Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 5
Выделение одиночных сердечных клеток 16
Измерительные схемы 23
Глава 2. Методика экспериментов 27
Глава 3. Выделение одиночных клеток из миокарда взрослых теплокровных 37
Глава 4 Измерение ионных токов 46
1.Общие положения 46
2. Перфузия сердечных клеток 57
3« Метод микроотведения 62
4« Измерение токов через одиночные каналы 69
Глава 5. Обсуждение 7 5
Выводы 90
Список литературы 92
- Измерительные схемы
- Перфузия сердечных клеток
- Метод микроотведения
- Измерение токов через одиночные каналы
Введение к работе
Потенциал-зависимые изменения ионных токов через возбудимую мембрану играют ключевую роль в таких важнейших проявлениях деятельности миокарда, как возникновение и проведение возбуждения, сопряжение возбуждения и сокращения. На практике,умение направленно воздействовать на параметры этого процесса может дать эффективные средства борьбы с различными нарушениями сердечной деятельности (Кринский, 1968, Ходоров, 1980, Розенштраух 1980, .. Ї^'УА .... 1980). Однако, развитию исследований в этом направлении до последнего времени препятствовало отсутствие надежных методов измерения ионных токов. Различные модификации метода фиксации потенциала, разработанные для многоклеточных миокардиальных препаратов оказались
непригодными для этой цели (.... 1977,
А^.^-к^У^-.^РЬ^У.. 1978). Основные препятствия для реализации надежной фиксации потенциала в исследуемом участке ткани внутренне присущи любому многоклеточному перпарату. Так, сопротивление мендуклеточных пространств оказывается включенным между клетками ткани и электродами измерительной схемы. Попытки скомпенсировать его влияние не привели к успеху, поскольку это сопротивление не одинаково для разных клеток (очевидно, что сопротивление от электрода до клеток, лежащих внутри препарата, больше, чем до наружных клеток). Требование пространственной однородности распределения мембранного потенциала заставляет исследователя ограничивать участок ткани, в котором фиксируется потенциал. Ограничение рабочего участка ткани осуществляется либо методом сахарозного мостика (двойного
или одинарного), либо непосредственно препарованием очень маленького кусочка сердечной мышцы (при фиксации потенциала с помощью двух микроэлектродов). При первом способе диффузия сахарозы по междуклеточным щелям приводит к тому, что клетки лежащие внутри ткани, находящейся в рабочем отсеке, омываются не рабочим раствором,а смесью рабочего раствора с сахарозой (в непредсказуемых пропорциях). При втором способе рабочая ткань оказывается окруженной большим количеством поврежденных клеток, что приводит к быстрой ее гибели.
Появление и развитие методов ферментативного выделения изолированных сердечных клеток из сердца взрослых животных
( vz 1980,
решению вопроса об адекватном измерении ионных токов через мембрану. Простая по сравнению с многоклеточным препаратом электрическая структура объекта,непосредственный доступ к мембране позволяют, на первый взгляд, обеспечить надежные измерения токов относительно простыми средствами. Однако, микроскопические размеры объекта приводят к тому, что в измерительной схеме появляются паразитные сопротивления и емкости. Погрешности измерений, вносимые ими, как показал анализ, оказываются столь значительными, что делают невозможным количественное изучение ионной проницаемости. Далее, при измерении малых токов (например, токов через одиночные каналы) исследователи сталкиваются с необходимостью минимизации шумовых погрешностей измерительной схемы ((.^^.4-.,. ^ 1981). До последнего времени не было проделано систематически строгого математического анализа возможностей и ограничений метода
фиксации потенциала как на целой мембране, так и на фрагментах мембран одиночных клеток.
Целью настоящей работы являлось:
I. Разработать метод получения изолированных сердечных клеток с помощью ферментов, с минимальным риском повреждения.
2. Количественно исследовать точность измерения ионных токов в применяемых экпериментальных схемах.
Основные задачи исследования. I. Установить диапазоны концентраций свободного кальция и протеолитических ферментов в растворах,применяемых в процедуре обработки миокарда, которые гарантируют стабильный высокий выход клеток, устойчивых к последующему повышению концентрации кальция во внешнем растворе до физиологического уровня. 2.Провести аналитический и числовой расчет динамики установления потенциала на мембране, уровня и частотных характеристик фоновых шумов при измерении ионных токов, временного и амплитудного разрешения различных методик. 3« Разработать и исследовать в эксперименте конкретные электронные схемы, конфигурацию микроприсоски и экспериментальной установки для достижения максимальной точности регистрации ионных токов.
Измерительные схемы
Ионные токи через биологические мембраны клеток имеют обычно малую величину и нуждаются в усилительных схемах для регистрации. Даже в таком большом препарате как гигантский аксон кальмара, где измеряемые токи достигают Юмка, оказалось необходимым использовать электрометрический ламповый усилитель для фиксации потенциала и регистрации ионных токов. Лампы, однако имеют много недостатков: большой дрейф по напряжению из-за неравномерности накала, высокий уровень дробовых шумов. Если в 50-х годах при работе с гигантским аксоном кальмара еще применялись ламповые усилители, то в дальнейшем, после изобретения полевого транзистора их полностью заменили полупроводниковые усилители. Главный параметр полевого транзистора - крутизна усиления. У современных полевых транзисторов она порядка Юма/в. Полевые транзисторы обычно используются в виде подобранных пар в одном корпусе, чтобы скомпенсировать тепловой дрейф каждого из них.В качестве одной из наиболее тщательно разработанных - 24 схем для измерения ионных токов мембраны перехвата нервалягушки, с применением полевого входного каскада приведем. В этой работе автор,применив подобранную пару 528 и тшательноскорректировав частотные свойства дальнейших каскадов,добился очень быстрого установления потенциала за Юмкс ималого уровня шумов (1па при полосе измерения токовЮкгц). Зто позволило провести нестационарный шумовойанализ натриевых токов перехвата Ранвье и довольно точнооценить проводимость одиночного канала, не прибегая к егонепосредственному измерению.В технической литературе часто встречается анализ чувствительных усилителей на полевых транзисторах, безотносительно к применению в биофизической практике. Так,в статье (Третьяков и др. 1978) были проанализированныі усилители для спектроскопических детекторов на базеотечественных полевых транзисторов КП 303. Были приведенызависимости входного тока затвора и его шумов от напряженияна концах канала и от температуры. В работе данырекомендации для уменьшения шумов ниже номинальных,указанных в паспорте прибора. Такие сведения имеютпринципиальное значение при проектировании измерительныхсхем для изучения одиночных каналов. Можно отметить статью(Зеленин 1980), где исследовался сдвоенный полевойтранзистор КПІ04 в режиме микротоков. При этих условияхрезко падают входные токи усилителя и шум схемы по току, новместе с тем падает крутизна полевых транзисторов у чтоприводит к соответственному росту шума схемы по напряжению.Авто ры рекомендуют данную пару для низкочастотных измерении - 25 токов, так как влияние шума по напряжению проявляется в области высоких частот.
Большое значение для измерения быстрых и малых по амплитуде ионных токов, имеет подбор сопротивления, с помощью которого производится калиброванное измерение тока. В чу ствительных электрометрических схемах используются высокоомные сопротивления, с целью снижения уровня тепловых шумов. Но такие сопротивления обладают технологическими паразитными емкостями , которые вносят искажения при высокочастотных измерениях. В работе (Ансо, 1981) автор проанализировал работу системы компенсации паразитных распределенных емкостей у сопротивлении величиной ІТом. Автору удалось путем введения частотнозависимой обратной связи довести время переходного процесса до 200мкс. Аналогичные сверхчуствительные электрометрические измерители тока могут найти применение при исследованиях одиночных ионных каналов.
К числу перспективных можно отнести статью (Бреннеке и Линденман 19 74). В этой работе авторы применили дискретный принцип работы микроэлектродной схемы измерения. В определенные моменты времени обратная связь фиксации потенциала на мембране разрывается и производится выборка и хранение истинного потенциала мембраны. Так как в этот момент ток через управляющий электрод не протекает, ошибка измерения, обусловленная наличием последовательного сопротивления, оказывается достаточно маленькой. Таким образом, ценой значительных затрат дискретной электроники, специальных микросхем аналоговых ключей, схем выборки и хранения удается повысить качество фиксации потенциала. Основным источником ошибок работы схемы служат выбросы напряжения на входе чуствительного усилителя на полевых транзисторах при переключении аналоговых ключей. Выбросы проникают через паразитные емкости ключей в измерительную схему. При более тшательном проектировании схемы ключей, возможно удастся избежать больших наводок и применения специального интегрирующего режима работы схемы фиксации. Хотя из-за своей сложности схема дискретной фиксации распространения не нашла, но в связи с разработкой метода диализа клеток при гигаомном контакте пипетки и мембраны метод становится весьма перспективным. Достаточно сказать, что в противоположность фиксаторам с непрерывным принципом действия, данный фиксатор не обнаруживает склонности к самовозбуждению после компенсации последовательного сопротивления. Возможно точное определение емкости мембраны.
Перфузия сердечных клеток
Расположение клетки, стеклянной присоски и измерительных электродов схематически показаны на pncHv.... Токи, измеренные этим методом имеют амплитуду до 100 нА (максимальная амплитуда натриевого тока), сопротивление мембраны порядка 40 Мом. Зти данные определили выбор преобразователя ток-напряжение, величина сопротивления в его обратной связи была 100 Мом. Плотность теплового шума: Операционный усилитель (574УДІ), на котором был построен преобразователь имеет удовлитворительные шумовые характеристики:Инструментальные шумы ниже тепловых шумов сопротивлений до частоты:
Коэффициент усиления и частота единичного усиления определили вид передаточной функции измерительного тракта (генератор командного потенциала - препарат іреобразователь ток-напряжение):Как указывалось выше, наиболее удобно анализировать іоредаточнусо функцию, если ее знаменатель разложен на іроизведение одночленов. Проверим достаточные условия юзможности такого разложения При том быстродействии, которое имели выбранные операционные усилители (Т = 0,01 мкс)максимум частотно-зависимо ошибки аппроксимации знаменателя произведением одночленов не превышаетМы остановимся на этом приближении:
При менее быстродействующем усилителе такой способ анализа переходных процессов не действителен и для вычисления всех характристик необходимы более громоздкие и сложные вычисления (напрмер, применение формулы Кардано или численное интегрирование). Главный (наиболее низкочастотный) полюс передаточной функции определяется произведением последовательного сопротивления (сопротивления пипетки и миоплазмы) и емкости мембраны:
Очевидно, что наиболее важными для качественного эксперимента являются отклонения потенциала на входе измерителя тока от нулевого уровня на больших временах [порядка наибольшей постоянной времени). Рассмотрим однополюсное приближение передаточной функции:
Такому преобразованию Лапласа соответсвует экспоненциальный ход кривой с постоянной времени Для примененного операционного усилителя при реальных іараметрах клеток ошибка получается достаточно малой:
При менее быстродействующих усилителях ошибка может устигать единиц милливольт. Из того факта, что іреобразователь достаточно качественно удерживает нулевой фовень потенциала на своем входе не следует, что тембранный потенциал удерживается на желаемом уровне. При іротекании измерямого тока по последовательному юпротивлению (которое составляет обычно величину порядка ,5 Мом) отклонение мембранного потенциала от желаемого гровня достигает величин порядка . іг 5 = 50 мв. Схема, [рименяемая для компенсации ошибки обусловленной влиянием юеледовательного сопротивления показана на рис.10.... Іспользуется обычный принцип::: к командному потенциалу [рибавляется часть измеренного сигнала. Глубина этой юложительной обратной связи выбирается таким образом, что ;обавленная часть оказывается равной падению напряжения на юследовательном сопртквлении. Найдем передаточную функцию ісего тракта с учетом положительной обратной связи:
Метод микроотведения
При регистрации ионных токов методом микроотведения, микроприсоска с малым диаметром поры (обычно порядка 5 - 7 мкм) подсасывается к участку мембраны клетки, изолируя этот участок от остальной мембраны. Зтот участок не разрушается (как при работе методом внутриклеточной перфузии), а служит в качестве исследуемой мембраны. Площадь этого участка в 200 - 300 раз меньше, чем общая поверхность клетки. Ток, пропускаемый через присоску, вызвает смещение потенциала на рабочем участке мембраны и, растекаясь затем по значительно большей поверхности клетки, практически не влияет на ее потенциал.
Эквивалентная схема клетки и измерительного тракта показана на рис ...... Как видно, управление построено на цвух электродах: один, находящийся в рабочей камере, присоединен к схеме "виртуальная земля", другой, в микроприсоске, соединен с генератором напряжения. Потенциал на мембране клетки никак не фиксируется, а держится естественным путем на уровне потенциала покоя. Очевидно, что после смещения потенцала в микроприсоске и завершения переходных процессов, весь командный потенциал (с точностью цо 1/200 - 1/300) упадет на рабочем участке. Специального анализа требуют три вопроса:- а) каково качество удержания нулевого потенциала в точке "виртуальная земля"?- б) как быстро устанавливается потенциал на рабочем участке при наличии последовательного импеданса в виде оставшейся части мембраны клетки?- в) какова величина ошибки фиксации потенциала в результате протекания ионного тока, генерируемого рабочим участком, по последовательному импедансу?
Сопротивление утечки в наших экспериментах обычны было порядка 50 Мом. Исходя из этого, в обратную связь преобразователя ток-напряжение ставили сопротивление 100 Мом. Зто обеспечивало уровень шумов порядка 2-3 пА (среднеквадратичная величина, при полосе регистрации порядка 10 кГц). Уровень инструментальных шумов операционного усилителя (574УДІ) как и в случае перфузии клеток не превышал тепловых шумов. Амплитуда измеряемых натриевых токов достигала 500 пА, и это обеспечивало достаточно хорошее отношение сигнала к шуму.Для получения наиболее наглядного результата - 64 предположим вначале, что большая часть мембраны "прозрачна" для протекающего тока. В этих условиях передаточная характеристика измерительного тракта вместе с исследуемой мембраной будет: (здесь уже сделаны необходимые упрощения, исходя из реальных значений параметров). Для того, чтобы разложить знаменатель на множители, проверим выполнение достаточных условий (в предположении, что применяется быстродействующий операционный усилитель с полосой 15 МГц):
Как видно, условия выполняются ж ошибка аппроксимации не превышаетВ результате, передаточная характеристика представляется в виде:Главный полюс, в отличие от того, что мы имели при методе внутриклеточной перфузии, определяется уже не параметрами исследуемого объекта, а харатеристиками измеряющего прибора: і і (1 Cf Отклонение потенциала "виртуальной земли" от нулевого ровня на больших временах, определяемых наиболее изкочастотным полюсом можно оценить как:
Для быстродействующего усилителя эта ошибка ренебрежимо мала, но для усилителя с Т = I мкс она будет же значительна. Если учесть, что она спадает с постоянной ремени 7\7 . .,: 20 - 30 мкс, то легко сделать вывод, что для змерения натриевых токов такой усилитель не пригоден.
Анализ работы преобразователя ток-напряжение с учетом элной эквивалентной схемы клетки, расположенной в поре рисоски (рис ..Л....), проводился с помощью численного нтегрирования дифференциальных уравнений на ЗВМ. На рис . . Л... показан переходной процесс установления потенциала а входе и на выходе преобразователя ток-напряжение при эреключении потенциала в присоске (точка А) на 100 мв. ривые с индексами I и 2 соответствуют усилителям с астотой единичного усиления »Тт = 15 Жц (рекомендуемый силитель) и 5 МГц (наиболее распространенный усилитель).
Измерение токов через одиночные каналы
Основным ограничением, не позволяющим увеличить разрешающую способность по току при применении метода микроотведения, описанного выше, является низкое сопротивление утечки. При сопротивлении утечки порядка 50 Мом его тепловой токовый шум составляет 2-3 пА (среднеквадратичное значение) при полосе регистрации порядка 10 кГц. При этих условиях сама постановка вопроса о создании высокоразрешающего низкошумящего регистратора тока не имеет смысла, прежде всего необходимо уменшить утечку. Способ уменьшать утечкубыл описан в Оказалось, что если использоватьстеклянные микроприсоски с оплавленным кончиком диаметром меньше І мкм и присасываться под давлением порядка 30 см водного столба, то через некоторое время после начала присасывания (от нескольких секунд до нескольких минут) утечка самопроизвольно скачком падает, сопротивление утечки составляет при этом влечины пордка десятков гигом. Появление возможности измерения токов с малыми шумами, естественно, привело к необходимости разработки соответствующих регистраторов. Основная трудность заключается в соответствующем подборе входных элементов операционного усилителя. Как указывалось выше, необходимо подобрать входные полевые транзисторы, которые имели бы малый ток утечки (и соответственно малый дробовой шум, шум по току) и высокую крутизну (и соответственно малый шум по напряжению). Крутизна полевого транзистора, это величина регулировка которой вне возможностей экспериментатора, но ток утечки сильно зависит от режима работы транзистора. При надлежащем выборе напряжения между стоком и истоком (т.е. при надлежащем выборе тока канала) можно резко снизить ток утечки затвора практически без потерь в крутизне (Третьяков с соавт. 1972). Практическая проверка показала, что можно снизить ток утечки промышленных транзисторов (таких как КПС 104, КП 303, КП 307) до величин ниже І пА. В использованном в настоящей работе сдвоенном полевом транзисторе 2.....18 (Тошиба, Япония) при токе канала порядка 2 мА ток затвор-канал сводился к 0,1 пА. При этом крутизна прибора оставалась на уровне 5 мА/в.
Шумовые характеристики (приведенные ко входу) у такого прибора оцениваются как: - 71 Частота, на которой инструментальный шум по напряжениюіревьісит сумму дробового и теплового шума по току,доставляет: С До этой частоты преобладают тепловые шумы реситора в обратной связи преобразователя ток-напряжение. Суммарный Зэоновый шум при полосе регистрации порядка 5 кГц (среднеквадратичное):Для исследования переходных процессов при переключении командного потенциала примем в качестве типичных следующие значения параметров схемы и объекта: проходная емкость между электродами, = I Мом, сопротивление электролита в присоске, = 5 пФ, паразитная входная емкость усилителя, = 10 Гом, сопротивление в обратной связи, =0,1 пФ, паразитная емкость в обратной связи. Подставив эти значения в формулу /2/, получаем: Конкретных значений времени единичного усиления Т мы не подставляем, с тем чтобы исследовать качество переходных процессов в зависимости от быстродействия училителя. Широко используемый для этих целей) операционный усилитель ВВ 3523 (США) имеет полосу единичного усиления порядка 0,6 МГц, что соответствует времени единичногоусиления Т = 0,3 мкс. Как легко убедиться, при таких значениях выполняются достаточные условия:позволяющие разложить знаменатель передаточной функции на простые множители:Ошибка аппроксимации при этом не превышает:Эта ошибка спадает по экспоненте с постоянной времени .... и достигает уровня:Далее отклонение спадает до нуля с постоянной времени, определяемой главным полюсом:
Соответственно, на выходе измерителя тока получим двухэкспоненциальныи "емкостной ток" с теми же постоянными времени. Схема восстановления высокочастотных компонентов тока в этом случае только устранит внешний эффект, емкостной ток на выходе укоротится, но ошибки фиксации потенциала останутся. Такой преобразователь может найти применение при исследовании медленных ионных токов со временами активации -порядка нескольких миллисекунд. Для быстрых натриевых токов был разработан преобразователь ток-напряжение, показанный на рис...... Здесь первый каскад - 73 образован каскодным включением сдвоенных транзисторов ТІ и 12. Зто позволяет избежать ответвления тока канала полевых транзисторов во входную емкость затвор-сток (эффект Миллера, который приводит к увеличению эффективной паразитной емкости в КІ раз, где КІ коэффициент усиленияпервого каскада КІ = ). Передаточная характеристикапервого каскада:
