Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Фотоиндуцированные изменения разности электрических потенциалов на тилакоидной мембране 11
1.2. Индукция флуоресценции хлорофилла зеленых растений в связи с электрогенезом на мембранах хлоропластов 24
Глава 2. Методы исследования 36
2.1. Объект и среда 36
2.2. Микроэлектродные измерения мембранного потенциала 39
2.3. Измерение флуоресценции хлорофилла 42
2.4. Порядок проведения опытов 47
Глава 3. Результаты экспериментов 48
3.1. Электрогенные процессы в хлоропластах, обусловленные фотоактивацией переноса электронов в области ФС1 48
3.1.1. Фотоэлектрические ответы хлоропластов 48
3.1.2. Влияние предварительного освещения на фотогенерацию Аф .50
3.1.3. Флуоресценция одиночного хлоропласта 51
3.1.4. Одновременные измерения Аф и флуоресценции хлорофилла: влияние темновой адаптации на кинетику изменений 54
3.1.5. Сравнение индукционных кривых Аф и флуоресценции при модификациях фотосинтетической мембраны 58
3.1.6. Воздействие ингибиторов 62
3.2. Влияние мембранного потенциала на флуоресценцию хлорофилла..65
3.2.1. Изменение флуоресценции при пропускании тока через хлоропласт 65
3.2.2. Влияние сдвигов мембранного потенциала на флуоресценцию изолированного хлоропласта 69
3.2.3. Зависимость электроиндуцированных изменений флуоресценции от редокс-состояния первичного хинонного акцептора QA 70
3.2.4. Сравнение индукционных кривых мембранного потенциала и флуоресценции хлорофилла в хлоропластах с разной электрогенной активностью 75
3.2.5. Влияние фотоиндуцированного мембранного потенциала на флуоресценцию хлоропласта 78
3.3. Запускаемые светом изменения мембранного потенциала клеток и их связь с энергозависимым тушением флуоресценции 82
3.3.1. Триггерные электрические ответы клеток 82
3.3.2. Одновременные измерения разности электрических потенциалов и выхода флуоресценции под действием света 86
3.3.3. Запускаемые светом потенциалы действия и изменения квантовой эффективности ФС2 в клетках Anthoceros 92
Глава 4. Обсуэвдение результатов 98
4.1. Изменение мембранного потенциала и флуоресценции хлорофилла, опосредованные активацией транспорта электронов в области ФС1 98
4.2. Прямое влияние мембранного потенциала на выход флуоресценции хлорофилла в ФС 2 102
4.3. Модель потенциалозависимых изменений флуоресценции хлорофилла ФС 2 110
4.4. Фотоиндуцированные изменения электрического потенциала на клеточной мембране и изменения флуоресценции хлорофилла 115
4.5. Запускаемая светом генерация ПД и нефотохимическое тушение флуоресценции ФС2 120
Выводы 124
Литература 126
- Индукция флуоресценции хлорофилла зеленых растений в связи с электрогенезом на мембранах хлоропластов
- Микроэлектродные измерения мембранного потенциала
- Фотоэлектрические ответы хлоропластов
- Прямое влияние мембранного потенциала на выход флуоресценции хлорофилла в ФС 2
Введение к работе
Актуальность проблемы. Преобразование световой энергии в хлоропластах зеленых растений происходит в условиях непрерывно меняющейся внешней среды Возможности адаптации растений связаны с существованием систем регуляции, действующих на разных уровнях, включая первичные процессы фотосинтеза (Рубин, Кренделева, 2004; Бухов, 2004) Изменения флуоресценции (Фл) хлорофилла, отражающие состояние фотосинтетического аппарата, находят широкое применение в прикладных исследованиях и экологическом мониторинге Однако, современные представления о регуляторных механизмах, за редкими исключениями, не учитывают возможное влияние мембранных электрохимических процессов, которые развиваются на разных структурных уровнях: в тилакоидах и строме хлоропласта, в цитоплазме и на плазматических мембранах клетки
Первичное запасание энергии света при фотосинтезе связано с образованием мембранного электрического (эл ) потенциала (Аф) в тилакоидах хлоропластов, который участвует в регуляции трансмембранных ионных потоков и механизмах энергетического сопряжения (Witt, 1979; Булычев, 1972, 1997) Известно, что фотогенерация Аф в хлоропласте обусловлена совместным функционированием фотосистемы 2 (ФС2), ФС1 и цитохромного be/f комплекса Фотохимические процессы в ФС1 и ФС2 включают первичное разделение зарядов в реакционных центрах (между Р680 и феофитином в ФС2 и между Р700 и акцептором Ао в ФС1) и дальнейшие стадии стабилизации разделенных зарядов, при которых электрон переходит на последующие переносчики (хинонный акцептор Qa в ФС2; железо-серные белки Fx, Fa, Fb в ФС1) В образование Аф могут вносить вклад конформапионные изменения заряженных аминокислотных остатков и редокс-центров, сопровождающие трансмембранный перенос заряда (Семенов и др, 2004) Источником генерации Аф может служить и обратимая ІҐ-АТРаза, способная транспортировать протоны за счет гидролиза АТР и синтезировать АТР за счет энергии электрохимического градиента протонов
Генерируемый на свету Аф по принципу обратной связи регулирует скорость электронотранспортных стадий, в которых перенос электрона ориентирован
перпендикулярно или под углом к плоскости мембраны Изменения напряженности
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ і БИБЛИОТЕКА I
-— *
эл. поля в энергосопрягающих мембранах хлоропластов оказывают существенное влияние на обратный перенос электронов в реакционных центрах ФС2, проявляющийся в замедленной Фл. Создание положительного Аф внутри тилакоидов с использованием различных экспериментальных приемов понижает энергетический барьер для рекомбинации разделенных зарядов, связанной с образованием возбужденных молекул хлорофилла, и приводит к усилению замедленной Фл Однако механизм влияния Аф на процессы в реакционном центре ФС2 изучен недостаточно.
Опыты на изолированных тилакоидах (блебах) выявили эффекты внешнего эл поля на интенсивность быстрой Фл хлорофилла (Meiburg et al, 1983; Dau, Sauer, 1991) Становится очевидным, что Аф следует учитывать при моделировании индукционных кривых Фл зеленых растений (Лебедева и др., 2002) Однако одновременное измерение индукционных изменений Аф и флуоресценции хлорофилла а на одном объекте не проводилось. Вопрос о взаимосвязи эл. мембранных процессов и индукционных изменений Фл несомненно требует прямого экспериментального изучения Один из подходов к исследованию влияния мембранного потенциала на электронный транспорт в области ФС2 заключается в измерении Фл хлорофилла а при искусственных смещениях Аф на тилакоидной мембране путем пропускания тока через микроэлектрод, введенный в отдельный крупный хлоропласт.
Функционирование хлоропластов и выход Фл хлорофилла могут зависеть также от изменений эл потенциала на плазматической мембране клетки. Сдвиги потенциала клетки сопряжены с трансмембранными потоками ионов и могут сопровождаться изменениями ионного состава цитоплазмы. Для проверки представлений о вовлечении мембранных процессов целой клетки в регуляцию фотосинтеза удобно использовать способность некоторых мхов генерировать фотоиндуцированные потенциалы действия. Экспериментальное изучение влияния мембранного потенциала тилакоидов и плазмалеммы клетки на фотосинтетические процессы зависит от возможности четкого разграничения эл процессов, протекающих на этих пространственно разделенных мембранах. Перечисленные вопросы рассмотрены в данной работе.
Цели и задачи работы.
Цель работы состояла в исследовании механизмов и функциональной роли фотогенерации эл потенциала на тилакоидных мембранах и вызываемых светом изменений эл. потенциала плазмалеммы путем сочетания микроэлектродных методов и микрофлуориметрии в опытах с целыми клетками и одиночными хлоропластами. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи-
Разработать метод одновременной регистрации индукционных изменений Аф и флуоресценции Хл а в хлоропласте растительной клетки in situ и изучить фотоиндуцированные изменения Аф и Фл в норме и при различных физико-химических воздействиях.
Исследовать прямое влияние мембранного потенциала Аф на выход Фл Хл а путем искусственного смещения эл. потенциала на тилакоидных мембранах хлоропласта при различных состояниях ЭТЦ (при разном уровне восстановления хилонного акцептора ФС2 Qa).
Исследовать связи индукционных изменений Фл с изменениями мембранного потенциала на плазматической мембране, запускаемыми при освещении различной длительности.
Научная новизна. Впервые выявлены коррелирующие стадии в индукционных изменениях Аф и Фл Хл а, обусловленные ускорением потока электронов в акцепторной части ФС1. Впервые показано прямое влияние фотоиндуцированного Аф тилакоидных мембран на Фл хлорофилла ФС2 в целой растительной клетке. Впервые установлено, что пропускание биполярных импульсов тока, через хлоропласт может вызывать симметричные или асимметричные сдвиги Фл Хл а в зависимости от редокс состояния акцептора Qa. На основе представлений об обратимой радикальной паре в ФС2 (Климов, 1986; Qrondelle, 1985; Trissl, 2002) создана модель потенциалозависимых изменений Фл, учитывающая влияние Аф на процессы разделения, рекомбинации зарядов и стабилизации состояний в РЦ ФС2
Практическая значимость. Результаты работы послужили основой для развития теоретических моделей процессов разделения и рекомбинации зарядов во внешнем эл. поле (Беляева, 2004, Vredenberg, 2002-2005) и подтверждены экспериментально в ряде лабораторий (Dau et al.,1991; Dau, Sauer, 1991, 1992). Полученные результаты нашли практическое применение на кафедре биофизики Биологического факультете МГУ им MB Ломоносова для построения обобщенной модели индукционных стадий фотосинтеза с учетом генерации мембранного потенциала хлоропластов (Беляева, 2004). Одновременная регистрация индукционных изменений Фл и эл. потенциала мембран в нативной растительной клетке в различных условиях представляет практическое значение для экологического мониторинга
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на IV Всесоюзн. межуниверситетской конференции по биологии клетки (Тбилиси, 1985), научных конференциях молодых ученых биологического ф-та МГУ (Москва, 1986, 1987), Ill-съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), Межд научно-практической конференции МГУ-СУНИ «Человечество и окружающая среда» (Москва, 2004), 12-ой Межд конференции «Математика. Компьютер Образование» (Пущино, 2005), семинарах кафедры биофизики биологического факультета и Экоцентра МГУ им. М. В. Ломоносова, XVIII Путинских чтениях по фотосинтезу (2005)
Публика дни. По материалам диссертации опубликовано 19 работ, из них: 5 в реферируемых научных российских журналах, 2 в зарубежных журналах, 5 в сборниках научных трудов , 2 в книгах, 1 в тезисах биофизического съезда, 4 в тезисах конференций.
Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, четырех глав, содержащих описание методов исследования, результаты, обсуждение, выводы и список литературы Материалы изложены на 148 страницах текста и включают 2 фотографии и 43 рисунка Список литературы включает 235 работ (из них 175 на иностранных языках)
Индукция флуоресценции хлорофилла зеленых растений в связи с электрогенезом на мембранах хлоропластов
При комнатной температуре энергия возбуждения хлорофилла в свето-собирающих комплексах ФС1 и ФС2 с высокой эффективностью передается в реакционные центры фотосистем 1 и 2 и используется в реакциях первичного разделения зарядов. Поэтому выход флуоресценции хлорофилла, входящего в ФС1 и ФС2, очень мал. Однако на ярком свету происходит накопление восстановленных продуктов на участке ЭТЦ между фотосистемами (QA И др.) из-за наличия в цепи «узких мест» и соответствующих кинетических ограничений. Накопление QA затрудняет разделение зарядов в ФС2 и резко снижает её фотохимическую активность. При этом выход флуоресценции возрастает в 4-5 раз. Светозависимые изменения флуоресценции зеленых растений и их хлоропластов называют переменной флуоресценцией. Известно, что квантовый выход флуоресценции ФС1 при комнатной температуре в 5-Ю раз меньше, чем у ФС2 [119; 70; 204]. Кроме того выход флуоресценции ФС1 не изменяется под действием света. В связи с этим вся переменная флуоресценция связана с ФС2.
Величина квантового выхода флуоресценции ФфЛ (отношение числа испущенных квантов к числу поглощенных квантов света) зависит от соотношения вероятности излучения и суммы вероятностей всех возможных путей дезактивации возбужденного состояния. Основной процесс, в котором используется энергия света, - это фотоиндуцированное разделение зарядов (Кфх - константа скорости фотохимической реакции). Остальная энергия возбужденных состояний может излучаться в виде флуоресценции (Кфл - константа флуоресценции), рассеиваться в виде тепла (Кт- константа безызлучательных потерь), мигрировать на другие молекулы пигментов (Км - константа миграции энергии). Типичная временная зависимость интенсивности переменной флуоресценции хлорофилла для выдержанных в темноте образцов (по А.Б. Рубину, 2000). В настоящее время в индукционной кривой выделяют несколько характерных стадий. По терминологии Шрайбера [111; 146], быстрые изменения флуоресценции обозначают символами F0—її—h—Fm, где її и I2 - промежуточные уровни при переходе от минимального (F0) к максимальному (Fm) уровню. С развитием светодиодной техники, удалось повысить крутизну фронта нарастания светового стимула и обеспечить временное разрешение флуоресценции в интервале от 50 мкс до десятков секунд [152]. Индукционные кривые, измеряемые в диапазоне времен, отличающихся на 4-5 порядков, часто изображают в логарифмической шкале [152]. При этом указанные выше стадии обозначают символами О—J—I—Р, где уровень О (original) идентичен Fo, J Gump) обозначает первый промежуточный уровень, I (intermediary) - второй промежуточный уровень, Р (peak) - максимальный уровень (идентичен Fm), см. Рис. 1.2.
Стадию F0—її (О—J) называют «фотохимической» фазой [145; 137]. Амплитуда этой фазы возрастает с повышением интенсивности света, но лишь до определенного предела, не превышающего 50-70% от общего изменения флуоресценции. Переходы її—12—Fm (J—I—Р) называют «термальной» фазой [145; 137]. Эта фаза протекает за время 200 мс; в отличие от фотохимических процессов, ее длительность не сокращается ниже указанного уровня при повышении интенсивности света.
Индукционные переходы включают промежуточные минимумы. Чтобы отразить наличие промежуточных уровней в относительно медленных стадиях индукционной кривой используют символы Р—S—М—Т [101; 119; 204], где Р - (peak) первый пик, наблюдаемый через 0.01-0.1с (в зависимости от интенсивности света и предыстории образца); Si - (first stationary level) первый минимум; М - дополнительный максимум; Т - (terminal) постоянный уровень.
Совпадение спектра действия фотоиндуцированных изменений выхода флуоресценции со спектром поглощения ФС2 указывало на то, что основной вклад в индукцию флуоресценции вносит хлорофилл а светособирающего комплекса ФС2. Индукционные изменения флуоресценции сопровождались противофазными изменениями скорости выделения Ог, что объясняли конкуренцией этих процессов за использование энергии возбуждения хлорофилла.
По предположению Дюйзенса и Свирса [54] выход флуоресценции контролируется окислительно-восстановительным состоянием первичного хи-нонного акцептора электронов ФС2 (Q), который в окисленном состоянии тушит флуоресценцию хлорофилла по механизму фотохимического тушения. Согласно этой гипотезе фотохимическое восстановление Q фотосистемой 2 сопровождается увеличением выхода флуоресценции, а окисление Q фотосистемой 1 приводит к уменьшению флуоресценции. Восстановление первичного хинонного акцептора препятствует разделению зарядов в реакционном центре ФС2. Прекращается захват энергии реакционным центром и фотохимическое преобразование энергии возбужденных молекул хлорофилла. Поэтому индукционные изменения флуоресценции используют как показатель скорости разделения зарядов в реакционном центре ФС2 и скорости фотопереноса электрона по фотосинтетической цепи.
Уровень Fo на индукционной кривой флуоресценции соответствует открытым реакционным центрам ФС2 и максимальной эффективности фотохимической реакции. Наличие флуоресценции F0 указывает на наличие некоторых потерь энергии возбужденных состояний в антенне на пути миграции к реакционным центрам.
Микроэлектродные измерения мембранного потенциала
Для проведения экспериментов была собрана установка, позволяющая совместно регистрировать индукционные кривые флуоресценции и мембранного потенциала Аф, а также наблюдать электроиндуцированные изменения флуоресценции на одиночных хлоропластах (Рис. 2.3). Установка была собрана на базе люминесцентного микроскопа Люмам-ИЗ с микрофотометрической насадкой ФМЭЛ-1 и микроманипуляторов КМ-2, используемых для подведения микроэлектродов и микропипетки к хлоропласту [32; 33].
Для измерения разности электрических потенциалов Аф между хлоропластом и средой использовали капиллярные микроэлектроды из стекла "пи-рекс". Это боросиликатное стекло обладает высокой химической устойчивостью и большим электрическим сопротивлением (удельное сопротивление до 1016 Ом/см) [226; 192].
Микропипетки вытягивали из капиллярных трубок с внешним диаметром 1.1-1.2 мм на полуавтомате МЭ-4. Капиллярные заготовки вытягивали в лаборатории на полуавтоматическом приспособлении, подробно описанном ранее [217]. При вытягивании капиллярных трубок их заранее снабжали стеклянными нитями в канале (они впоследствии при наполнении микропипетки электролитом играли роль фитиля). СИ— /із
Блок-схема установки для одновременных измерений флуоресценции и мембранного потенциала на одиночном хлоропласте. 1, 20 - галогенные лампы КГМ 9-70; 2, 19 - коллекторные линзы; 3 - водный тепловой фильтр; 4 - апертурная диафрагма; 5 -электромеханический затвор; 6 - синий фильтр СЗС-22; 7 - щелевая диафрагма типа "кошачий глаз"; 8 — интерференционная светоделительная пластинка; 9 - объектив микроскопа; 10 - препарат; 11 - конденсор; 13 - плоское зеркало; 15 - красный фильтр КС-17; 16 - вогнутое зеркало с зондом; 17 - окуляр; 18 - шторка ФЭУ; 21 - ФЭУ-79; 22 - низкочастотный фильтр (конденсатор 15 нФ); 23 - осциллограф С1-18; 24 - электрометрический усилитель; 25 - электростимулятор ЭСЛ-2; 26 - измерительный электрод 27 - электрод сравнения; 28 - нагрузочное сопротивление; 29 - поляризованное реле; 30 - стабилизатор тока.
Форму конуса и толщину кончика каждой микропипетки контролировали под световым микроскопом. Наружный диаметр кончика микропипетки должен составлять не более 0.5% от диаметра клетки, в которую вводится микроэлектрод [226]. Вольт-амперные характеристики используемых микроэлектродов в растворах КС1 при пропускании положительных и отрицательных пилообразных импульсов тока до 40 нА были линейными и симметричными. Это служило критерием нормального заполнения кончика микропипетки [122]. Сопротивление измерительного микроэлектрода находилось в пределах 50 МОм.
В качестве электрода сравнения использовали каломельный электрод, контакт которого с раствором в экспериментальной камере устанавливали с помощью электролитного мостика, заполненного 2% раствором агара, приготовленным на 1 М КС1. Для предотвращения вибрации в ходе эксперимента установка была смонтирована на стальной плите-основании.
При проведении одновременных фотоиндуцированных измерений мембранного потенциала (Аф) и флуоресценции хлоропласта электродный сигнал и сигнал фотоумножителя регистрировали с экрана двухлучевого осциллографа фоторегистратором ФОР-2. Сигнал от измерительного микроэлектрода поступал на вход осциллографа через электрометрический усилитель (КВХОда= ЮГОм).
Для пропускания тока через хлоропласт микроэлектрод с помощью поляризованного реле подключали к выходу генератора импульсов ЭСЛ-2. В этом случае на экране осциллографа регистрировали сигнал с ФЭУ и ток, текущий через микроэлектрод. При непосредственном подключении микроэлектрода к источнику тока сила пропускаемого тока зависит от сопротивления микроэлектрода, которое может меняться при изменении направления тока [122]. Поэтому ток подводили к хлоропласту либо через нагрузочное сопротивление (1.5 ГОм), либо через собранный на основе операционных усилителей К140УД8А стабилизатор тока (Рис. 2.4). Тем самым ток поддерживали на уровне 10-10 - 4-10-8 А.
Синхронизация импульсов, регулирующих запуск луча осциллографа, открывание затвора фоторегистратора, формирование импульса возбуждающего света и стимуляцию хлоропласта током через микроэлектрод осуществлялась системой электростимуляторов и реле (Рис. 2.5).
Мембранный потенциал (МП) клеток измеряли с помощью капиллярных микроэлектродов, заполненных 1 М холин-хлоридом. Для подведения микроэлектродов использовали микроманипулятор КМ-2 (Пущино). Разность потенциалов между микроэлектродом и хлорсеребряным электродом сравнения измеряли электрометрическим усилителем VAJ-51 (Германия) с входным импедансом 1015 Ом и регистрировали на компьютере с помощью аналого-цифрового преобразователя CED-1401 (Cambridge Electronic Design, Великобритания) и программы WinWCP (Strathclyde Electrophysiology Software) [185; 227].
Источником действующего света, вызывающего генерацию ПД, служил верхний осветитель микроскопа Axiovert 25 CFL. Свет направляли на препарат слоевища через синий светофильтр СЗС-22 (К 580 нм). Интенсивность фотосинтетически-активной радиации составляла 30 мкмоль м 2 с-1.
Фотоэлектрические ответы хлоропластов
Включение света сопровождается смещением мембранного потенциала хлоропласта в положительную сторону на 30-70 мВ в течение 20-200 мс. После достижения максимального уровня регистрируется относительно медленное (в течение 2-10 с) уменьшение Аф до стационарного уровня 10-25 мВ.
Стационарный мембранный потенциал, устанавливающийся при непрерывном освещении, складывается из двух компонент (см. Рис. 3.1). Одна из них - Va непосредственно связана с электрогенным переносом электронов, а вторая V j представляет диффузионный потенциал, возникающий в связи с неравномерным распределением ЇҐ, К+ и других ионов в освещенном хлоропласте [36; 178].
Выключение света сопровождается сдвигом Аф на 5-10 мВ отрицательнее исходного уровня и последующим медленным (в течение 1-3 с) возвращением к темновому уровню. Потенциал, устанавливающийся скачком в первые моменты после выключения света, отражает диффузионный потенциал. Фотоиндуцированные изменения электрического потенциала на тилако-идных мембранах изолированного хлоропласта P. metallica (а) и одиночного хлоропласта мха Anthoceros sp. (б) в физиологических условиях при действии света насыщающей интенсивности; V - стационарный мембранный потенциал, устанавливающийся при непрерывном освещении; Va- компонента, связанная с электрогенным накачиванием Н+ внутрь тилакоида; V - диффузионный потенциал.
Первый пик мембранного потенциала наблюдается через 20-50 мс после начала освещения. После латентного периода 0,2-0,4 с происходило вторичное возрастание Аф. Этот максимум впервые был обнаружен на интактных хлоропластах [27]. В присутствии искусственных кофакторов электронного транспорта вторичное нарастание Аф удается зарегистрировать и на изолиро ванных хлоропластах. Однако наибольший интерес представляет исследование механизмов возникновения второго пика Дф в физиологических условиях в интактном хлоропласте печеночного мха Anthoceros.
На рис. 3.2 показаны типичные изменения Аф в хлоропласте Anthoceros под действием непрерывного света после различных интервалов темноты, следующих за 1-секундным освещением.
При повторном освещении после длительного темнового интервала на кинетической кривой изменений мембранного потенциала выявляются два отдельных пика (рис. 3.2). Воздействие импульса света через 20-30 с после предварительного освещения индуцирует фотоответ с одним пиком и последующим монотонным падением потенциала (рис. 3.2а).
Повышение интервала от 5 до 20 с между последовательными импульсами света сопровождается увеличением первого пика мембранного потенциала. Амплитуда первого максимума Аф в интервале 0.5-4 мин не зависит от длительности темновой адаптации. Из рис. 3.2в и 3.2г видно, что положение второго максимума Аф существенно смещается в зависимости от длительности темновой адаптации.
Изменение интервала времени между двумя световыми импульсами от 0.5 мин до 3-4 мин приводит к увеличению амплитуды второго пика Аф и к задержке его генерации. Одновременно становится более выраженным промежуточный минимум на индукционной кривой Аф.
Переход PS в индукционных кривых флуоресценции происходят немонотонно. В течение 1-2 с после достижения максимума Р отчетливо виден переход флуоресценции к промежуточному минимуму Si и последующая за держка спада, приводящая к появлению "плеча" или небольшого дополнительного максимума М. Эти изменения флуоресценции, называемые обычно PSiM - переходом [138] обнаружены и на высших растениях [190]. В некоторых случаях удалось регистрировать начальные быстрые изменения флуоресценции (Рис. 3.4а) в диапазоне до 0,1 с освещения, включающие промежуточный максимум I, спад D и быстрое увеличение флуоресценции хлорофилла до уровня Р. Последующие фазы кинетической кривой флуоресценции имеют обычный вид. Промежуточный максимум флуоресценции I, наблюдаемый через 0,01-0,1 с, зависит от интенсивности света и предыстории образца [203; 204]. Принято считать, что уровень флуоресценции хлорофилла на ярком свету при коротких интервалах освещения отражает степень восстановленное первичного акцептора ФС2, которая определяется соотношением скоростей притока электронов к первичному акцептору QA И оттока электронов на ФС1 [234]. Активация переноса электронов на уровне ФС1 находит проявление в кратковременном уменьшении интенсивности флуоресценции хлорофилла [174; 138].
Прямое влияние мембранного потенциала на выход флуоресценции хлорофилла в ФС 2
Полученные результаты показывают, что мембранный потенциал (Аф) оказывает прямое влияние на выход флуоресценции хлорофилла в связи с изменением скорости отдельных стадий переноса электронов в реакционном центре ФС2. Такой механизм реализуется при наложении на фотосинтетическую мембрану разности электрических потенциалов от внешнего источника. Из представленных нами результатов видно, что усиление и уменьшение выхода флуоресценции обусловлены сдвигами Аф разной полярности, а не одной и той же полярности (положительной), как предполагалось ранее [104]. Электроиндуцированные смещения Аф в положительную сторону ("плюс" внутри тилакоида) приводили к усилению выхода флуоресценции, а тушение флуоресценции вызывалось смещением мембранного потенциала в отрицательную сторону. В опытах Meiburg и соавт. [104] на препаратах тилакоидов, набухших в дистиллированной воде, показано, что если первичный хинон 102
ный акцептор ФС2 предварительно частично или полностью окислен, то положительный мембранный потенциал вызывает увеличение выхода флуоресценции. Представленные на рис. 3.16, 3.17 данные подтверждают это заключение. Вместе с тем, трудность однозначной интерпретации экспериментов с набухшими тилакоидами [104] состоит в том, что действие внешнего электрического поля на сферические везикулы индуцирует мембранные потенциалы противоположной полярности на разных сторонах везикулы. Не исключено, что электроиндуцируемые изменения в противоположных полусферах отличались знаком и частично компенсировались в регистрируемом сигнале, особенно при действии слабых электрических полей.
Наши опыты исключают неопределенность в полярности напряжения, приложенного через микроэлектрод к интактному хлоропласту. Поэтому в отличие от выводов Meiburg et al. [104], можно заключить, что электроинду-цируемое уменьшение выхода флуоресценции в условиях полного восстановления QA (например, сильное освещение или добавление диурона) происходит под действием отрицательного, а не положительного искусственно созданного электрического потенциала.
Проведенные опыты показывают, что изменения флуоресценции хлоро-пластов, вызываемые на ярком свету импульсами разной полярности, примерно симметричны в физиологических условиях, но становятся резко асимметричными при полном восстановлении первичного акцептора QA на свету в присутствии диурона, а также при торможении фотовосстановления QA путем обработки хлоропластов гидроксиламином и метилвиологеном (рис. 3.12, 3.15,3.16,3.17).
Обнаруженное сходство электроиндуцируемых изменений флуоресценции хлорофилла в одиночных хлоропластах и набухших тилакоидах позволяет считать в соответствии с выводом работы [104], что изменения свечения в исследуемом интервале времени обусловлены влиянием электрического поля на процессы в реакционных центрах ФС2, а не перемещением Mg2+ между тилакоидами и стромой, контролирующим степень стыковки тилакоидов и распределение поглощаемой световой энергии между ФС2 и ФС1 [10; 135; 81].
О возможности непосредственного влияния электрического поля на процессы в РЦ ФС2 свидетельствует различное влияние положительного мембранного потенциала и Mg2+ на максимальный уровень флуоресценции Fm, достигаемый на свету в присутствии диурона. Добавление Mg к суспензии хлоропластов в среде с низкой ионной силой приводит к возрастанию Fm, что связывают с уменьшением перетока (spillover) поглощаемой световой энергии от ФС2 к ФС1 [119; 10].
В отличие от этого, положительный мембранный потенциал усиливает флуоресценцию только при неполном восстановлении QA, НО не вызывает дополнительного возрастания F, когда QA восстановлен.
Сильная зависимость тушения флуоресценции, вызываемого отрицательными сдвигами мембранного потенциала, от редокс-состояния первичного хинона QA позволяет предположить в первом приближении, что уровень флуоресценции F, когда этот уровень близок к F0, под влиянием мембранного потенциала можно только повысить, но нельзя уменьшить. Очевидно, отрицательный сдвиг Аф не приводит к понижению потерь энергии в светособи-рающей антенне ниже уровня, соответствующего F0 в отсутствие внешнего поля. Создается впечатление, что кратковременные сдвиги Аф, как положительной, так и отрицательной полярности не оказывают влияния на эффективный размер антенны ФС2.
Полученные данные приводят к выводу о том, что выход флуоресценции при наложении электрического поля той или иной полярности может изме няться лишь в тех пределах, что и "переменная флуоресценция" в отсутствие внешнего электрического поля, т.е. в пределах между уровнями F0 и Fm, со ответствующими полностью окисленному и полностью восстановленному состоянию акцептора QA. Простая интерпретация этого явления состоит в том, что перенос электронов в реакционном центре ФС2 в одинаковой мере тормозится как при химическом или фотохимическом восстановлении первичного хинона QA, так и при создании внутри тилакоида высокого положительного потенциала, препятствующего разделению зарядов.
Перенос электронов от первичного донора Р680 к первичному хинону QA происходит в две стадии через промежуточный акцептор феофитин [207; 93; 94; 95; 225]. Согласно современным представлениям, перенос электронов с Р680 на феофитин сопровождается понижением энергии на 0,06-0,08 эВ, а последующий перенос электрона с феофитина на QA приводит к понижению свободной энергии на 0,5 эВ [207; 57; 70]. Поскольку Р680, феофитин и QA расположены поперек мембраны, наложение внешнего электрического поля приводит к смещению относительного расположения энергетических уровней возбужденного состояния Р680 и двух состояний с разделенными зарядами. Чувствительность первичной и вторичной стадии разделения зарядов к изменениям мембранного потенциала зависит от ряда факторов, прежде всего от разности среднеточечных потенциалов между возбужденным состоянием Р680, феофитином и QA, от расстояний между этими компонентами по отношению к общей толщине мембраны, а также от высоты электростатических барьеров, соответствующих переносу электрона через гидрофобную зону мембраны [207; 71; 80; 17; 124; 127; 191; 131].
