Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 8
1.1 Свойства оксида азота и его источники в организме 8
1.1.1 Синтез N0 в организме 8
1.1.2 Физико-химические свойства оксида азота 12
1.2 Функции оксида азота в нервной системе 20
1.2.1 Роль N0 в регуляции электрофизиологической активности нейронов и синаптической передаче 21
1.2.2 Роль N0 в регуляции внутриклеточных процессов 22
1.2.3 Роль N0 в регуляции межклеточных взаимодействий 25
1.2.4 Нейрозащитные и нейродеструктивные свойства N0 27
1.2.5 Роль N0 в нервной системе беспозвоночных животных 27
1.3 Роль N0 в регуляции переноса кислорода эритроцитами 28
1.3.1 Действие N0 на сосуды 29
1.3.2 Взаимодействие N0 с гемоглобином эритроцитов 30
2 Цели и задачи исследования 35
3 Материалы и методы 36
3.1 Приготовление препаратов. Растворы и реактивы 36
3.1.1 Приготовление препаратов нервной системы пиявки 36
3.1.2 Приготовление препаратов нервной системы прудовика 38
3.1.3 Приготовление препаратов миелиновых нервных волокон 38
3.1.4 Доноры оксида азота 39
3.1.5 Создание церебральной ишемии и постишемической реперфузии у крыс 41
3.2 Регистрация активности одиночных ионных каналов 41
3.3 Регистрация электрофизиологических характеристик нервных волокон . 43
3.4 Микрофлуориметрические исследования свойств нейронов 43
3.4.1 Регистрация изменений количества Са2+, связанного на плазматической мембране и во внутриклеточных компартментах 44
3.4.2 Регистрация изменений потенциала внутренней мембраны митохондрий нейронов 45
3.4.3 Регистрация изменений содержания окисленных флавопротеинов в нейронах 45
3.4.4 Математическая обработка результатов флуоресцентных исследований 46
3.5 Метод конфокальной лазерной сканирующей микроскопии 47
3.6 Регистрация спектров поглощения нейронов 48
3.7 Метод спектроскопии комбинационного рассеяния 48
3.7.1 Применение спектроскопии РКР для исследования микровязкости клеточных мембран 49
3.7.2 Применение спектроскопии КР для исследования конформации гемо-порфирина гемоглобина и 02-связывающих свойств гемоглобина 51
3.8 Метод лазерной интерференционной микроскопии и вейвлет-анализ 57
3.8.1 Применение лазерной интерференционной микроскопии для исследования интегральных свойств плазматической мембраны и цитоплазмы нейронов 57
3.8.2 Анализ динамики локальных значений показателя
преломления нейронов 60
3.9 Метод электронного парамагнитного резонанса 63
4 Результаты исследования и обсуждение 65
4.1 Влияние оксида азота на свойства плазматической мембраны нейронов и нерв
ных волокон 65
4.1.1 Действие N0 на активность потенциалзависимых К+-каналов нейронов 65
4.1.2 Действие N0 на электрофизиологические характеристики нервных волокон 67
4.1.3 Перераспределение Са2+, связанного на плазматической мембране нейронов и нервных волокон при действии N0 70
4.1.4 Действие N0 на микровязкость плазматической мембраны нервных волокон 73
4.2 Действие оксида азота на функциональное состояние внутриклеточных органоидов нейронов 75
4.2.1 Влияние N0 на потенциал внутренней мембраны митохондрий нейронов и содержание окисленных/восстановленных флавопротеинов 75
4.2.2 Локальные изменения потенциала внутренней мембраны митохондрий нейронов при действии N0 80
4.2.3 Изменение содержания Са2+, связанного во внутриклеточных компарт- ментах, и вязкости мембраны цитосом нейронов при действии N0 83
4.3 Действие оксида азота на оптические свойства нейронов 88
4.3.1 Влияние N0 на изменения показателя преломления нейронов в примем-бранной области 88
4.3.2 Влияние N0 на локальные изменения показателя преломления нейронов в области цитоплазмы 90
4.3 3 Анализ характерных частот динамики показателя преломления нейронов 96
4.4 Действие оксида азота на свойства эритроцитов 101
4.4.1 Влияние доноров N0 на кислород-связывающие свойства гемоглобина и микровязкость плазматической мембраны эритроцитов 103
4.4.2 Изменение кислород-связывающих свойств гемоглобина и вязкости плазматической мембраны эритроцитов при церебральной ишемии и по-стишемической реперфузии у крыс 106
5 Заключение 113
6 Выводы 117
Литература
- Физико-химические свойства оксида азота
- Приготовление препаратов нервной системы пиявки
- Действие N0 на активность потенциалзависимых К+-каналов нейронов
- Влияние N0 на потенциал внутренней мембраны митохондрий нейронов и содержание окисленных/восстановленных флавопротеинов
Введение к работе
Оксид азота (II) (N0) является важной регуляторной внутри-и межклеточной сигнальной молекулой в нервной системе. Характерной особенностью N0 является взаимодействие с различными молекулами и влияние на многочисленные процессы, протекающие на плазматической мембране и в цитоплазме клеток. Действие N0 осуществляется по двум механизмам: опосредованно через активацию растворимой гуанилатциклазы и синтез ц-ГМФ, а также при непосредственном взаимодействии N0 с тиолами, отрицательно заряженными группами белков и липидов, гемопорфиринами, аминами, ароматическими соединениями и железо-серными (РегЭг) кластерами [1-3]. В зависимости от условий (концентрации и длительности действия N0, отдела нервной системы, типа клеток и содержания глутатиона) N0 обладает как регуляторным, так и токсическим действиями [4-7]. Влияние N0 на клетки связывают, в первую очередь, с изменениями электрофизиологической активности и энергообеспечения нейронов за счет взаимодействия N0 с белками плазматической и митохондриальной мембран [8-Ю].
Показано, что изменение электрической активности нейронов под влиянием N0 связано с его действием на ионные каналы и рецепторы плазматической мембраны. Известно, что N0 активирует Ка+-каналы постоянного тока, вызывая деполяризацию нейронов, а с другой стороны, инактивирует NMDA-рецепторы глутамата, уменьшая вход Са2+ в нейроны и ингибируя синаптическую передачу [11, 12]. При этом, недостаточно исследовано влияние N0 на потенциалзависимые К+-каналы нейронов, играющие основную роль в формировании мембранного потенциала и участвующие в проведении нервного импульса, а также действие N0 на интегральные свойства клеточных мембран (микровязкость и поверхностный заряд), связанные с активностью мембранных белков. В митохондриях N0 реагирует с тиоловыми группами и железо-серными кластерами в комплексах I-IV дыхательной цепи и аконитазе цикла Кребса, что приводит к ингибированию этих ферментных комплексов [13, 14]. Однако, влияние N0 на энергетическое состояние митохондрий в изолированных нейронах и препаратах с сохраненными межклеточными связями практически не исследовано.
N0, образующийся при повышенной нейрональной активности и гипоксии, выходит в кровеносное русло, связывается с гемоглобином и переносится в другие ткани [15, 16]. Предполагается, что N0 усиливает кислородоснабжение тканей без увеличения просвета сосудов [17], при этом механизм действия N0 на кислород-связывающие свойства гемоглобина и эффективность выделения Ог в тканях остается мало изученным.
Большинство исследований механизмов действия N0 проводится на выделенных мембранных фрагментах и изолированных нейронах и сосредоточено на одном или нескольких процессах. Однако, поскольку N0 влияет на совокупность взаимосвязанных процессов, протекающих на плазматической мембране и в цитоплазме нейронов, необходим комплексный подход, заключающийся в изучении влияния N0 на разные клеточные компартменты и структуры в нативной системе.
В связи с этим, в представленной работе было изучено действие N0 на интегральные свойства плазматической мембраны (активность потенциалзависимых каналов, количество мембраносвязанных ионов и вязкость мембраны), влияющие на электрическую активность нейронов, функционирование митохондрий, определяющее энергообеспечение клеток, и свойства внутриклеточных мембран. Исследования были выполнены на препаратах с сохраненными межклеточными связями, а также на изолированных нейронах и нервных волокнах.
Физико-химические свойства оксида азота
Впервые участие оксида азота в регуляции клеточных процессов было открыто в сердечно-сосудистой системе. Еще до того, как показали эндогенное происхождение N0, было установлено, что N0 и его доноры (нитроглицерин и нитропруссид натрия) вызывают расслабление артериальных и бронхиолярных гладких мышц [18]. После этого было доказано, что найденный раннее так называемый фактор релаксации сосудов, вызывающий расширение сосудов, опосредованное действием циклического гуанозин-3 ,5 -монофосфата (ц-ГМФ), представляет собой N0 [1, 19, 20J. После этого было установлено, что в эндотелии сосудов и других тканях существует ферментативный синтез N0, и показано, что существует два механизма действия N0 на клеточные структуры: прямой и с активацией фермента растворимой гуанилатциклазы (р-ГЦ) [3, 21, 22]. В первом случае происходит непосредственное взаимодействие N0 и молекулы-мишени, во втором случае N0 активирует р-ГЦ, что приводит к синтезу ц-ГМФ, активации протеинкиназы G и фосфорилированию белков [22].
Синтез N0 при участии специальных ферментов Оксид азота синтезируется из аминокислоты аргинина при помощи фермента N0-синтазы. В организме млекопитающих существуют три изоформы этого фермента, названные по местам их обнаружения: нейрональная (n-NOS или N0S-1), эндотелиальная (е-NOS или N0S-3) и индуцибельная (i-NOS, N0S-2 или Са2+-независимая) [23, 24]. Во всех трех случаях ферменты представляют собой гомодимеры, для работы которых необходимы кофакторы НАДФН, ФАДН, ФМН, протопорфирин IX и тетрагидробиоптерин (ТБ) [24].
Первые два изофермента постоянно присутствуют в клетках (отчего получили назва-ние«конститутивных» и активируются под действием Са2+-кальмодулина [25]. Нейрональная NO-синтаза экспрессируется в нейронах и астроцитах мозжечка, обонятельной луковице, коре полушарий, полосатом ядре и гиппокампе [5, 26], кроме того, она обнаружена в сердечных и гладких мышцах [27]. Эндотелиальная NO-синтаза, кроме клеток эндотелия, присутствует в астроцитах и некоторых нейронах, гладких и сердечных мышцах [26, 28, 29]. Индуцибель-ная NO-синтаза экспрессируется только при воздействии на клетку, из-за чего и получила свое название. В ее состав постоянно входит кальмодулин, поэтому для активации i-NOS необходимо связывание кальмодулина с Са2+. Впервые индуцибельная NO-синтаза была описана для макрофагов и нейтрофилов, однако почти все клетки способны ее синтезировать при появлении большого количества активных форм кислорода и иммунном ответе [30]. Конститутивные изоформы фермента продуцируют N0 в концентрации 10 9-10-10 моль/л, в то время, как индуцибельная NO-синтаза может производить N0 на 3-4 порядка больше, что связано с защитной функцией фермента. Так, при бактериальной инфекции в макрофагах экспрессируется i-NOS и синтезируется N0, который диффундирует из клетки и взаимодействует с анион-радикалом кислорода 0 , в результате чего образуется пероксинитрит 0N00"", разрушающий микроорганизмы. В нервной системе i-NOS индуцируется липополи-сахаридами и 7-интерфероном в клетках микроглии и астроцитах [30, 31].
В геноме человека ген каждой изоформы представлен единичной копией. Следует отметить, что n-NOS — самый сложный ген млекопитающих: у него есть 11 промоторов, по три сайта для полиметилирования и терминации транскрипции и более 20 вариантов альтернативного сплайсинга. Кроме того, в отличие от других изоформ, нейрональная синтаза на N-конце имеет сайт для связывания с другими белками [23]. В структуре NO-синтаз выделяют два домена: редуктазный (на С-конце) и оксидазный (на N-конце). На первом связываются ФАД, ФМН, Са2+-кальмодулин и подвергается окислению НАДФН, на втором связываются протопорфирин и тетрагидробиоптерин и осуществляется синтез N0 из аргинина. На рис. 1.1 приводится общая схема строения NO-синтаз с потоком электронов от редуктазного домена к оксидазному. N0 синтезируется из терминального азота гуанидиновой группы аргинина. Предварительно к азоту присоединяется кислород Ог и образуется промежуточный продукт Nw-гидрокси-аргинин [32]. Далее по неизвестному механизму отщепляется N0 и остается аминокислота цитруллин. Побочным продуктом может быть супероксид-радикал: кислород «перехватывает» электрон с флавинов и образуется О . При больших концентрациях кислорода эта реакция из побочной может становиться основной.
Приготовление препаратов нервной системы пиявки
В экспериментах с нервными клетками и волокнами использовали доноры NO нитропруссид натрия (НП) и спермин-NONOaT (спермин/NO) (Sigma) [128, 129]. НП (Na2[Fe(CN)5NO]-2H20) (ММ=298 г/моль) представляет собой комплексную NO-содержащую соль, производную от феррицианида натрия (Na3[Fe(CN)6]). В водном растворе НП распадается с выделением молекулы NO, после чего возможно образование свободных ионов CN": Na2[Fe(CN)5NO] — 2Na+ + Fe(CN)2,- + NO; Fe(CN)2" — Fe3+ + 5CN" При выделении NO из НП возможно взаимодействие NO с Fe2+: Fe3+ + NO — Fe2+ + NO+, и, таким образом, НП является донором свободнорадикальной и окисленной форм NO. В контрольных экспериментах на действие NO использовали феррицианид натрия Na3[Fe(CN)6] (ММ=281 г/моль) (Sigma), чтобы показать, что действующим веществом НП является NO, а не другие продукты распада (ионы Fe2+ или CN"). Кроме того, в ряде работ [13, 130] было исследовано действие феррицианида натрия на клеточное дыхание и показано, что Na3[Fe(CN)6] и продукты его распада не оказывают влияние продукцию АТФ и выживание клеток.
Спермин/NO (ММ=262,35 г/моль) в водном растворе распадается с выделением свободнорадикальной формы NO и не образует катионную форму. В контрольных экспериментах использовали невыделяющий NO сульфо-NONOaT натрия (ММ=186,06 г/моль) (Sigma), яляющийся контролем для всех NONO-атных доноров (рис. 3.2). Растворы доноров NO и их контрольных веществ готовили на физиологических растворах, соответствующих используемому объекту. Концентрации NO, образующиеся из используемых доноров, определяли при помощи NO-селективного электрода ISO-NOPMC и анализатора Apollo 4000 Free Radical Analyzer (WRI, USA) [82]. Было показано, что в HEPES-содержащем физиологическом растворе при рН 7,4 выделение NO начинается сразу после внесения доноров, через 3-6 мин достигает стационарного значения, которое не меняется в течение 60-90 мин для всех исследуемых концентраций спермин/NO и НП. На рис. 3.3 представлены зависимости стационарных концентраций NO, образующегося из НП и спермин/NO, от концентрации доноров
Зависимость стационарных концентраций образующегося N0 от концентраций нитропрус-сида натрия и спермин-NONOaTa. По оси ординат — концентрация NO, нмоль/л, по оси абсцисс — концентрация доноров, моль/л. А —НП, о — спермин/NO
Получено, что НП, в зависимости от концентрации, выделяет 26-444 нмоль/л NO, а спермин/NO — 57-700 нМ N0. Указанные концентрации N0 оставались постоянными в течение эксперимента и соответствовали установленным концентрациям N0 в нервной системе пиявки [ПО], а также не превышали содержание N0, образующегося в мозге млекопитающих при ишемии [131].
В экспериментах по исследованию действия N0 на свойства эритроцитов при внутривенном введении доноров N0 использовали медицинский препарат изокет (действующее вещество — изосорбид динитрат СбН8 08 (ММ=23б,14 г/моль) в концентрации 0,1 %, приготовленный на 0,9 % растворе NaCl, производство Schwarz Pharma AG) и тетранитрозиль-ный комплекс железаТНКЖ (Nsfc OaMNO l BbO (ММ=574 г/моль)). Нарис. 3.2. В приводится структурная формула изосорбида динитрата. В организме изосорбид динитрат (период полувыведения изосорбида динитрата из организма составляет около 20 мин, период полураспада — 1ч) при участии глутатион-Э-трансферазы распадается с выделением N0 и образованием метаболитов изосорбида-5-мононитрата (период полувыведения — 5 ч) или изосорбида-2-мононитрата (период полувыведения —2,5 ч). Изособиды мононитраты также распадаются с выделением N0. Внутривенное введение кролику изокета осуществляли со скоростью 10 мкл/мин в течение 30 мин при помощи шприцевого насоса через катетер в краевой ушной вене. В экспериментах in vitro изокет вносили в количестве 3 мкл на 2 мл раствора крови (кровыраствор Алена=1:3).
ТНКЖ, аналог динитрозильного комплекса железа (раздел 1.1.2), является экспериментальным препаратом, находящимся в стадии испытаний. Препарат получали из Института клинической кардиологии им. А. Л. Мясникова Кардиологического научно-практического центра РАМН. В сухом виде в запаянной ампуле хранится неограниченно долго, в водном растворе за 24 мин полностью распадается с выделением N0. При добавлении к раствору ТНКЖ тиосульфата натрия ( гЭгОз) в соотношении 1:5 ТНКЖ разлагается значительно медленнее и выделяет N0 в течение суток. При внутривенном введении препарата кролику использовали следующее разведение: 3,25 мг ТНКЖ + 50 мкл тиосульфата натрия + физиологический раствор (0,9 % раствор NaCl) до общего объема в 1 мл. Скорость введения препарата — 30 мкл/мин в течение 30 мин. В контрольных экспериментах кроликам вводили 0,9 % раствор NaCl со скоростью 30 мкл/мин в течение 30 мин.
В опытах были использованы самцы белых беспородных крыс массой 272 +11 г. Животных разделили на три группы: (1) контрольные ложнооперированные (п=10), (2) крысы с ишемией мозга (п=10) и (3) с постишемической реперфузией (п=7). За сутки до эксперимента у животных под наркозом (хлоралгидрат, 350 мг/кг) под обе общие сонные артерии подводили леску (0,3 мм), которую затем выводили под кожей через полиэтиленовые трубки в межлопаточной области. Через сутки у бодрствующих крыс групп 2 и 3 создавали одномоментную полную окклюзию общих сонных артерий, втягивая их леской в трубки на два часа. Постишемическую реперфузию вызывали у крыс группы 3 через 2 часа ишемии путем освобождения артерий [132].
Действие N0 на активность потенциалзависимых К+-каналов нейронов
Потенциалзависимые К+-каналы играют основную роль в поддержании потенциала покоя и проведении нервного импульса. При этом, действие N0 на данный тип каналов в нервных клетках остается малоизученным.
В ходе исследования нами было показано, что N0 активирует Ку-каналы Rz-нейронов через 1-4 мин после внесения НП (Ю-4 моль/л) (п=7). Наблюдалось увеличение вероятности нахождения канала в открытом состоянии и, соответственно, уменьшение вероятности закрытого состояния (п=7) (рис. 4.1). Через 10-12 мин после внесения НП активность канала стабилизировалась.
Замена раствора приводила к частичному восстановлению активности канала: уменьшению вероятности открытого состояния и увеличению вероятности закрытого состояния. При использовании данного метода (пэтч-клямп в конфигурации «inside-out») действие N0 на канал связано с непосредственным действием оксида азота на группы канала и/или модификацией белок-липидных взаимодействий, влияющих на активность канала. По всей ви
Изменение вероятности открытого (Л) и закрытого (о) состояния Ку-канала при действии нитропруссида натрия (Ю-4 моль/л). Внесение НП и замена раствора указаны стрелками вниз и вверх соответственно. По оси ординат —вероятность состояния; по оси абсцисс —время, мин. Данные приводятся как среднее ± С.О.С. димости, активация канала вызвана взаимодействием иона нитрозония NO+ с SH-группами белка, приводящим к образованию нитрозотиолов и, затем, S-S связей между цистеинами канала. Предположение об активации Ку-канала в результате S-нитрозилирования подтверждается данными, полученными на гладких мышцах: активация быстрых и медленных К+-каналов мышечных клеток не происходит при предварительной обработке мембраны пэтча реагентами, окисляющими SH-группы [170]. Также известно, что рианодиновые рецепторы эндоплазматического ретикулума активируются при поли-Э-нитрозилировании [55].
Ранее в группе Казаченко В.Н. было показано, что феррицианид натрия вызывает организацию протомеров деградировавшего К+-канала в единый канал, что приводит к увеличению тока через мембрану [171]. Однако это действие проявлялось при концентрациях ферриацианида более Ю-3 моль/л через 20 минут после внесения в реакционную среду и не исчезало после замены раствора. В наших экспериментах действие НП начиналось через несколько минут после внесения при концентрации Ю-4 моль/л и частично убиралось при замене раствора. Таким образом, влияние НП на активность канала связано с выделением N0, а не других компонентов НП.
NO-зависимая активация К+-каналов может вызывать гиперполяризацию плазматической мембраны, что будет приводить к различным эффектам в изменении электрофизиологической активности в зависимости от типа нейронов. Так, в клетках со спонтанной ритмической активностью (в том числе, в Rz-клетках) ускорение реполяризации мембраны после ПД (вследствие активации К+-каналов) облегчает генерацию следующего ПД [172]. Ранее в ряде работ было показано, что N0 приводит к увеличению частоты спонтанной генерации ПД [88, 90] и было предположено, что наблюдаемый эффект связан с (а) ц-ГМФ-опосредованной активацией Кс-каналов, отвечающих за фазу реполяризации ПД и (б) с активацией №+-каналов постоянного тока. Действительно, авторы [12] обнаружили, что NO активирует Ка+-каналы постоянного тока, которые, как известно, присутствуют в мембране Rz-нейронов [173]. В данной работе было получено, что возможен и механизм (а), связанный с NO-индуцированной активацией Ку-каналов.
В нейронах без спонтанной ритмической активности и аксонах активация К+-каналов может быть причиной гиперполяризации мембраны и уменьшения возбудимости.
Действие NO на электрофизиологические характеристики нервных волокон Для определения влияния NO на нервные волокна были проведены эксперименты по регистрации действия NO на электрофизиологические характеристики миелиновых нервов. Эксперименты данной серии проводили в режиме максимального возбуждения, при котором активны все волокна, входящие в состав нервного волокна и изменения в активности нерва связаны с мембранными и цитоплазматическими процессами в аксонах и Шванновских клетках.
Нами было показано, что инкубация нерва в растворе НП приводит к уменьшению амплитуды и скорости проведения ПД с концентрационной зависимостью (при каждой концентрации НП число экспериментов п=7) (рис. 4.2 и 4.3).
Через 7 мин инкубации уменьшение амплитуды ПД наблюдалось при всех используемых концентрациях НП, а через 15 мин этот эффект был более выраженным для меньших концентраций донора (Ю-6 и 10 5 моль/л). После 60 мин инкубации происходило восстановление амплитуды ПД при концентрациях НП 10 6 и 10 5 моль/л (рис. 4.2. А) и падение амплитуды ПД при концентрациях 10 4 и Ю-3 моль/л (рис. 4.2. Б). Замена раствора НП на чистый раствор Рингера приводила к восстановлению амплитуды ПД. Уменьшение амплитуды ПД и возбудимости нерва может быть вызвано NO-индуцированной активацией К+-каналов и гиперполяризацией плазматической мембраны. Кроме того, S-нитрозилирование белковых групп плазматической мембраны аксона и миелина также может вызывать уменьшение возбудимости нервного волокна, поскольку известно, что проведение ритмического возбуждения сопровождается увеличением числа SH-групп в нерве, а вещества, модифицирующие тиоловые группы, могут приводить к падению амплитуды ПД [174].
Скорость проведения ПД уменьшалась только при концентрациях Ю-4 и 10 3 моль/л на 60-ой мин инкубации, во всех остальных случаях достоверных изменений не было (рис. 4.3). Падение скорости проведения ПД отражает изменение в структуре миелина: его разрыхление и уменьшение длины межперехватных участков. Происходящее при этом обнажение паранодальных участков может приводить к активации дополнительных К+-каналов аксонов, гиперполяризации мембраны и еще большему падению амплитуды ПД [175]. По всей видимости, с этим связано уменьшение амплитуды ПД, происходящее на 60-ой мин инкубации при концентрациях НП Ю-4 и Ю-3 моль/л (рис. 4.2). Незначительные изменения в скорости проведения ПД могут быть связаны с тем, что NO не оказывает существенного влияния на структуру миелина и функционирование Шванновской клетки. С одной стороны, миелин —это гидрофобная область, в которой происходит накопление NO [10, 79] и, следовательно, увеличивается вероятность взаимодействия NO с компонентами миелина, с другой стороны, миелин обладает особой многослойной компактной структурой, препятствующими сильным морфологическим изменениям, и таким образом, выступает в качестве «буфера» для NO и защищает аксоны и тело Шванновской клетки от нитрозильного стресса [10]. По всей видимости, структура миелина, функционирование Шванновской клетки и зависящая от них скорость проведения ПД изменяются при более длительной инкубации нерва в растворе донора NO, чем свойства аксонов и амплитуда ПД. NO-индуцированное падение амплитуды
Влияние N0 на потенциал внутренней мембраны митохондрий нейронов и содержание окисленных/восстановленных флавопротеинов
Мы предполагаем, что деполяризация митохондрий происходит вследствие взаимодействия N0 с комплексами дыхательной цепи и последующего ингибирования переноса электронов в ЭТЦ. Разный по времени эффект НП и спермин/NO может быть связан с разными формами оксида азота (N0+ и N0), образующимися из используемых доноров, а также разным временем поступления форм N0 в цитоплазму нейронов и разным соотношением концентраций форм N0 в цитоплазме и, соответственно, митохондриях. Свободнорадикаль-ная форма N0 , выделяющаяся из спермин/NO и НП, диффундирует в цитоплазму клеток и проникает в митохондрии. Катионная форма N0+, образующаяся из НП, по всей видимости, переносится в цитоплазму в результате «эстафетного» нитрозилирования белков плазматической мембраны и цитоплазмы, а также низкомолекулярных тиолов, в первую очередь, глутатиона [79]. В цитоплазме может происходить выделение N0+ из его цитоплазматиче-ских переносчиков или белков плазматической мембраны с последующим взаимодействием с белками митохондрий. Поскольку известно, что к действию N0 наиболее чувствительным комплексом ЭТЦ митохондрий является цитохром-с-оксидаза (комплекс IV) [14], а к действию N0+ —NADH-убихинон-оксидоредуктаза (комплекс I) [7], то можно ожидать, что разное соотношение концентраций N0+ и N0 будет приводить к разным по длительности, степени и обратимости ингибированию ЭТЦ и деполяризации митохондрий.
NO-индуцированное нарушение функционирования комплексов ЭТЦ и образование свободно-радикальных форм кислорода, а также пероксинитрита (0N00 ) могут быть причиной образования неселективной проницаемой поры во внутренней мембране митохондрий [178]. Необходимым компонентом поры является циклофилин D (митохондриальная изо-форма пептидил-пролил-цис-транс-изомеразы циклофилин-шаперонового семейства) [179]. Циклоспорин А, взаимодействуя с циклофилином D, ингибирует образование неселективной поры, вызванное окислительным стрессом (179]. В наших экспериментах предваритель ная инкубация ганглиев в растворе циклоспорина А (2х10_6 моль/л) в течение одного часа и последующее внесение циклоспорина А в среду с ганглиями предотвращали увеличение I/Io(Rhl23), вызванное НП (рис. 4.8. В, табл. 4.2). Полученные результаты можно объяснить следующим образом. Оксид азота (обе его формы —NO и NO+) ингибирует комплексы ЭТЦ и вызывает образование О J и ONOO", в результате чего образуется неселективная пора во внутренней митохондриальной мембране. Последующее уменьшение ДФт связано как с ингибированием переноса электронов в ЭТЦ, так и с поступлением протонов Н+ через пору в матрикс митохондрий. Блокирование поры циклоспорином А сопровождается восстановлением ДФт за счет работы FoFi-АТФ-синтетазы (комплекса V) в «обратной моде»: поддержанием ДФт за счет выкачивания протонов из митохондриального матрикса при расщеплении АТФ.
На изолированных митохондриальных мембранных фрагментах было показано, что, кроме комплексов I и IV, оксид азота может взаимодействовать с убихиноном, а также РегЭг-кластерами комплексов II (сукцинат-дегидрогеназой) и III (убихинон-цитохром с-оксидоредуктазой) [9, 30]. Таким образом, падение АФт может быть вызвано действием N0 на любом из участков ЭТЦ. Для того, чтобы подробнее исследовать действие N0 на дыхательную цепь митохондрий в полунативной системе, было изучено действие доноров N0 на содержание окисленных/восстановленных флавопротеинов митохондрий Rz-нейронов в изолированном ганглие.
В предварительных экспериментах нами было установлено, что сигнал автофлуоресценции, зависящий от содержания ФАД+ в митохондриях, связан с функциональным состоянием сукцинат-дегидрогеназы —фермента ЭТЦ митохондрий и цикла Кребса, содержащий ФАДНг и ФАД+. Интенсивность автофлуоресценции Rz-нейронов увеличивалась при действии конкурентного обратимого ингибитора сукцинат-дегидрогеназы малоната натрия (3 х Ю-2 моль/л), что свидетельствует об увеличении относительного содержания ФАД+ в митохондриях (рис. 4.9). Малонат натрия ингибирует окисление сукцината до фумарата, сопряженное с восстановлением ФАД+ до ФАД Н2 (рис. 4.10). В результате этого происходит накопление ФАД+ и увеличение соотношения концентраций ФАД+/ФАДН2. Удаление малоната из среды при замене раствора приводит к уменьшению соотношения ФАД+/ФАДН2, что говорит о восстановлении функционирования сукцинат-дегидрогеназы.
Было получено, НП и спермин/NO при концентрации Ю-3 моль/л приводят к обратимому уменьшению интенсивности автофлуоресценции Rz-нейронов в ганглии (79,3±4,8 %, п=7 для НП и 83,8±3,9%, п=7 для спермин/NO ), что свидетельствует об уменьшении соотношения ФАД+/ФАД Нг и увеличении относительного количества восстановленных фла-вопротеидов в нейроне (рис. 4.11. А, Б). Оба донора N0 при меньших концентрациях (10 5 и 10"4 моль/л) не влияли на соотношение ФАД+/ФАДН2. Восстановление исходного уров = 0.8
Схема действия NO и малоната натрия на сукцинат-дегидрогеназу (комплекс II) в элек-тронтранспортной цепи митохондрий. I, II, III и IV —комплексы дыхательной цепи, Q —убихинон, с —цитохром с. Малонат натрия связывается с активным центром комплекса И, осуществляющим окисление сукцината до фумарата, и ингибирует его; NO окисляет Fe2+ в железо-серном кластере комплекса и препятствует переносу электрона с РегЭг-кластера на убихинон. ня автофлуоресценции происходило без замены раствора и удаления доноров из среды с ганглием. Феррицианид натрия и сульфо-NONOaT натрия не влияли на интенсивность автофлуоресценции нейронов. Обобщенные данные по действию доноров N0 на соотношение ФАД+/ФАДНг в митохондриях Rz-нейронов приводятся в таблице 4.3.
Для того, чтобы установить, связано ли NO-индуцированное уменьшение соотношения ФАД+/ФАД Н2 с изменением функционального состояния сукцинат-дегидрогеназы, ганглии перед экспериментом инкубировали в растворе малоната натрия (3 х Ю-2 моль/л) в течение 30 мин, чтобы достичь стационарного ингибирования сукцинат-дегидрогеназы. Последующее внесение НП (Ю-3 моль/л) на фоне малоната натрия практически не изменяло интенсивность автофлуоресценции (рис. 4.12) и, следовательно, не влияло на соотношение ФАД+/ФАДН2. Это свидетельствует о том, что наблюдаемое в предыдущих экспериментах NO-индуцированное уменьшение соотношения концентраций окисленных/восстановленных флавопротеинов связано с функционированием сукцинат-дегидрогеназы. При замене раствора на чистый раствор Рингера происходило уменьшение интенсивности автофлуоресценции (рис. 4.12), следовательно, удаление малоната натрия из среды восстанавливало активность сукцинат-дегидрогеназы, а также приводило к тому, что проявлялось действие N0, выделившегося из НП перед заменой раствора и диффундировавшего в цитоплазму клеток. Накопление ФАД Нг в сукцинат-дегидрогеназе при действии N0 связано с тем, что N0 ингибирует перенос электронов в дыхательной цепи митохондрий на одной или нескольких стадиях: комплекс II — убихинон — комплекс III — комплекс IV (рис. 4.10). При ингибировании только комплекса I электроны бы поступали в дыхательную цепь от сукцинат-дегидрогеназы (комплеса II) и соотношение ФАД+/ФАД Н2 не уменьшалось. Восстановление автофлуоресценции при действии доноров N0 связано с увеличением соотношения ФАД+/ФАДНг и накоплением окисленных флавопротеинов. Это может быть вызвано: (1) восстановлением поступления электронов с сукцинат-дегидрогеназы в ЭТЦ митохондрий или (2) инактивацией Fe2.S2-coдepжaщeй аконитазы и, таким образом, ингибированием цикла Кребса.
