиях: Температура + 37С; Влажность воздуха 98%; Содержание СОг 5%.
В качестве культуральной среды использовали минимальную среду (MEM; Gibco) с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота и 1 % заменимых аминокислот. Дополнительно в культуральную среду добавляли 300 мкг/мл генетицина (G-418), 100 мкг/мл гигромиципа и доксициклина для индукции экспрессии белка 1 мкг/мл. Перед обработкой трипсином монослой клеток промывали теплым фосфатно-солевым буфером (PBS; Biochrora AG). Клетки инкубировали с трипсином (Trypsin EDTA; Gibco) в течение 3 минут при 37С. Клетки, обработанные трипсином, ресуспендировали в культуральной среде и центрифугировали 5 минут при 100g. Культуральную среду осторожно удаляли. Клеточный осадок ресуспендировали в свежей культуральной среде. Часть клеточной суспензии переносили в новую посуду.
Замораживание и оттаивание клеток линии N2a(tet on) Выращивали необходимое количество клеток (для изготовления одного стока нужен один флакон Т25), обрабатывали трипсином и центрифугировали 5 минут при 100g. Осажденные клетки ресуспендировали в заранее охлажденной среде для замораживания (50 % сыворотка крупного рогатого скота; 20% DMSO в минимальной среде MEM) из расчета 1 мл среды для клеток из одного флакона Т25. Ресуспендировапные клетки переносили в пластиковые пробирки с завинчивающейся крышкой (Nunc) по 1 мл в каждую пробирку. Пробирки с клетками помещали в контейнер с бутанолом на 14-18 часов при -70С и после этого хранили в жидком азоте.
При оттаивании пробирку с клетками быстро размораживали на водяной бане при + 37С. Клетки переносили в пробирку Falcon, добавляли по каплям 20 мл теплой культуральной среды, инкубировали 20 минут. После инкубации центрифугировали 5 минут при 100g. Клетки ресуспендировали в культуральной среде и переносили во флакон Т25, Культивировали в инкубаторе при обычных условиях.
Покровное стекло помещали на предметное стекло гемоцитометра, слегка прижимали до появления колец Ньютона. Каплю клеточной суспензии помещали на край покровного стекла так, чтобы суспензия проникала в камеру. Подсчитывали количество клеток в четырех больших квадратах в углах каждой из двух заштрихованных областей. Считали клетки правой и верхней ограничивающих линий, но не клетки, касающиеся левой и нижней ограничивающих линий.
Количество клеток в 1 мл суспензии получали по усредненному значению числа клеток в одном квадрате. Перед экспериментом поверхности стекла или пластика покрывали полилизином (50 мкг/мл в фосфата о-солевом буфере) и посуду инкубировали 14-16 часов в инкубаторе. После этого посуду трижды промывали фосфатно-солевым буфером и в каждую лунку добавляли культуральнаю среду (10 % сыворотки лошади, 20 мМ глюкозы, 1 мМ пирувата натрия, 50 U/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина в минимальной среде MEM). Беременную мышь (17-18 день беременности) умертвляли путем смещения шейных позвонков. Извлекали эмбрионы из матки. От каждого эмбриона брали для генотипизирования небольшой кусочек хвоста, для культуры фибробластов -кусочек кожи со спины. Головной мозг разделяли на полушария, удаляли ствол мозга, снимали паутинную оболочку, отделяли гиппокамп и кору мозга. Гиппокамп и кору помещали в пробирки со средой и измельчали механически с помощью пипетки. С помощью гемоцитометра подсчитывали количество клеток. Нужное количество суспензии переносили в планшет (таб. 1). Через 4 часа меняли среду на ростовую среду (2 мМ глютамина; 2 % В27; 50 U/мл пенициллина; 50 мкг/мл стрептомицина в Neurobasal Medium). К контрольным клеткам добавляли 50 иг/мл доксициклииа. Через 5 дней заменяли половину ростовой среды на свежую с добавлением Ага С (конечная концентрация 3 мкМ).
Для выделения и культивирования фибробластов брали кусочки уха у взрослых мышей или кусочки кожи у эмбрионов. Материал измельчали с помощью пинцета и ножниц, после этого переносили в чашку Петри, добавляли 2 мл среды, содержащей 1мг/мл коллагеназы (KoUagenase Тур la; Sigma) и инкубировали в инкубаторе 14-16 часов. После этого клетки ресуспендировали с помощью пипетки, суспензию переносили в пробирку Falcon, добавляли 10 мл культуральной среды (20% сыворотка крупного рогатого скота; 50 U/мл пенициллина; 50 мкг/мл стрептомицина в среде RPMI; Gibko), перемешивали и центрифугировали 5 минут при 100g. Клеточный осадок ресуспендировали в 3 мл культуральной среды. Через 24 часа клетки аккуратно промывали теплым фосфатно-соляным буфером, затем добавляли 3 мл свежей среды. После образования монослоя клетки пересаживали для трансфекции и теста на люциферазу в пластинки с 6 лунками.
Окрашивание высокомолекулярных агрегатов tau с помощью тиофлавина
Как известно из литературных данных, при болезни Альцгеймера и FTDP-17 наблюдаются патологические нейрофибриллярные клубки, центральным ядром которых является Repeat-регион белка tau. В нашей лаборатории были проведены исследования агрегации конструктов, состоящих только из Repeat-региона белка tau: К18, К18/ДК280, К18/ДК280/І277Р/І308Р. Было показано, что скорость агрегации белка tau в предложенных конструктах намного выше по сравнению со скоростью полноразмерного белка. Наибольшей скоростью агрегации обладал конструкт К18/ДК280 [102-103].
Проведенные исследования послужили основанием для использования этих конструктов в настоящей работе при получении стабильных индуцибельных линий нейробластомы мыши и для построения клеточной модели нейрофибриллярной патологии.
Тестирование полученных линий проводили с помощью вестерн блота и конфокальной микроскопии фиксированных препаратов клеток, окрашенных антителами к тубулину и белку tau. Окраска клеток антителами к тубулину показала сходство морфологии клеток линий-продуцентов и контрольной линии. Иммунофлуоресценция фиксированных клеток с помощью антител к белку tau выявила высокий уровень экспрессии и диффузное распределение белка в клетке (Рис. 14). Анализ вестерн-блота лизатов клеточных линий показал сопоставимый уровень экспрессии белка во всех клеточных линиях (рис. 15).
Таким образом, было показано, что полученные линии могут быть использованы для сравнительного анализа. Одним из наиболее распространенных в литературе методов по выявлению характерных филаментозных агрегатов tau из препаратов головного мозга людей, умерших от болезни Альцгеймера или FTDP-17, является экстракция с помощью саркозила по методу Дэвиса. Нами этот метод был применен для выявления агрегатов из лизатов клеточных линий.
Анализ вестерн-блота саркозил-растворимой и саркозил-нерастворимои фракции белка после 2, 5, 7, 9 и 11 дней индукции (рис. 18) выявил присутствие высокомолекулярных и низкомолекулярных агрегатов в линиях К18 и К18/ДК280. Хотя содержание высокомолекулярных агрегатов в саркозил-нерастворимои фракции белка увеличивалось со временем индукции, их количество при любом времени индукции было значительно меньше количества низкомолекулярных агрегатов. В случае линии К18/ДК280Л277Р/І308Р наблюдалось присутствие только низкомолекулярных агрегатов в саркозил-нерастворимои фракции белка, высокомолекулярные агрегаты не появлялись даже при самом длительном времени индукции, что хорошо коррелирует с данными, полученными in vitro (рис.10) [102].
Полученные саркозил-нерастворимые фракции линий К18 и К18/ДК280 были охарактеризованы с помощью электронной микроскопии (рис. 20). Окраска этих препаратов антителами к белку tau, меченными коллоидным золотом, выявила наличие филаментозных структур, аналогичных нейрофибриллярным структурам, наблюдаемым при патологии.
Окрашивание тиофлавином-S позволяет наиболее эффективно установить наличие характерных патологических фибриллярных агрегатов внутри клетки с помощью конфокальной микроскопии. Был проведен анализ фиксированных клеточных препаратов полученных линий, окрашенных тиофлавином-S и антителами к tau. Полученные данные (рис. 21-25) позволили выявить фибриллярные сплетения в клетках линий K1S и К18/ДК280. Было показано, что количество и время появления этих агрегатов зависит от длительности индукции.
Все приведенные выше результаты, а также обнаруженная корреляция по времени индукции в образовании высокомолекулярных агрегатов в саркозил-нерастворимой фракции белка и появлению фибриллярных сплетений на клеточном уровне, позволяют сделать вывод, что они аналогичны патологическим филаментозным структурам, наблюдаемым при болезни Альцгеймера и FTDP-17. Таким образом, впервые получена стабильная клеточная линия, в которой экспрессия мутанта К18/ДК280 приводит к образованию агрегатов tau, аналогичных патологическим нейрофибрштлярным сплетениям. Это представляет возможность использовать линии К18 и К18/ДК280 как клеточные модельные системы нейрофибриллярной патологии. Так как линия К18/ДК280 экспрессировала максимальное количество нейрофибриллярных сплетений при наименьшем времени индукции по сравнению с К18, то именно эта линия была предложена в качестве клеточной модели.
Была экспериментально протестирована возможность практического применения клеточной линии К18/ДК280 для скрининга лекарственных веществ, 12 лекарственных веществ, использованных для этого теста, были отобраны в нашей лаборатории в экспериментах по позитивному ингибированию образования филаментов in vitro при скрининге 12 000 веществ (MERCK) [129]. 11 протестированных нами веществ были токсичны на клеточном уровне. Лишь 1 препарат emodin был нетоксичен для клеток и показал эффект ингибирования на клеточном уровне (рис.27).
