Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Матжатические методы исследования популяций 12
1.1. Математические модели популяций в биологии 12
1.2. Способы изучения внутренней структуры уклеточной популяции и процессов, фрис ходящих в клетках 20
Глава 2. Определение параметров процессов, происходящих в клетках суспензионной клеточной популяции 27
2.1. Исследование динамики численности клеточной популяции в экспоненциальной фазе роста 27
2.2. Определение параметров процессов, происходящих в клетках популяции, находящейся в стабильной фазе роста 53
2.3. Определение коэффициентов рождаемости, смертности и возрастной структуры клеточной популяции 61
2.4. Оценка правдоподобия выявляемых параметров 71
Глава 3. Расщепление кривой численности клеточной популяции, как способ изучения ее гетерогенности 96
3.1. Структурные ряды, как средство описания возможных путей увеличения численности клеточной популяции 97
3.2. Распределение клеток популяции по траекториям их клонов 108
3.3. Определение количества веществ, приходя щихся на отдельные клоны клеток 138
Глава 4. Применение. предложенных математических методов исследований к реальным клеточным популяциям 143
4.1. Определение возрастной структуры клеточной популяции в стабильной фазе роста 143
4.1.А. Определение возрастной структуры популяций брюшнотифозных бактерий штаммов ТуА и Ту2 4446 143
4.1.Б. Проверка предложенного способа определения возрастной структуры клеточной популяции 148
4.2. Выявление динамики репродукции вируса в клетке в зависимости от ее возраста 168
4.3. Расщепление кривой динамики численности клеточной популяции на траектории роста клонов клеток 184
4.3.А. Расщепление кривой динамики численности клеточной популяции Paramecium aurelia на траектории роста клонов клеток популяции при At f 184
4.3.Б. Расщепление кривой динамики численности клеточной популяции брюшнотифозных бактерий - штамм ТуА на траектории роста клонов клеток популяции при 197
Глава 5. Обсуждение результатов исследований 206
Выводы 220
Литература 222
- Способы изучения внутренней структуры уклеточной популяции и процессов, фрис ходящих в клетках
- Определение параметров процессов, происходящих в клетках популяции, находящейся в стабильной фазе роста
- Определение количества веществ, приходя щихся на отдельные клоны клеток
- Определение возрастной структуры популяций брюшнотифозных бактерий штаммов ТуА и Ту2 4446
Введение к работе
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы» В принятом постановлении ХХУІ съезда КПСС "Основные направления экономического и социального развития СССР на 1981 - 1985 годы и на период до 1990 года" была указана необходимость сосредоточить усилия на познании механизма физиологических, биохимических, генетических и иммунологических процессов жизнедеятельности человека. В постановлении говорится и о том, что в микробиологической промышленности необходимо осуществить мероприятия по ускоренному развитию производств на основе микробиологического синтеза и получению культур полезных микроорганизмов.
В связи с необходимостью дальнейшего развития фундаментальных
исследований в биологии важное значение имеет разработка новых и усовершенствование существующих методов изучения биологических объектов. Исследования, связанные с изучением клеток и клеточных популяций, являются одним из необходимых направлений в процессе познания живой материи. Изучение клеток и клеточных популяций позволяет глубже вникнуть в механизм физиологических, биохимических, генетических и других процессов, происходящих в живом организме.
Для наиболее глубокого изучения клеток и клеточных популяций, наряду с другими методами исследований все чаще применяют математические методы, сущность которых сводится к количественной обработке эмпирических данных и созданию математических моделей с выдвижением новых теоретических положений.
Ввиду того, что измерение параметров процессов, происходящих в клетках и в клеточных популяциях, представляет собой большую сложность, а во многих случаях неосуществимо, необходимо разви-
вать математические методы исследований, которые позволяли бы заменять приборы, создание или приобретение которых на данном этапе затруднено. Для осуществления данной цели можно использовать так называемые обратные задачи, в которых по физическому полю определяются его источники.
В динамической теории клеточных популяций обратные задачи должны занять видное место при изучении внутренней структуры клеточных популяций. Спектр обратных задач в динамической теории клеточных популяций весьма широк. В исследованиях, связанных с выявлением процессов, происходящих в клетках и клеточных популяциях, обратные задачи во многих случаях являются единственным средством определения интересующих нас параметров. Например, определение параметров метаболических процессов клетки по кривой динамики численности клеточной популяции и кривой динамики концентрации веществ, приходящихся на суспензионную клеточную популяцию; выявление распределения клеток популяции по траекториям роста их клонов с использованием за входной параметр кривой динамики численности клеточной популяции и т.д.
Основным назначением обратных задач в динамической теории клеточных популяций, по нашему мнению, является выявление по доступным параметрам клеточной популяции малодоступных параметров или параметров, измерение которых на сегодняшний день неосуществимо. Обратные задачи, как и другие задачи, связанные с погрешностью измерений, сводятся к некорректным задачам со всеми вытекающими трудностями.
Целью настоящей работы явилось создание математических методов изучения клеточных популяций суспензионных культур микробов, суспензий стабильной линии клеток человека, животных и растений, а также изучения процессов, происходящих в клетках этих популяций путем выявления трудноизмеримых параметров по более доступ-
ным параметрам - кривой динамики концентрации вещества, приходящегося на клеточную популяцию и т.д., т.е. по так называемым "макропараметрам" популяции.
Целью работы является также обоснование возможности унификации и автоматизации исследований указанных клеточных популяций и клеток на основе предлагаемых математических методов.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
Исследовать и выявлять динамические характеристики, присущие экспоненциальной фазе роста (ЭФР) суспензионной культуры микробов, суспензии стабильной линии клеток человека, животных и растений.
Построить математическую модель для определения параметров рождаемости, смертности и возрастной структуры клеточной популяции по кривой динамики численности клеточной популяции (КДЧКП) при гипотезе стационарности среды.
Создать способ определения параметров процессов, происходящих в течение клеточного цикла в клетках популяции, находящейся в ЭФР.
Создать способ выявления распределения клеток популяции по траекториям численности клонов этих клеток.
Показать возможность определения динамики количества вещества, приходящегося на отдельные клоны клеток, по КДЧКП и кривой концентрации вещества, приходящегося на клеточную популяцию.
Научная новизна.
I. Исследованы динамические характеристики ЭФР, присущие суспензионной культуре микробов, суспензии стабильной линии одиночных клеток человека, животных и растений. Показано, что традиционное описание экспонентой кривой динамики численности клеточной популяции в ЭФР не отражает изменения возрастного состава популя-
ции, поэтому предложены новые соотношения для дискретного и непрерывного случаев описания КДЧКП и удельной скорости роста, в которых учитывается зависимость БДЧКП от возрастной структуры популяции.
Предложены формулы для определения возрастной структуры клеточной популяции, находящейся в ЭФР, по ІЩЧКП, удельной скорости роста, возрастной структуре предшествующего или последующего моментов времени.
Показано, что в течение всей ЭФР клетки популяции в принципе не могут иметь одинаковую длительность клеточного цикла, как это принято считать.
ЭФР разделена на три составляющие фазы роста, названные: первой переходной фазой роста (І-ПФР), второй переходной фазой роста (П-ПФР) и стабильной фазой роста (СФР), расположенной между этими фазами и в течение которой клетки популяции имеют одинаковую длительность клеточных циклов.
Предложен индекс гомогенности.длительностей клеточных циклов (ИГДКЦ), являющийся показателем степени гомогенности длительностей клеточных циклов.
Предложен способ определения параметров процессов, происходящих в клетках популяции находящейся в СФР.
Построена модель, указывающая на принципиальную возможность определения параметров рождаемости, смертности и возрастной структуры клеточной популяции по КДЧКП при гипотезе стационарности среды.
Предложены функционалы правдоподобия (ФП), показывающие достоверность определения возрастной структуры клеточной популяции в СФР и достоверность выявленной динамики параметра процесса, происходящего в клетке в течение клеточного цикла.
Предложен и исследован, так называемый, структурный ряд
Sn , описывающий множество возможных путей увеличения численности популяции к моменту (п при одной исходной клетке в с0 (ВПУЧПу).
Предложен способ определения распределения клеток популяции по траекториям их клонов или ВПУЧПу.
Показана возможность определения динамики количества вещества, приходящегося на отдельные клоны клеток, по ЕДЧКП и кривой концентрации вещества, приходящегося на клеточную популяцию.
Предложен ФП для определения достоверности выявленной динамики количества вещества, приходящегося на отдельные клоны клеток.
Практическая ценность.
На основании результатов проведенных исследований, разработан комплекс математических методов, пригодных для исследования клеточных популяций. Так, для изучения суспензионных культур бактерий, суспензий стабильной линии одиночных клеток человека, животных и растений предложен метод обнаружения на КДЧКП этапа роста популяции, в течение которого клетки имеют одинаковую длительность клеточных циклов; метод определения в СФР и П-ПФР распределения клеток популяции по возрасту; метод определения динамики синтеза веществ в клетке на протяжении клеточного цикла; метод определения зависимости интенсивности синтеза вируса в клетке от ее возраста в момент инфицирования; метод определения геометрических размеров клетки в зависимости от ее возраста и т.д.
Для изучения вышеперечисленных клеточных популяций практическое значение имеют определение распределения клеток популяции по траекториям их клонов и выявление динамики синтеза веществ клетками отдельных клонов популяции. Эти методы могут быть использованы и при изучении иммунокомпетентных клеток.
Одно из преимуществ предложенных методов заключается в том,
что не требуется применения уникальной дорогостоящей аппаратуры, методы могут быть использованы в любой, даже слабо оснащенной лаборатории.
Алгоритмы, приведенные в работе, позволяют создать автоматизированные комплексы для измерений вышеназванных параметров. Такие комплексы можно создать на базе отечественной аппаратуры, например, комплекса прижизненного анализа микроорганизмов (ПРИАМ), разработанного в Институте биологической физики АН СССР или аппаратурного комплекса управляемого культивирования и прижизненного морфометрического анализа клеток КУК-І, изготовленного Опытным производством Института проблем онкологии им. Р.Е.Кавецкого и ЭВМ СМ-4 или аналогичных вычислительных машин.
Предлагаемые методы целесообразно применять в микробиологической промышленности для выявления активности клеточной популяции в процессе непрерывного и периодического культивирования при микробиологическом синтезе.
Данные, полученные при помощи предлагаемых методов могут быть использованы в биологии и медицине.
В процессе работы над диссертацией в 1984 г. были утверждены пять рационализаторских предложений (Ш 171, 172, 173, 174, 175), принятых для внедрения в Институте клинической и экспериментальной медицины СО АМН СССР.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Всесоюзной научно-технической конференции "Радиоэлектроника, физика и математика в медицине и биологии" в г.Новосибирске 1978 г., 3-й конференции молодых ученых Института клинической и экспериментальной медицины СО АМН СССР в г.Новосибирске 1979 г., семинаре лаборатории спорообразующих бактерий Института микробиологии АН Арм. ССР в г.Абовяне 1979 г., Первом всесоюзном совещании "Культивирование клеток животных и человека" в г.Цущино 1982 г.
Материалы диссертации докладывались на совместном заседании лаборатории вирусологии ИКЭМ СО АМН СССР, лаборатории процессов и аппаратуры культивирования клеток ШФ АН СССР, отдела клинической и экспериментальной иммунологии ИКЭМ СО АМН СССР и отдела математических методов в медицине ВЦ СО АН СССР в г.Новосибирске 2.10.1980 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ и две в печати.
Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав и выводов, изложенных на 152 страницах машинописного текста, 38 рисунков (43 стр.) и 22 таблиц (26 стр.). Библиография включает 119 наименований (12 стр.).
Соавторство. Некоторые вопросы, связанные со структурными рядами, автор исследовал совместно с доцентом кафедры высшей математики ЕрГУ Г.А.Тонояном. В работе использовались экспериментальные данные, любезно предоставленные д.т.н. Э.И.Лежневым и к.т.н. Ю.В.Кошевым, сотрудниками ИБФ АН СССР.
Программы для ЭВМ написаны: Н.П.Карасевым, с.н.с. ИКЭМ СО АМН СССР - для исследования структурных рядов; Т.А.Авдеевой, ст.инженером ВЦ НИИЖТа и Э.Г.Старцевой, студенткой Томского политехнического института - для выявления и анализа динамических характеристик клеточной популяции, и определения зависимости интенсивности синтеза вирусов в клетке НеЬа от ее возраста в момент инфицирования вирусом Коксаки Вт.
ЧАСТЬ I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Способы изучения внутренней структуры уклеточной популяции и процессов, фрис ходящих в клетках
На современном этапе развития биологии и медицины существенное значение имеет изучение процессов, происходящих в клетке. Процессы, происходящие в клетке, отражают ее состояние как в норме, так и в патологии. Изменение метаболического состава клетки зависит от возраста клетки и от состава окружающей ее среды, а нормальное функционирование клетки в целом обеспечивается геномом - наследственной памятью клетки. Процессы, происходящие в клетке, имеют сложную взаимосвязь, и выявление как самих процессов, так и их взаимосвязей может дать ответ на многие вопросы, существующие в биологии. Способы изучения процессов, происходящих в клетке, можно условно разделить на две категории. К первой категории относятся способы непосредственного изучения отдельной клетки-цитофотометрия, радиоавтография, микроспектрометрия, электронная микроскопия и т.д. Используя различные красители, реагирующие специфически с компонентами клетки, такими как белок, ДНК, РНК и др., можно, применяя микрохимические методы, определить концентрации этих веществ в клетке. Ко второй категории относятся различные способы синхронизации клеточных популяций, при этом делается предположение, что во всех клетках популяции одновременно происходят одни и те же процессы (Зуссман М., 1977). Сущность методов синхронизации роста клеточных популяций заключается в следующем - клетки одновременно делятся, синтезируют ДНК и вступают в митоз также одновременно и т.д. до нового совместного деления, т.е. клеточная популяция функционирует как одна укрупненная клетка, и чем больше численность популяции, тем менее чувствительные исследования необходи- мы для изучения процессов, происходящих в клетке. Синхронизированные клеточные популяции широко применяются для исследования биохимии и физиологии клеток.
Существующие способы изучения процессов, происходящих в клетке, имеют следующие недостатки: а) при непосредственном изучении отдельных клеток необходимо применять высокочувствительные методы исследования, которые обыч но осуществляются дорогостоящей аппаратурой. Выбор красителей, применяемых для определения наиболее важных компонентов клетки ограничен. Трудности возникают не только при определении концент рации различных клеточных компонентов, но и при установлении воз раста клетки, так как по морфометрическим признакам различать клетки близкие по возрасту во многих случаях невозможно, что в свою очередь затрудняет определение динамики изменения количест ва компонентов клетки в течение клеточного цикла; б) любой метод синхронизации роста клеточных популяций в той или иной мере воздействует на процессы, происходящие в клетках популяции, следовательно, данные о физиологии и биохимии клеток, полученные из синхронных популяций, будут расходиться с реальны ми параметрами процессов, происходящих в клетках несинхронизиро- ванной популяции. В связи с этим рекомендуется применять методы синхронизации, минимально влияющие на метаболизм клетки (Печур- кин Н.С., Терсков И.А., 1975). Следует отметить, что очень важно установить отличие физиологических циклов развития популяции кле ток синхронизированных искусственно, от циклов развития популяции при естественной синхронизации, но осуществить это в настоящее время очень сложно (Работнова И.Л., Позмогова И.Н., 1979). Таким образом, вопрос об определении степени влияния на метаболизм клетки факторов синхронизации роста остается открытым. Один из многих методов синхронизации клеточной популяции - отбор из асинхронных культур клеток определенного размера.
Предполагают, что отобранные клетки принадлежат к одному возрастному классу и, следовательно, должны одновременно делиться. Клетки разных возрастов могут иметь одинаковые размеры, так как прямая зависимость между размером клетки и ее возрастом наблюдается лишь у некоторых видов бактерии (Коротяев А.И., 1973). Достичь "идеальной" синхронизации роста клеточной популяции практически невозможно. Расхождение клеток по возрасту в синхронизированной популяции достигает обычно трети периода клеточного цикла (Баснакьян И.А., 1965; Suarez et ai., 1975), поэтому основное условие синхронизации - одновременность протекания процессов во всех клетках популяции (Зуссман М., 1977) - в экспериментах не удовлетворяется. И, наконец, отметим, что применение способа синхронизации роста клеточной популяции в некоторых случаях может вообще противоречить целям эксперимента. Таким образом, известные способы изучения процессов, происходящих в клетке, обладают существенными недостатками, поэтому целесообразны попытки разработать новые способы для изучения этих процессов, которые были бы свободны от ряда указанных недостатков. Определение возрастной структуры клеточной популяции является дополнительным средством популяционных исследований, позволяющим определить внутренние параметры непрерывно размножающихся клеточных популяций. Наиболее доступно определение возрастной структуры дрожжевых популяций ( Вегад , 1969; Тушкова Г.И., 1978; Тушкова Г.И., Печуркин Н.С., 1978). В дрожжевых популяциях размножение идет последовательным почкованием. На стенке материнской клетки в тех местах, где материнская и дочерняя клетки были прикреплены друг к другу, образуются родовые шрамы.
Определение параметров процессов, происходящих в клетках популяции, находящейся в стабильной фазе роста
Недостатки способов изучения процессов, происходящих в клетках, рассматривались в разделе 1.2. Покажем, что имеется возможность изучения процессов клетки иным, более доступным способом. Если клеточная популяция в течение - tp+м =лгд находится в СФР и в клетках одинакового возраста происходят одни и те же процессы и пусть oc j - численность / -возрастной группы с=/,к в момент ij \P+ j& 11-м и /у- количество вещества/7, приходящегося на популяцию /j , известны. Тогда можно определить /} -количество вещества Р , приходящееся на клетку возраста L . Под термином "вещество" подразумевается не только вещество в буквальном смысле этого слова, но и любой другой параметр, снимаемый с популяции. Изменение количества вещества, приходящееся на популяцию, за промежуток времени J t/ - tj-+ -у выражается через соотношение где М- = Pt t "Pi , Рс - количество вещества Р в клетке возраста с , следовательно, система А линейных уравнение с А неизвестными (2.35) при определителе, отличном от нуля, обладает решением, и при том только одним. Это решение получается по формулам (2.36), т.е. по правилу Крамера (при А 9- 5 целесообразнее применять метод исключений по схеме Гаусса) Примечание:
Если кривая роста численности клеточной популяции СФР описывается соотношением (2.2), то возрастную структуру популяции любого момента t/ возможно описать через возрастное распределение популяции Лр+х соотношением Отсюда следует, что в системе уравнений (2.35) при СФР популяции все уравнения линейно зависимы - умножением строки JC/,p+ , на p/ можно получить j+f-p -к- строку определителя Д системы (2.35) ОС, т.е. определи-тель dzO . В этом случае ,- с=/,к определить невозможно. Если система уравнений (2.35) совместима, то следует, что и количество вещества дР/ , приходящегося на клетки популяции на отрезке времени /+t - j , можно выразить через Л Р/э+ соот-шением Л Р/ =J j л Рр+ . Если это соотношение не удовлетворяется, следует, что система (2.35) не совместима, и клетки популяции в СФР, относящиеся к одинаковой возрастной группе, не идентичны по происходящим в них процессам, иными словами - при росте кривой численности в СФР, удовлетворяющей соотношению (2.2), кривая количества вещества, приходящегося на клетки популяции, должна описываться соотношением где fitk sjt - к . Необходимым условием идентичности процессов, происходящих в клетках одинакового возраста популяции СФР, независимо от вида кривой роста численности, является соотношение Биологические следствия.
В реальном эксперименте для определения рг f с - /, k , по предлагаемому способу, необходимо измерять количество вещества Р , приходящегося на клетки проб, отобранных из клеточной суспензии в tj, j-f,k моменты. Отобранная проба сразу же фиксируется специфическими веществами, клетки популяции прекращают развиваться, гибнут, при этом синтез вещества Р в клетках прекращается, и количество вещества в клетках соответствует количеству вещества в момент взятия проб. После этого пробы клеточных суспензий подвергаются центрифугированию, клетки оседают на дно пробирок, надосадочная жидкость сливается, а осевшие клетки подвергаются биохимическому анализу для определения количества вещества Р , содержавшегося в клетках. Затем полученные значения пересчитываются на всю клеточную популяцию. При необходимости определения динамики количества вещества Р, поглощенного клеткой или выделившегося из клетки, в течение клеточного цикла, следует в системе линейных уравнений (2.35) свободные члены ДР/, . . . rArj+x-f заменить на Л fyc/ =fyf,cfi "// ,с/ ., где/ ,сА количество вещества/2, содержащегося в среде клеточной культуры. Аналогичным способом можно определить уровень проницаемости клеточной мембраны для вирусов в зависимости от возраста клетки, при условии, что вирус, проникший в клетку, вызывает ее лизис через определенный промежуток времени. Из суспензии берутся пробы в к последующих момента времени и сразу же заражаются вирусом. Пробы должны браться из популяции находящейся в СФР. В зараженных пробах через определенные промежутки времени определяется численность живых клеток. Промежуток времени to -период между заражением проб и определением в них числа живых клеток должен быть таким, чтобы вирусы лизировавших клеток не успели повторно вызвать лизи-рование уже других клеток, to должно задаваться экспериментатором предварительно, обычно, этот отрезок времени без особых затруднений определяется эмпирическим путем. Зная количество живых клеток в контрольных и в зараженных пробах, можно определить их разность для tf промежутка времени, прошедшего от момента заражения культуры. После этого на основе полученных данных составляется система линейных уравнений (2.41), из которой и определяется уровень проницаемости клеточной мембраны для вирусов в различные периоды клеточного цикла.
Определение количества веществ, приходя щихся на отдельные клоны клеток
После установления чрезвычайной гетерогенности лимфатических клеток основным направлением исследовании в иммунологии стало изучение дифференцировки лимфатических клеток (І уревич А.Е. с соавт., 1978). Одновременно возникает необходимость исследования изменений, происходящих в клетках при дифференцировке, например, изменение интенсивности синтеза и секреции антител и т.д. В этой связи целесообразно изучать зависимость степени дифференцировки клеток клонов от активности пролиферации. Известно, что клеточная популяция иммунокомпетентных клеток является гетерогенной относительно антигена, т.е. существует определенная избирательность, благодаря которой численность клонов некоторых клеток при наличии антигена начинает резко возрастать, что обусловлено интенсивностью пролиферации и дифференцировки клеток этих клонов.
Напршлер, в развитии В-лимфоцита можно проследить следующие основные этапы: стволовая клетка-стволовая клетка лимфоидного ряда-предшественник В-лимфоцитов-делящаяся переходная клетка-нулевая клетка-незрелый В-лимфоцит-зрелый В-лимфоцит (Петров Р.В. с соавт., 1978). Сам факт пролиферации клеток еще не является достаточным условием для их дифференцировки, так как пролиферация может происходить и для самоподдержания. При дифференцировке пролиферация клеток должна сопровождаться изменением интенсивности синтеза и секреции веществ, определение которых затруднено в связи с несовершенством экспериментальных методов. Поэтому целесообразно создать формализованный аппарат, который в некоторых случаях мог бы дополнить традиционные способы исследований пролиферации и дифференцировки клеток лимфоидного ряда, используя при этом наиболее доступные параметры (Каза- рян Л.С, 1983).
Обозначим количество вещества, синтезированного всей клеточной популяцией от t0 до п момента через где Ue n количество клеток из исходной популяции Ло , клоны которых развиваются по f -ой траектории структурного ряда Sn , Qen количество вещества, синтезированного клоном клетки, динамика которого соответствует в -ой траектории ряда Sn . Количество вещества С/л определяется обычными доступными биохимическими методами, Ue п - определяется при расщеплении КДШШ на составляющие клоны, а деп - неизвестно. Для определения ?е/? } s/t/VfS ) необходимо поставить, по крайней мере, /V(Sn) экспериментов, чтобы была возможность составить систему линейных уравнений, из которой можно определить лл : где Ue/} /n - является -ым коэффициентом /п -го уравнения. Данная система имеет единственное решение, если определитель /\/(Зл)-то порядка - А не равен нулю. Если =0и среди Aff nt. . . ,Д$Єіп ,- Afrts j, есть не равные нулю {Д0еп - определитель, полученный из А , заменой элементов 4 //7// ,..., ие /)/п ,.. ., U ,„f/,rSa, ) соответствующими свободными членами 6 / ( /?,/п ,.. , /i,A/fSn) , то система не имеет решения, например, может оказаться, что, по крайней мере, в двух экспериментах из Л/(»/ имеются одинако вые КДЧКЇЇ, но с различными динамиками синтезированного вещества этими популяциями, т.е.: /У/,т =/ У,т+р , /=&,л /n+fi-S/VlSn a Qn,m Q»,m+P . Если А =Д$,іЛ = = %„ = " W, sO и один из миноров -го порядка определителя А не равен нулю, например, минор, получаемый вычеркиванием т -ой строки из с -го столбца, то т -ое уравнение является следствием остальных /VfS/i) -/ уравнений, поэтому необходимо /п -ое уравнение заменить уравнением, основанным на параметрах другого эксперимента, кроме экспериментов, параметры которых использовались для составления системы уравнений, и решить обновленную систеглу линейных уравнений. Для определения й»„./ , К - ) , необходимо решить систему линейных уравнений и поставить, по крайней мере, Щ „.}) экспериментов, но целесообразно из экспериментов не отбирать по пораметрам которых определялись бы неизвестные Qe,n
Определение возрастной структуры популяций брюшнотифозных бактерий штаммов ТуА и Ту2 4446
Экспериментальные КДЧКП штаммов ТуА и Ту2 4446, используемые в данном разделе, приведены в работе И.А.Баснакьян (1965). На рисунках 4.1 и 4.2 изображены динамики размножения брюшно-тифоз-ных бактерий штаммов ТуА и Ту2 4446. Культивирование микроорганизмов производилось в жидкой питательной среде (казеиновый бульон) с аэрацией, которая достигалась вращением колбы с культурой в аппарате для встряхивания, помещенном в термостате при 37. Экспоненциально растущую популяцию при более высоком содержании клеток 200 - 300 млн затем культуру разводили свежей средой, мл предварительно нагретой до 37 , в результате чего число микробных клеток снижалось до 2-15 млн Такое разведение культуры мл свежей питательной средой практически представляет собой посев популяции в свежую питательную среду, после чего, обычно клеточная популяция находится в фазе задержки деления - лаг-фазе. В данном случае лаг-фаза длится около 40 мин, а затем клеточная популяция начинает размножаться аналогично синхронно делящимся культурам до нескольких делений. В реальном эксперименте невозможно синхронизировать клеточную популяцию таким образом, чтобы все клетки делились одновременно, хотя длительность клеточного цикла клеток может быть почти одинаковой, т.е. всегда существует гетерогенность клеток популяции по возрасту. Динамики размножения популяций брюшно-тифозных бактерий фактически являются динамиками, соответствующими КДЧКП ЭФР, и отличаются лишь специфическим распределением клеток по возрасту, что и приводит к ступенчатости КДЧКЇЇ.
Для определения численности клеточной популяции штамма ТуА использовалось соотношение где ujc - длина в милиметрах (мм) прямого отрезка, соединяющего на рис. I, приведенного в работе И.А.Баснакьян (1965), точку ? на оси t с точкой, соответствующей /\ , 135,5 мм - длина отрезка по оси X , который соответствует численности 2 10 клеток. А для штамма Ту2 4446 численность определяется по соотношению 1,498- . Если интервалы между взятием проб для определения численности популяции не превышают ді , то ее численность Х ; в данном интервале с 1_/, Лд+$ J соответствует точке пересечения прямой, соединяющей И/ Л/f s и прямой, восстановленной из точки tg+j » S J под углом 90 к оси Г , т.е. в интервале 1 /J предполагается равномерное приращение численности популяции. Данное предположение не приводит к существенным ошибкам при определении А? / » так как за такие, относительно короткие промежутки времени, обычно не наблюдается сильное колебание численности популяции. По этому принципу определялась численность популяции для моментов времени, в которые счет численности популяции не производился (рис. 4.1 и рис. 4.2 соответственно табл. 4.1 и табл. 4.2). На КДЧКП для штаммов ТуА и Ту2 4446 крестиками обозначены точки КДЧКП, соответствующие численности популяции, и эти численности определялись вычислениями, при которых использовались значения соседних точек КДЧКП, которые были найдены экспериментальным путем. В табл. 4.1 и табл. 4.2 значения численности популяции, найденные путем вычислений , подчеркнуты.
Определим возрастную структуру популяции брюшно-тифозных бактерий - штамм ТуА в 50 55 60 "" моменты времени, а по значениям jSjr % (2.41) и eij % (2.66) выявим момент роста популяции из t go» t 55 и 60 п и К0Т0Р0М клетки имеют наибольшую гомогенность относительно длительностей клеточного цикла, т.е. найдем минимальное значение ИГДКЦ -fitmin% В данном случае при О = 30 мин берется / = 6, а А?= А =5 мин. Распределение клеток популяции по возрасту в этом случае можно определить по формуле (2.10)
