Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Строение сетчатки 9
1.1.2. Кровоснабжение сетчатки 11
1.2. Ишемия сетчатки 12
1.2.1. Модели ишемии сетчатки глаза на животных 13
1.2.2 Электроретинограмма при ишемии 17
1.3. Механизмы ишемии, обусловленные нейрональными медиаторами . 19
1.3.1. Изменения концентрации глутамата в сетчатке глаза при 21 ишемии
1.3.2. Глутаматная эксайтотоксичность in vitro и in vivo при 24 ишемии
1.3.3. Механизм глутаматной эксайтотоксичности 26
1.4. Роль свободных радикалов в ишемии сетчатки 28
1.5. Ацидоз в сетчатке глаза при ишемии 30
1.6. Молекулярные аспекты клеточной гибели при ишемии (апоптоз) . 31
1.7. Оксид азота как сигнальная молекула 32
1.7.1. Динитрозильные комплексы железа 36
1.8. Нитриты как альтернативный источник оксида азота 37
1.8.1. Содержание нитритов в органах и тканях 38
1.8.2. Нитриты как терапевтический и физиологический сосудорасширяющий фактор
Глава 2. Материалы и методы исследований 42
2.1. Экспериментальные модели 42
2.2. Гистологические и иммуногистохимические методы 44
2.3. Электрофизиологический метод 46
Глава 3. Результаты исследований 48
3.1. Исследование действия нитритов в сетчатке на модели ишемии сетчатки глаза кроликов
3.1.1. Регистрация электроретинограммы при ишемии сетчатки глаза кроликов
3.2. Модель ишемии сетчатки глаза на крысах
3.2.1. Исследование глазного дна крыс после лазерной коагуляции
3.2.2. Регистрация электроретинограммыпри ишемии сетчатки глаза крыс
3.2.3. Гистологические иммуногистохимические исследования сетчатки глаза крыс после лазерного воздействия
3.2.4. Действие нитритов на клетки сетчатки глаза крысы при ишемии
3.3. Роль оксида азота в механизме развития апоптоза при ишемии сетчатки
3.4. Повреждение сетчатки глаза крысы при глутуматнои интоксикации DJ
3.5. Повреждение сетчатки крысы при повышении концентрации оксида "' азота
Глава 4. Обсуждение результатов 71
Выводы 79
Цитированная литература 80
- Модели ишемии сетчатки глаза на животных
- Роль свободных радикалов в ишемии сетчатки
- Гистологические и иммуногистохимические методы
- Регистрация электроретинограммы при ишемии сетчатки глаза кроликов
Введение к работе
Оксид азота играет ключевую роль в регуляции самых разных биологических функций. Известно также, что оксид азота играет важную роль в развитии патологий сетчатки и зрительного нерва. В сетчатке глаза относительно высокая концентрация оксида азота обнаруживается' в- двух слоях — во-внутренних сегментах фоторецепторного слоя-и слое ганглиозных клеток. Оксид азота является регулятором синаптической передачи, одним из медиаторов которой является тлутамат.
Сетчатка глаза находится в-тесном контакте с ретинальными сосудами, которые проходят через все внутренние слои сетчатки и снабжают их кислородом и необходимыми метаболитами. Оксид азота, являясь сосудорасслабляющим фактором, регулирует состояние сосудов как в норме, так и при патологиях и, следовательно, оказывает значительное влияние на работу всех элементов сетчатки. Это особенно важно в условиях гипоксии, когда недостаток кислорода приводит к развитию ишемии сетчатки — причины многочисленных офтальмологических заболеваний.
С другой стороны, известно, что оксид азота может играть и нейротоксическую роль, приводя к апоптозу нервных клеток. Предполагаемой причиной такого действия является взаимодействие оксида азота с супероксид-анион радикалом с образованием пероксинитрита. Пероксинитрит может разлагаться с образованием гидроксильного радикала - сильного токсического агента, приводящего, среди прочего, к апоптотической гибели клеток.
В данной работе нами исследованы оба механизма действия оксида азота - как нейропротекторного фактора, защищающего сетчатку глаза от ишемии, так и нейротоксического фактора, вызывающего апоптотическую гибель клеток.
Для изучения защитных и нейротоксических свойств^ оксида азота нами была разработана модель ишемии сетчатки глаза на
экспериментальных животных. Изучение ишемии сетчатки важно для-понимания патогенеза таких связанных с сосудистой недостаточностью заболеваний, как окклюзия ретинальной артерии, глаукома, макулярная дегенерация и др. (Osborne N.N. et al., 2004). Мы создавали ишемию сетчатки с использованием лазерной коагуляции ретинальных сосудов. Такое воздействие, с одной стороны, позволяет резко снизить концентрацию кислорода непосредственно в сосудах и наблюдать за изменением их диаметра при действии нитритов в условиях недостатка кислорода in vivo; с другой стороны, как следствие, вызывать развитие ишемии сетчатки и по состоянию сетчатки оценить степень ее кровоснабжения. Кроме того, такая модель не затрагивает прямо нервные элементы сетчатки'.
Оксид азота продуцируется в клетке ферментом- NO-синтазой, основным субстратом которой- является аргинин. До последнего времени аргинин считался; по существу, единственным источникомг оксида азота» в организме. В» последние годы внимание многочисленных исследователей привлек процесс восстановления нитритов до оксида азота и таким образом нитриты также могли бы оказаться источником оксида азота. Предполагается, что нитриты могут восстанавливаться до- оксида азота гемсодержащими белками. Особенно активно этот процесс будет происходить в условиях пониженной концентрации^ кислорода, когда образующийся оксид азота, во-первых, не окисляется до диоксида, а, во-вторых, может связываться с гемом белка, занимая сайт связывания кислорода.
В данной работе мы показали, что такой процесс может происходить в ретинальных сосудах in vivo, причем, за времена порядка минуты. Продемонстрировано, что восстановленный из нитрита оксид азота действует как фактор расслабления сосудов и защищает сетчатку глаза от ишемии.
Целью настоящей работы являлось установить роль и химические механизмы действия оксида азота как нейропротекторного* и нейротоксического факторов при развитии патологий в сетчатке глаза.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
Создать адекватные модели- зрительных патологий на экспериментальных животных (ретинальная ишемия и глутаматная интоксикация сетчатки глаза).
Выяснить, участвует ли оксид азота в развитии нейродегенерации при ишемии сетчатки глаза и является* ли он проапоптотическим фактором.
Создать модель, позволяющую наблюдать > изменения отдельного сосуда сетчатки при гипоксии на экспериментальных животных.
Выяснить возможность восстановления нитритов до оксида азота в ретинальных сосудах при ишемии'сетчатки.
Выяснить, может ли введение нитритов вызывать расширение сосудов и таким образом защищать сетчатку от ишемии в условиях гипоксии в разработанной нами модели ретинальной ишемии.
Исследовать нейротоксическое действие избытка оксида азота на клетки сетчатки глаза.
Результаты,проведенных исследований имеют важное теоретическое и практическое значение для понимания роли оксида азота при развитии нейродегенеративного процесса, вызванного ишемией. Данные об» участии оксида азота в развитии патологических заболеваний сетчатки глаза ставят вопрос о новых стратегиях лечения таких ишемических заболеваний сетчатки глаза, как глаукома, диабетическая ретинопатия и др. Нами разработана модель, позволяющая отличить патологическое действие гипоксии от патологического действия повышения внутриглазного давления, вызывающего дегенерацию нервных клеток. На этой модели показано, что оксид азота является необходимым элементом в развития апоптоза, вызванного исключительно ишемическим повреждением. Это
8 принципиально важно для разработки лекарственных средств и понимания механизмов возникновения ряда зрительных патологий. Обнаруженный нами защитный эффект нитритов при развитии ишемии вследствие гипоксии имеет важное значение для разработки антиишемических средств лечения глазных патологий.
На защиту выносятся следующие положения:
Модель ишемии сетчатки с использованием лазерной коагуляции ретинальных сосудов.
Введение нитритов в условиях гипоксии приводит к быстрому расширению сосудов, защищает сетчатку от ишемии и вызванной ею апоптотической гибели клеток.
Ингибирование NO-синтазы предотвращает развитие апоптоза при ишемии и глутаматной интоксикации сетчатки глаза.
Модели ишемии сетчатки глаза на животных
Одна из часто используемых моделей ишемии сетчатки - повышение внутриглазного давления. При первых попытках внутриглазное давление у крыс повышали путем введения жидкости в глаз, тем самым создавая давление, которое вытесняло кровь из ретинальных сосудов (Smith et al., 1952). Позже методика была усовершенствована (Buchi et al., 1991): жидкость вводилась в переднюю камеру глаза, при этом происходила блокировка ретинальной и увеальной циркуляции крови, что вызывало глобальную ишемию, сопровождавшуюся уменьшением амплитуды Ь-волны электроретинограммы (ЭРГ). Патологические последствия при использовании этой модели идентичным тем, которые наблюдаются после окклюзии центральной ретинальной артерии. Кратковременное повышение внутриглазного давления (меньше 20 минут) вызывает только временные изменения электроретинограммы, и по мере перехода к физиологическим условиям происходит ее восстановление (Foulds and Johnson, 1974). Увеличение времени повышения внутриглазного давления (более 35 минут) вызывает глубокие структурные изменения в сетчатке (Osborne and Larsen, 1996; Safa and Osborne, 2000). Интересно отметить, что степень ишемического повреждения зависит от пигментации животных. Так, сетчатки крыс-альбиносов были более подвержены повреждению, чем сетчатки пигментированных крыс (Safa and Osborne, 2000).
Наложение лигатуры на сосуды - это другой, широко используемый способ моделирования ишемии сетчатки у крысы (табл. 1). В самом простом случае сжатие сосудов в районе зрительного нерва приводит к нарушению проводимости цилиарных сосудов. Однако при этом пережимается и зрительный нерв, повышается внутриглазное давление и, по-видимому, повреждаются аксоны. Известно, что при моделировании повышение внутриглазного давления вызывает более сильные ишемические повреждения, чем наложение лигатуры на сосуды, что характеризуется более медленным восстановлением b-волны ЭРГ (Gehlbach et al., 1994). Это объясняется дополнительными механическими (из-за повышенного давления) повреждениями сетчатки. Более сложный способ наложения-лигатуры состоит в разделении зрительного нерва и кровеносных сосудов и перевязке только сосудов (табл.1). Однако технически сделать это очень сложно, так как требует высокой квалификации хирурга, поэтому результаты будут плохо воспроизводимы.
Одностороннее пережатие позвоночной и сонной артерий крыс приводит к слабым повреждениям сетчатки, а двухсторонняя окклюзия сонной артерии - к хронической потере ганглиозных клеток, дегенерации зрительного нерва и другим дегенеративным нарушениям сетчатки (Spertus et al., 1984; Takamatsuet al, 1984; Stevens et al., 2002; Wakita et al., 2002). После обыкновенной двусторонней окклюзии сонной артерии приблизительно 70% крыс утратили зрачковые рефлексы, а у остальных крыс не наблюдалась даже дегенерация зрительного нерва, что, вероятно, отражает индивидуальную восприимчивость І к ишемии и неравномерность ишемии, вызываемой этим воздействием (Stevens et al., 2002). Так называемая четырехсосудистая окклюзия у крысы (окклюзия позвоночных, а затем и сонных артерий) приводит к глубокой церебральной и глазной ишемии, которые, как правило, приводят к летальному исходу, если воздействие не прекращается. Эти модели имитируют острую недостаточность сонной артерии и приводят к патологиям сетчатки. Но основной недостаток этих моделей заключается в том, что одновременно с ретинальной ишемией повреждается зрительный нерв, и развивается церебральная ишемия (Wakita et al., 2002), делая достаточно сложной задачу разделения действия самой ишемии и ретроградных дегенерации.
Относительно неинвазивный метод окклюзии ретинальных сосудов заключается во внутривенном введении фоточувствительного красителя бенгальского розового, вызывающего тромбоз ретинальных сосудов при интенсивном освещении сетчатки (Mosinger et al., 1991; Romano et al., 1993; Daugeliene et al., 2000). Однако, ишемия, создаваемая этим методом, сопровождается многочисленными структурными фотоповреждениями сетчатки (Buchi et al., 1994), кроме того, краситель сам по себе является достаточно токсичным соединением.
Электроретинограмма (ЭРГ) - это регистрация многокомпонентных электрических ответов сетчатки на вспышки света, отражающая функциональную активность клеток сетчатки. Каждый из компонентов ЭРГ генерируется различными слоями сетчатки. В. ЭРГ выделяют два основных компонета - а-волну, отражающую функциональную активность фоторецепторов (рис.3) и более позднюю b-волну, отражающую электрическую активность биполяров и мюллеровских клеток с возможным вкладом амакриновых и горизонтальных клеток. На восходящей части Ь-волны регистрируются быстрые 5-7 небольших волн, названных осцилляторными потенциалами, которые,- возможно, отражают взаимодействие клеточных элементов во внутренних слоях сетчатки.
Роль свободных радикалов в ишемии сетчатки
В повреждениях, вызываемых ишемией, участвуют свободные радикалы, накапливающиеся при развитии патологического процесса (Bonne et al., 1998). На первых стадиях ишемии они возникают в результате нарушения кровоснабжения, а, следовательно, и снабжения кислородом и метаболическими субстратами. В дальнейшем, на стадии восстановления кровотока (реперфузии) и ожидаемого улучшения состояния ткани патологический процесс продолжается вследствие так называемых реперфузионных повреждений, в которых участвуют свободные радикалы, образующиеся при повторном окислении накопленных при ишемии продуктов. Предполагают, что при значительном и достаточно быстром образовании свободных радикалов происходит подавление нормальных клеточных антиоксидантных защитных механизмов, вызывающее окислительный стресс и различные типы повреждения тканей (Gilgun Sherki et al., 2002).
Одним из участников повреждений при реперфузии является молибден-содержащий фермент ксантиноксидаза (ксантиноксидоредуктаза). Ксантиноксидаза участвует в катаболизме пуринов, катализируя окисление гипоксантина в ксантин и его последующее окисление в мочевую кислоту. При этом в сопряженной реакции ксантиноксидаза восстанавливает кислород до супероксида, который спонтанно дисмутирует в пероксид водорода. Таким образом, в процессе этой реакции образуются активные формы кислорода, способные вызывать окислительный стресс. Так, при длительной ишемии в тканях накапливаются продукты распада пуринов и при реперфузии, когда уровень кислорода восстанавливается, ксантиноксидаза продуцирует повышенное количество токсичных супероксида и пероксида водорода. В результате взаимодействия пероксида водорода и супероксида образуется очень токсичный гидроксильный радикал (ОН ). Кроме того, О?" может взаимодействовать с оксидом азота (NO"), который образуется в значительных количествах после ишемии, приводя к формированию; пероксинитрита, нитрозильного радикала и, в конечном счете, ОН (ЄНап, 1996;.Gilgun.Sherki-et.al-, 2002).
Впервые повреждающее действие свободных радикалов на сетчатку было обнаружено: при перфузии изолированной сетчатки аскорбатом: в присутствии железам Происходилобыстрое падение амплитуды b-волны ЭЕЕ . и инициировалось перекисное окисление. липидов: (Doly et all, 1984);, а;, введение аллопуринола или оксипуринола,, ингибиторов? ксантиноксидазы;, приводило к существенному улучшению 3PF после ишемии (Peachey et al.,. 1993; Roth et al., 1997). Участие свободных радикалов в, патологических , изменениях при ишемии было впервые доказано/ в- .. модельных-: экспериментах, в которых введение крысам супероксиддисмутазы (СОД) после моделирования ишемии предотвращало; ишемические повреждения: в период реперфузии, включая гистологические изменения, И ИОННЫЙ: дисбаланс. Причем, оказалось, что свободный супероксид-анион: радикал образуется в таких количествах,.чтонормальноезндогенноеколичествоЄОД; в сетчатке не способно? защитить, ткань: от окислительного повреждения, вызываемого этим радикалом: (Szabo et al., 1991, 1992); Более поздние исследования подтвердили участие в .ишемическом повреждении сетчатки не только суперокисного радикала; но и перекиси водорода и гидроксильногс радикала (Nayaket а!., 1993; Ophiretal., 1993; VeriacetaK, 1993; Yamamoto et al., 1994; Zhang et al., 1995; Lewden etal., 1996; Muller et al., 1997; Rios et al., 1999; Baninetal., 2000).
Как известно,, образование свободнорадикальных форм кислорода приводит к значительным повреждениям клеток мозга через взаимодействие с ненасыщенными жирными кислотами клеточных мембран. В ходе этого процесса, называемого перекисным окислением липидов, происходит как повреждение самих мембран (снижение их вязкости) и набухание клеток, но и образуются дополнительные перекисные радикалы,, которые могут индуцировать развитие ишемических и постишемических (при реперфузии) повреждений (Banin et al., 2000; Shibuki et al., 2000; Celebi et al., 2002).
Активные формы кислорода могут вызывать и другие изменения клеточного метаболизма при ишемии, включая окисление сульфгидрильных групп белков, деструкцию аминокислот и полипептидных цепей белков, фрагментацию ДНК, изменение активности различных ферментов (Lipton, 1999).
При ишемии во внеклеточных и внутриклеточных средах мозга быстро снижается рН (Obrenovitch et al., 1990). Такое закисление (ацидоз) объясняется накоплением молочной кислоты, которое в. условиях недостаточного снабжения кислородом вызвано переключением метаболизма от окислительного фосфорилирования на анаэробный гликолиз. Например, показано, что через 10 минут тотальной ишемии мозга крысы внутриклеточный рН падал до 6,3, а содержание лактата увеличивалось в 10 раз (Shimizuet al. 1993). Ацидоз, вызванный накоплением лактата, усиливался при повышении внутриклеточной концентрации Na+ ([Na+]j) вследствие нарушения работы NaVH4" обменника.
Гистологические и иммуногистохимические методы
Гистологический метод. Исследования проводили на сетчатке глаз интактных и экспериментальных (после создания перечисленных выше моделей) крыс. Для гистологического исследования сетчатки крыс глаза энуклеировали после декапитации и фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 12 часов (и в дальнейшем использовали для приготовления парафиновых срезов согласно стандартному протоколу (Sennlaub F. et al., 2002).
После фиксации глаз ополаскивали проточной водой, разрезали по лимбу, удаляли роговицу, хрусталик и стекловидное тело. Полученный глазной бокал с сетчаткой промывали проточной водой в течение 10 минут для удаления формалина из тканей. Затем проводили обезвоживание глазного бокала в ряде этиловых спиртов с восходящей крепостью (от 70 до 100) и погружали его в парафин при 60С.
Для приготовления срезов из парафиновых блоков использовали санный микротом. Срезы толщиной 5 мкм снимали с ножа на дистиллированную воду, помещенную на предметное стекло с адгезивным покрытием (Silane-Prep Slides, Sigma). Расправления срезов добивались, нагревая стекла с плавающими на воде срезами на нагревательном столике при температуре 37-40С. После расправления срезов на стекле излишек воды (вокруг срезов) аккуратно удаляли фильтровальной бумагой и помещали предметные стекла в термостат при 37С на ночь.
Затем проводили депарафинирование и регидратацию срезов. В качестве растворителя парафина использовали орто-ксилол. Для регидратации применяли этанол нисходящей крепости (от 100 до 70). В каждой порции ксилола предметные стекла оставляли на 3-5 минут. Biспирты стекла помещали на 5-10 минут. Из 70 спирта предметные стекла переносили в дистиллированную воду на 5 (или более) минут. Затем срезы окрашивали сначала гематоксилином (Sigma), затем эозином.
После завершения окраски на срез наносили застывающий заключающий бальзам (Bio Mount, Sigma) и накрывали чистым покровным стеклом. В дальнейшем окрашенные срезы исследовали при помощи светового микроскопа (Axioskop 40, Zeiss). Иммуногистохимический метод. Исследования проводили на сетчатке глаз интактных и экспериментальных (после создания перечисленных выше моделей) крыс. Для иммуногистохимического исследования использовали стандартный метод приготовления парафиновых срезов до стадии окрашивания, описанный выше. Депарафинированные срезы обрабатывали методом TUNEL (Terminal desoxynucleotidyl transferase - mediated desoxyuridine triphosphate (UTP) — nick end — labeling) для выявления апоптотических клеток (набор реактивов «Apoptag» («Chemicon», США)). Метод основан на выявлении свободных 3 ОН концевых групп ДНК путем их химического мечения модифицированными нуклеотидами, которые выявляются иммунопероксидазным методом. В качестве субстрата для пероксидазы использовали диаминобензидин (DAB). После реакции для дополнительной прокраски ядер срезы обрабатывали 0,5% метиловым зеленым.
После завершения окраски на срез наносили застывающий заключающий бальзам (Bio Mount, Sigma) и накрывали чистым покровным стеклом. В дальнейшем окрашенные срезы исследовали при помощи светового микроскопа (Axioskop 40,1 Zeiss).
В работе использовали кроликов породы Шиншилла и крыс-самцов линии Wistar весом 200-250 г, содержавшихся в виварии при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище, по пять животных в клетке. Крыс после предварительной 24 часовой адаптации к темноте наркотизировали хлоралгидратом в дозе 250 мг/кг. Эксперименты проводили в темноте при слабом красном свете. Для регистрации ЭРГ крысам вводили два электрода подкожно (под скальп) и один электрод в виде золотой петли — непосредственно к роговице глаза. Перед началом эксперимента зрачок расширяли 1,0 % раствором мидриацила, в качестве местной анестезии использовали 0,5 % раствор дикаина. ЭРГ регистрировали с помощью установки EYE Handheld ERG Unit Mjolner (Ephios, Швеция). Выполняли регистрацию ганцфельд ЭРГ в ответ на одиночную стимуляцию и ритмическую (РЭРГ) - в ответ на стимуляцию импульсами с частотой 12 и 32 Гц стандартными вспышками.
Принцип метода заключается в регистрации потенциалов клеток сетчатки в ответ на освещение. Оценку электрической активности сетчатки проводили по амплитуде а- и Ь- волн ЭРГ. а-волна - негативная волна, отражающая функциональную активность фоторецепторов, b-волна -позитивная волна, отражающая электрическую активность биполяров и мюллеровских клеток с возможным вкладом горизонтальных и амакриновых клеток.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерных программ Microsoft Excel и Origin Pro 6.1 методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Достоверными считали различия при Р 0,05. На рисунках и в таблицах приведены среднеарифметические значения показателей, в качестве разброса экспериментальных данных указаны среднеквадратичные отклонения.
Регистрация электроретинограммы при ишемии сетчатки глаза кроликов
Известно, что ишемия сетчатки, вызванная недостаточным кровоснабжением через ретинальные сосуды, сопровождается характерными изменениями в картине фотоэлектрической активности сетчатки 51 электроретинограмме. Использование ЭРГ позволило оценить действие нитритов на ретинальные сосуды по изменению электрической реакции сетчатки глаза, то есть независимым методом. Измерение выполнялось сразу после лазерной коагуляции, после введения препарата на фоне лазерного воздействия и после лазерного воздействия на фоне предварительного введения нитрита натрия.
Лазерная коагуляция сосудов сетчатки приводила к резкому снижению амплитуд а- и Ь- волн ЭРГ (рис.6). Введение нитрита натрия в количестве 20 мг/кг массы через 15 минут после лазерной коагуляции приводило к более быстрому восстановлению а- и Ь- волн ЭРГ. Наибольший положительный эффект препарата был выявлен при его введении до создания лазерной ишемии сетчатки, где не наблюдалось угнетения биопотенциалов.
Глиальный индекс Кг, рассчитываемый по отношению амплитуд Ь-волны ЭРГ и РЭРГ (12 Гц), равнялся 1,8 при норме 2,3-2,5 относительных единиц: Известно, что возрастание глиального индекса, отражающее активизацию метаболизма клеток Мюллера, является характерным признаком ретинальной ишемии. Однако, при острых нарушениях кровообращения в бассейне центральной артерии сетчатки, b-волна ЭРГ быстрее реагирует на гипоксию сетчатки, связанную с сосудистой катастрофой, чем низкочастотная РЭРГ. Поэтому опережающее снижение амплитуды b-волны ЭРГ сразу после лазерной коагуляции сосудов приводит к снижению Кг. отражая значительные нарушения в сетчатке.
Таким образом, полученные двумя независимыми методами (ЭРГ и офтальмоскопия) результаты показывают, что введение нитритов экспериментальным животным защищает сетчатку от острой ишемии. Такое действие, по-видимому, обусловлено тем, что при недостатке кислорода in vivo нитрит натрия может восстанавливаться до оксида азота в концентрациях, достаточных для полного расслабления сосудов.
Модель ишемии сетчатки глаза на кроликах в некоторых экспериментах очень удобна, т.к. сосуды глаза хорошо видны, и для регистрации ЭРГ эти животные не требуют адаптации к темноте. Однако кровоснабжение сетчатки кролика отличается от кровоснабжения сетчатки человека. У кроликов 2/3 сетчатки питается от хориоидальных сосудов, которые снабжают наружные слои сетчатки. И всего 1/3 сетчатки питается от ретинальных сосудов, которые распадаются на капилляры в пределах ганглиозного слоя и слоя нервных волокон.
В то же время у человека, наоборот, только 1/3 сетчатки питается от хориоидальных сосудов и 2/3 - от ретинальных. Важно отметить, что основной причиной зрительных патологий человека является ишемия, вызванная нарушениями именно в ретинальных сосудах. Наиболее близким объектом является крыса, у которой кровоснабжение сетчатки осуществляется, как и у человека. Кроме того, сетчатка крысы является хорошо изученным гистологическим объектом, что позволяет использовать эту модель для применения гистологических и иммуногистохимических методов выявления апоптоза на ранних стадиях. Поэтому перед нами стояла задача разработать новую модель ишемии сетчатки глаза на крысах. Ишемию создавали при помощи лазерного воздействия именно на ретинальные сосуды, так же, как и в предыдущих экспериментах.
При офтальмоскопии сразу после лазерной коагуляции отмечалось резкое сужение магистральных сосудов с полной или почти полной остановкой кровотока, сохраняющейся на протяжении нескольких минут, после чего кровоток частично восстанавливался, но просвет сосуда оставался значительно суженным.
На следующий день после коагуляции на глазном дне у некоторых крыс наблюдалась стушеванность границ диска зрительного нерва из-за отека окружающей сетчатки, суженные артерии, местами до полной их непроходимости, кровоток в них становился прерывистым. Некоторое расширение вен, по-видимому, было обусловлено одновременным нарушением венозной гемодинамики в результате распространения коагулирующего действия лазерного излучения на стенку расположенного рядом магистрального венозного сосуда.
Через сутки после лазерной коагуляции в результате тромбоза магистральных ретинальных сосудов отмечались достаточно выраженные гемодинамические нарушения в ретинальной системе микроциркуляции, приводящие к ишемии внутренних слоев сетчатки. 3.2.2. Регистрация электроретинограммы при ишемии сетчатки глаза крыс
Стойкие гемодинамические нарушения в системе ретинального кровотока через сутки приводили к электрофизиологическим изменениям в сетчатке, характерным для ишемии. Для оценки степени развития ишемии сетчатки широко используется соотношение амплитуд Ь- и а- волн ЭРГ -индекс Ь/а (Нероев В.В. и др., 2004). а-волна ЭРГ характеризует функциональную активность фоторецепторных клеток, b-волна - внутренних слоев сетчатки, прежде всего, биполярных клеток. На следующий день после лазерной коагуляции сосудов амплитуда b-волны ЭРГ снижалась на 40-70% от исходных значений (рис. 8). Угнетение а-волны ЭРГ отмечалось через сутки не у всех животных. В тех случаях, когда амплитуда а-волны снижалась, угнетение b-волны было более значительным. Изменения Ь-волны развиваются, как правило, раньше угнетения а-волны и являются более выраженными из-за ухудшения трофики нейронов внутреннего ядерного слоя сетчатки при нарушениях ретинальной циркуляции. В нашем исследовании при развитии острой ишемии сетчатки коэффициент Ь/а резко снижался - до 1,0-2,0 отн. единиц при его нормальных значениях у крыс 3,3-4,8 ед.
