Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ПРОСТАГЛАНДОНЫ И ЦИКЛИЧЕСКИЕ НУКЛЕОТИДЫ В РАСТЕНИЯХ 6
1.1. Структура простагландинов и их регуляторное действие 6
1.2. Некоторые данные о физико-химических свойствах ПАВ .:. 15
1.3. Система цАМФ в растениях 19
1.4. Цели и задачи исследования 26
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 28
2.1. Объект исследования 28
2.2. Регистрация электрических параметров мембраны ..29
2.3. Препараты и схема электрофизиологических опытов 33
2.4. Измерение поверхностной активности испытуемых соединений 36
2.5. Определение уровня цАМФ в цитоплазме клеток....39
ГЛАВА 3. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 41
3.1. Равновесие. Стационарные характеристики 41
3.2. Кинетика 49
3.3. Обработка данных 54
ГЛАВА 4. ДЕЙСТВИЕ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА ЭЛЕКТГОДШУЗИОННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРОТОПЛАЗМАТИЧЕСК0Й МЕМБРАНЫ 57
4.1. Сдвиги электрических параметров мембраны, индуцируемые ПАВ 57
4.2. Модификация транспортных характеристик мембраны при обработке клетки ПАВ 61
4.3. Сравнение используемых подходов для предсказания сдвигов ионной проницаемости мемб
раны. 64
ГЛАВА 5. МЕХАНИЗМ МЕМБРАНОТРОПНОГО ДЕЙСТВИЯ 72
5.1. Стационарные сдвиги ионной проницаемости мембраны на действие простагландинов 72
5.2. Кинетические характеристики мембранотропного действия отдельных испытуемых соединений. 86
5.3. Поверхностная активность и мембранотропное действие простагландино в 94
5.4. К вопросу опосредованного действия простаглан-динов 105
5.5. Комбинированное действие некоторых аналогов простагландино в 112
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 117
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОД* 120
ЛИТЕРАТУРА 122
- Структура простагландинов и их регуляторное действие
- Регистрация электрических параметров мембраны
- Кинетика
- Сдвиги электрических параметров мембраны, индуцируемые ПАВ
- Стационарные сдвиги ионной проницаемости мембраны на действие простагландинов
Введение к работе
Одной из важнейших черт живого организма является упорядоченность и согласованность разнообразных реакций, которая может обеспечиваться только за счет их эффективной регуляции. Сюда несомненно относится и координация обмена веществ между клеткой и окружающей средой в изменяющихся условиях.
В этой связи особый интерес представляет изучение процесса внутриклеточной химической регуляции - одного из актуальнейших вопросов современной биологии. Вскрытие основных закономерностей действия природных биорегуляторов на различные клеточные структуры и наступающих в результате этого сдвигов проницаемости мембран к основным физиологическим ионам должно основываться, в первую очередь, на анализе характера первичных событий, происходящих при действии эффектора на мембранные' структуры. В этом процессе велика роль протоплазматических мембран, регулирующих минеральный обмен в системе клетка - среда, и поддерживающих гомеостаз растительного организма вцелом.
В последние годы в растениях обнаружен ряд новых физиологически активных соединений, например, простагландины (или вещества близкие к ним по своей природе) /II, 63, 74 и др./, лектины /10, 109 /, стероиды /97, 164 и др./. Если последние довольно интенсивно исследуются, то современные сведения о функциональной роли простагландинов (ПГ) в растениях весьма малочисленны и фрагментарны, а механизмы, индуцируемых ПГ , мембранотропных эффектов практически не изучались. Известно, что в животных тканях действие простагландинов в значительной степени, опосредовано через систему цАМФ, функциональная роль которого и в растениях также до настоящего времени еще окончательно не выяснена, хотя и накоплен обширный экспериментальный материал (см.обзор /15/).
Данные о сдвигах электрических параметров, тесно связанных с ионной проницаемостью мембраны, позволят получить значительную информацию о наступивших изменениях и механизмах мембрано-тройных эффектов.
В нашей работе на удобном модельном объекте растительной клетки - харовой водоросли Mtella flexilis предпринята попытка выяснить детали механизма действия простагландинов на ионную проницаемость протопи аз матической мембраны (плазмалеммы) к основным потенциалопределяющим ионам.
Анализ полученных результатов позволил установить, что синтетические простагландины Ej (ПГЕj) обладают как прямым мембрано-тропным эффектом, обусловленным их детергентоподобными свойствами, так и действуют на ионную проницаемость мембран растительной клетки опосредовано через систему цАМФ. Индуцируемые ПГЕ-j- сдвиги ионной проницаемости, возможно, обусловлены их действием на два типа центров связывания, инициирующих мембранотропный ответ.
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Структура простагландинов и их регуляторное действие
Первоначально простагландини были обнаружены в животных тканях /4, 33 и др./; они являются биологически активными липидами, играющими важную роль в регуляции физиологической деятельности многих функций клетки и организма вцелом.
Простагландини являются производными полиненасыщенных гидро-ксилированных жирных кислот состоящих из 20 углеродных атомов. Для всех соединений характерно наличие, циклопентанового кольца, двух боковых цепей, двойной (транс) связи у Cj3 и гидроксила в 15 положении. Этот гидроксил имеет большое значение в биологической активности простагландинов. Так метаболиты с кетогруппой у Cjg проявляют менее 4$ активности IFEj.
В зависимости от структуры пентанового кольца все проетаглан-дины делятся на 4 группы: А, Б, Е и F , индекс при соответствующей букве означает количество двойных связей в боковых цепях. Так индекс I показывает наличие транс-двойной связи между 13 и 14 атомами углерода. Индекс 2 означает наличие цис-двойной связи между 5 и 6 атомами углерода в добавление двойной связи между 13 и 14 атомами. Индекс 3 указывает на присутствие третьей двойной связи между 17 и 18 атомами углерода. Во всех природных простагландинах ОН группа у 15 атома углерода находится в ос положении, Jb изомеры в природе не встречаются. Прост агландины с ОН группой в Cjg положении называются 19-окси-простагландинами. Таким образом, все простагландины различаются между собой по степени ненасыщенности и строением цикло-пентанового кольца. Наибольший интерес представляют простаглан-дины группы Е (ПГЕ). Они обнаружены в большинстве исследованных тканей, характеризуются широким спектром биологического действия, а также, как следует из экспериментальных данных, как правило, обладают наибольшей активностью /116/.
Основными путями метаболизма ПГЕ в организме являются окис-то ление вторичной ОН группы при Стк и восстановление Д двойной связи, что ведет к образованию 15-дегидро 13,14-дигид ро-производной не обладающей биологической активностью /4/.
Регистрация электрических параметров мембраны
Клетки харових водорослей, как еще показано, в ранних работах Остергаута /132, 133/, являются весьма удобным объектом в электрофизиологических экспериментах. Обладая довольно большими размерами с хорошо различимой вакуолью и постоянно находясь в контакте с окружающей средой харовые водоросли являются весьма удобной моделью растительной клетки, выполняющей функцию поглощения.
Возможность варьирования факторов внешней среды при непрерывной прижизненной регистрации электрических параметров олигомоле-кулярных мембран (плазмалемма и тонопласт) позволяет получить детализированную картину механизма сдвигов их проницаемостей к основным физиологическим ионам.
Обычно в эксперименте использовали 2-3-юю интернодальную клетку NitеНа fiexilis , выращенную в лабораторных условиях в искусственной питательной среде / 6 /. Отпрепарированная накануне клетка помещалась в искусственную прудовую воду (ИГО) или при проведении опытов в безкальциевой среде (HIB-CaCIg) в 5»10 М №аС1 для удаления обменного кальция из клеточной стенки /101/.
Освещенность как при предобработке, так и в опытах составляла 100 лк. В этих условиях для клетки и. fiexilis характерна высокая пассивная калиевая проводимость в условиях инактивиро-ванной электрогенной протонной помпы.
Регистрация электрических параметров мембраны
Измерение электрических параметров мембраны проводили как с помощью прецизионной микроэлектродной техники /28, 16/, так и при внеклеточном отведении /44/.
Микроэлектрод изготавливался обычными приемами из стекла пи-рекс. Для придания жесткости кончику и лучшего его заполнения электролитом ( 3 М KCI) микроэлектроды изготавливались с внутренними ребрами /35/. Заполнение микроэлектрода электролитом проводили непосредственно перед экспериментом. Отбирались микроэлектроды, потенциал кончика которых не превышал 1-2 мВ.
Электрод сравнения представлял собою трубочку с диаметром кончика около 300 мкм, заполненную раствором 10" М KCI на агар-агаре. Микроэлектрод и электрод сравнения соединялись с электрометрическим усилителем через неполяризующиеся каломельные полуэлементы.
Кинетика
Говоря о реакции объекта на присутствие физиологически активного агента, мы подразумеваем, что происходит это вследствие того, что молекулы последнего вступают во взаимодействие с некоторыми структурами клетки. В частности, экзогенные химические вещества в первую очередь, оказывают действие на внешнюю олиго-молекулярную мембрану клетки - плазмалемму. Важным составным элементом исследования характера наступающих сдвигов является детализация и описание процессов, лежащих в основе механизмов подобного рода взаимодействий. Объектом анализа оказываются процессы доступа эффектора к активным центрам (рецепторам) и сам акт их взаимодействия.
Соответствующие диффузионные уравнения, сформулированные в общем виде, ввиду многофазности и сложной организации системы оказываются чрезвычайно громоздкими и изобилуют параметрами, не поддающимися прямому экспериментальному определению.
В случае когда время доступа эффектора к центру связывания значительно меньше времени развития реакции, в фармакологии и токсикологии процесс образования комплекса z описывают уравнением /9,14/.
Сдвиги электрических параметров мембраны, индуцируемые ПАВ
Данные о действии ПАВ на электрические свойства мембран растительных клеток в литератзфе практически отсутствуют.Исключение составляет работа /38/, в которой рассмотрено влияние специфических детергентов-диспергаторов нефти на электрические свойства протопласта и скорость движения цитоплазмы клеток Nitella.
Исследовался эффект пяти детергентов - оксифос, ЭПН-5, бе-рол - 198, корсекит-7664, дипроксамин-157. При действии указанных диспергаторов нефти регистрировали сложную картину изменения РП во времени; однако, как правило, новый стационарный уровень оказывался ниже контрольного. Увеличение концентрации ПАВ в растворе окружающем клетку в интервале концентраций 0,01 100 г/л приводило к резкой деполяризации мембраны. Сопротивление клеточной мембраны под действием исследуемых диспергаторов в первоначальный момент уменьшалось, затем возрастало, а стационарная величина зависела от концентрации детергента. Авторы работы /38/ отмечают связь относительной величины падения РП с показателем - 50» К0Т0РЬ1Й определяли по остановке движения цитоплазмы под действием ПАВ.
С целью удобства обсуждения результатов по действию IITEj данные по сдвигу электродиффузионных характеристик протоплаз-матической мембраны клетки N.flexilis , инициируемые анионак-тивными ВДВ (Ж) и (ХІУ) - додецилсульфат и дезоксихолат натрия - приводятся в главе 4.
Стационарные сдвиги ионной проницаемости мембраны на действие простагландинов
В соответствие с приведенной схемой один из возможных путей действия простагландинов основан на их способности индуцировать транспорт ионов Са + через клеточные мембраны /76/; не исключается и его роль в регуляции транспорта других электролитов через клеточные мембраны /3, 82/. Поэтому первоначально представлялось целесообразным исследовать действие экзогенных простагландинов на электрические параметры клеточной мембраны при различной концентрации ионов Са + в окружающей среде /40/.
Оказалось, что в безкальциевой среде П-дезокси-15 oL -про-стагландин Ej в концентрациях 10 - 10 М не оказывал существенного влияния на биоэлектрическую реакцию клетки N.flexilis (табл. 5.1). Аналогичная ситуация отмечена и для других испытуемых ПГ.
В присутствии же в среде ионов Са2+ ПГо(1) вызывал заметный сдвиг потенциала и электрического сопротивления мембраны, причем более стабильная реакция отмечалась при повышении кон центрации кальция до 10 М (ИГО + CaCIg). ol - изомер ПГЕ (I) на фоне 10" - 10 М ионов Са в наружном растворе индуцировал сдвиг величины ПП порядка 15 мВ и электрического сопро-тивления мембраны 10-15 к0м»см (рис.5.I, 5.2).
