Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор жтературшх данных 9
1.1. Строение клеточных мембран. 9
1.2. Роль структурного состояния липидного компонента в определении функциональных свойств клеточных мембран. 15
1.3. Биофизические и биохимические показатели опухолевых клеток в процессе развития опухолей. 21
Глава 2. Материалы и методы исследований 32
2.1. Получение суспензий клеток. 32
2.2. Флуоресцентные зонды. 34
2.3. Измерение внутриклеточного рН с помощью флуоресцеин-диацетата. 40
2.4. Методика определения спектрально-флуоресцентных параметров клеточных суспензий. 46
2.5. Квалификация использованных реактивов. 47
2.6. Препараты для модельных исследований. 49
2.7. Определение содержания продуктов ПОЛ в клетках 49
2.8. Статистическая обработка результатов. 49
Глава 3. Физико-химические характеристики клеток лимфшдои ткани 50
3.1. Спектрально-люминесцентные свойства клеток и клеточных мембран в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. 50
3.2. Использование флуоресцентных зондов для исследования структурно-функциональных превращений мембран лимфойдных клеток. 64
3.3. Биохимические показатели процессов переююного окисления липидов в клетках лимфоидной ткани и их связь с физико-химическшли характеристиками клеток. 81
3.4. Изучение факторов, определяющих величину внутриклеточного рН в клетках лимфоидной ткани. 93
3.5. Температурноиндуцированные изменения текучести клеточных мембран и pHj в нормальных и опухолевых клетках. 105
Глава 4. Структурно-функциональные изменшя клеток жифсидной ткани,связанные с изменении скорости пролиферащм 116
4.1. Физико-химические характеристики клеток селезенки мыши при лейкозе . 116
4.2. Сравнительная характеристика физико-химических свойств лимфоцитов периферической крови человека в норме, при лейкозе и при действии фитогемагглютенина. 127
4.3. Структурно-функциональные изменения клеточных мембран в процессе роста асцитной гепатомы мышь 137
4.4. Структурно-фушщиональные изменения мембран клеток лимфомы Беркитта в процессе культивирования. 142
4.5. Сравнительная характеристика процессов в клетках трансформированной тканії и в развивающихся клеточных популяциях. 150
Заключение 159
Выводы 165
Литература 168
- Роль структурного состояния липидного компонента в определении функциональных свойств клеточных мембран.
- Измерение внутриклеточного рН с помощью флуоресцеин-диацетата.
- Использование флуоресцентных зондов для исследования структурно-функциональных превращений мембран лимфойдных клеток.
- Сравнительная характеристика физико-химических свойств лимфоцитов периферической крови человека в норме, при лейкозе и при действии фитогемагглютенина.
Введение к работе
Клеточные системы с изменяющейся скоростью пролиферации представляют собой широкий класс экспериментальных моделей. Деление клеток и его регуляция на молекулярном уровне - проблемы, решение которых актуально для многих областей медицинских и биологических наук. При непосредственном участии про-лиферативных процессов в организме протекают такие явления, как регенерация тканей, заживление ран, развитие иммунного ответа. Изменение скорости клеточной пролиферации сопровождает развитие многих паталогических процессов. Так, в последние годы сформировалось представление о том, что опухолевый рост является результатом нарушения нормальной пролиферации и диффе-ренцировки клеток / 7, 214 /. Стимуляция клеточной пролиферации рассматривается и как важный способ модификации лучевого и других видов поражения клеток / 75 /.
К настоящему времени, в основном, охарактеризованы биохимические изменения в клетках, сопровождающие индукцию и торможение пролиферации в различных клеточных системах. Показано, что особая роль в регуляции активности пролиферативных процессов принадлежит клеточным мембранам. Состав, структура и функции клеточных мембран претерпевают изменения как при ускорении, так и при торможении пролиферативных процессов. Изменение состава и структуры клеточных мембран сильно влияет на чувствительность клеток к действию пролиферогенных факторов. Как пролифе-ративнозависимые изменения могут рассматриваться некоторые изменения в количественных соотношениях клеточных компонентов и нарушения пропорциональности между различными функциональными процессами при опухолевой трансформации клеток.
Пролиферативнозависимые изменения клеточных характеристик представляют значительный интерес с точки зрения сравнения нормальных и опухолевых клеток и тканей, а также для установления критериев различий злокачественного и доброкачественного роста новообразований в организме.
Несмотря на большое число экспериментальных работ, выполненных при исследовании клеточных популяций с меняющейся скоростью пролиферации, молекулярные механизмы, определяющие скорость клеточного роста, все еще далеки от полного понимания. В значительной степени это положение связано с тем, что пролиферация клеток зависит от множества самых разнообразных факторов как специфической, так и неспецифической природы. Однако ряд клеточных характеристик изменяется в клетках сходным образом независимо от природы того или иного фактора, влияющего на скорость пролиферации. Очевидно, что подобные клеточные характеристики, которые определяются изменяющимся при пролиферации состоянием клеток, а также проблемы регуляции пролиферации могут быть изучены лишь при исследовании реакций клеток на различные пролиферогенные воздействия.
В связи с изложенным целью нашей работы явилось выявление структурных и функциональных особенностей мембран как нормальных, так и опухолетрансформированных клеток, находящихся в состояниях с различной активностью пролиферативных процессов.
Объектом исследований служили, в основном, клетки лимфоид-ной ткани. Выбор в качестве объекта исследований лимфоидной ткани обусловлен важностью пролиферативных процессов для выполнения ею иммунологической функции, способностью этой ткани к физиологической и выраженной репаративной регенерации, высокой частотой злокачественной трансформации. Кроме того, изме-
нение пролиферативной активности лимфоидных клеток легко моделируется в эксперименте.
Для регистрации реакции: лимфоидных клеток на изменение активности пролиферативных процессов применены методы собственной флуоресценции клеток С в диапазоне спектра длин волн 300-500 нм ), абсорбционного анализа и флуоресцентных зондов. В качестве основных клеточных характеристик в работе исследовали микровязкость и параметр липидного порядка клеточных мембран, измеряемые с помощью липидраетворимого зонда ДИТ, величину степени поляризации флуоресценции различающихся по локализации в клетке флуоресцентных зондов, амплитуду изменений степени поляризации флуоресценции зонда ІШС по спектру его флуоресценции, содержание в клетках ВДА-подобных и флуоресцирующих продуктов процессов ПОЛ, величину активности ионов водорода в клетках и ее изменчивость при варьировании рН среды в диапазоне 6,5-8,0,
Исследуя различные характеристики лимфоидных клеток, мы исходили из того, что между ними существуют определенные взаимосвязи. Поэтому для определения возможных причинно-следственных отношений в вариациях различных мембранных характеристик лимфоидных клеток при изменении активности пролиферативных процессов нами было исследовано влияние накопления продуктов процессов ПОЛ на структурные характеристики клеточных мембран и чувствительность рНі к изменению рН среды, а также взаимосвязь между термоиндуцированными изменениями параметра липидного порядка и активности ионов Н+ в клетках.
В результате проведенного исследования определены ( для ряда характеристик впервые ) различия между лимфоцитами, выделенными из лимфоидных тканей в норме и при опухолевой трансфор-
мации. Установлены закономерности ряда изменений исследованных клеточных характеристик в динамике развития клеточных популяций ( опухоль АГ-22а, культура клеток лимфомы Беркитта, культура лимфоцитов периферической крови человека при действии ФГА ), Модельные исследования взаимосвязи изменений биохимических и структурнонйшкциональных характеристик мембран различных клеток позволили предположить наличие между ними вполне определенных отношений подчиненности.
На основании полученных данных, а также данных литературы в работе развивается положение о зависимости между пролифера-тивной активностью лимфоидных клеток и рядом структурно-функциональных характеристик клеточных мембран. Заключено, что вследствие зависимости структурно-функциональных состояний клеток от скорости роста популяций в клетках будут осуществляться такие физико-химические механизмы регуляции состояний, которые могут усиливать действие пролиферогенных факторов, а также обеспечивать взаимосвязь между пролиферативными процессами и действием факторов, изменяющих активность обменных и синтетических процессов в клетке.
Роль структурного состояния липидного компонента в определении функциональных свойств клеточных мембран.
Физико-химические характеристики липидного бислоя оказывают решающее влияние на многие клеточные процессы, в том числе на перенос ионов и незаряженных молекул метаболитов через клеточную мембрану, на процессы, связанные с латеральным перемещением в мембране белковых рецепторов /36,19/ и т п. Сложный состав и гетерогенность мембранных систем затрудняют применение электронной микроскопии и рентгенографии для изучения мембран лимфоцитов. Поэтому исследование структуры и динамики липидного матрик-са клеточных мембран ведется, главным образом, с помощью физических методов исследования: калориметрии, электронного парамаг-нитного резонанса, ядерного магнитного резонанса, флуоресцентной спектроскопии. С помощью данных.методов исследовано влияние температуры, состава среды на структурные характеристики липидного бислоя.
К важнейшим характеристикам бислоя липидного матрикса мембраны относятся микровязкость (или текучесть - величина обратная микровязкости) и параметр липидного порядка (S„). Считается / 93 /, что текучесть и Sj характеризуют различные стороны структурной организации молекул липидов в бислое. Текучесть клеточ-1 ных мембран - величина, которая, в общем случае, характеризует 1 относительное движение компонентов мембраны. Эту характеристику рассматривают обычно применительно лишь к липидному компоненту, однако величина текучести может сильно зависеть от мембранных белков, а также характеристик среды (например, рН и концентрации различных ионов) / 222 /. Текучесть измеряется при изучении подвижности оптических зондов в мембране и характеризует усредненные гидродинамические свойства липидного матрикса / 202 /. Величина So , определяемая при изучении изменений анизотропии излучения по кривой затухания флуоресценции зонда в составе мембраны, находится в однозначной взаимосвязи с величиной угла конуса возможных вращений молекулы зонда, т.е. характеристикой, которая позволяеть судить об упаковке липидов в бислое. Поэтому, хотя между текучестью и Б для многих реальных мембранных систем установлена корреляция / 93 /, обе эти характеристики необходимы при исследовании структуры мембран.
Величина текучести и Si для мембран чувствительна к действию многих факторов как физико-химических /93,202,222/f так и к специфическим биологическим /84,112/. Можно предположить, что изменение текучести клеточных мембран может служить одним из механизмов тонкой регуляции процессов, связанных с участие м клеточных мембран. Установлено, что увеличение активности мембранных ферментов с ростом температуры, обнаруживаемое по излому аррениусовой зависимости, наблюдается в том интервале температур, в котором наблюдается резкое уменьшение микровязкости клеточных мембран или аналогичных ей величин /12,183,222/. С изменением структурного состояния липидного компонента клеточных мембран, индуцированного изменением температуры среды, обычно связывают нарушение ионной проницаемости / 12 /. Особенно сильно изменяется скорость переноса ионов через мембрану в тех случаях, когда при увеличении температуры в мембране наблюдается фазовый переход, причем это относится как к пассивной диффузии ионов по градиенту концентрации, так и к активному транспорту ионов. Увеличение скорости диффузии молекул через клеточные мембраны с уменьшением микровязкости липидного компонента отмечены для воды /213/, а также неэлектролитов / I /.
Текучесть клеточных мембран чрезвычайно чувствительна к величине относительного содержания холестерина в мембране /222/. По мнению авторов /152,153/ величина микровязкости клеточных мембран находится в однозначной зависимости от величины отношения холестерин/фосфолипиды. Наиболее быстрый рост микровязкости наблюдается при увеличении доли холестерина в диапазоне 0,2-0,8 / 153 /. Для многих клеток, в том числе для клеток лимфоид-ной ткани, значения относительного содержания холестерина попадают в этот интервал / 145 /, Следовательно, изменение содержания холестерина, также как и температура, является эффективным фактором модификации структурного состояния мембран клеток, Большая часть холестерина в клеточных мембранах находится в свободном состоянии, вследствие чего нарушение клеточных функций при увеличении или уменьшении его содержания в мембранах следует отнести за счет изменения структурного состояния липидного бислоя. Установлено, что холестерин препятствует плавлению биологических мембран, при высоких его концентрациях в мембране фазовые переходы отсутствуют в диапазоне положительных температур / 202,222 /. Аналогичный механизм может находиться в основе взаимосвязи между активностью мембраносвязанных ферментов и относительным содержанием холестерина и других липидных компонентов / 224 /.
От вязкости липидного бислоя зависит скорость процессов ПОЛ, скорость процессов обмена липидов в клеточных мембранах / 16,202/. Следует отметить, что поскольку текучесть сама в значительной степени определяется липидным составом, в том числе и содержанием продуктов ПОЛ, очевидно текучесть является только отдельным звеном в цепи взаимосвязанных факторов, регулирующих функциональную активность клеточных мембран.
Осуществление многих клеточных функций лимфоцитов предполагает перемещение белковых и липидных молекул в плоскости липидного бислоя мембраны клетки. Например, кластеризация иммуногло-булиновых рецепторов является необходимым условием для запуска процессов стимуляции лимфоцитов лектинами / 57 /. Скорость Мон-А зависимой агглютинации клеток зависит от характера распределения белковых рецепторов / 212 /, Согласно представлениям жидко-мозаичной модели организация клеточной мембраны, скорость перемещения в бислое определяется вязкостью липидного компонента, т»е. в этой модели предполагается, что при изменении текучести клеточных мембран под действием физико-химических факторов среды подвижность белковых рецепторов может сильно варьировать.
Измерение внутриклеточного рН с помощью флуоресцеин-диацетата.
Существующие методы измерения pHj. основываются на различных физико-химических принципах. Так, использование колориметрических индикаторов, обеспечивающих прижизненную окраску клеток, позволяет определять рН как цитоплазмы, так и отдельных клеточных органелл. Весьма точными являются электрометрические методы, однако они применимы только к клеткам достаточно больших размеров / 77 » 232 / Для исследования величины трансмембранного градиента рН успешно используются методы, основанные на изучении распределения ионов слабых кислот и оснований между внутри- и внеклеточной средами, однако эти методы требуют постоянного контроля за изменениями объема клеток и учета связывания индикатора клеточными структурами / 95 /.
Развитием спектрофотометрического метода определения рН;, с использованием витальных красителей является флуоресцентный метод, основанный на использовании различных флуоресцирующих красителей, проникающих в клетку, В качестве таковых применяются Ш1Ц / 141 /, пиранин / 191 /, диметилэскулетин / 60 /, ФДА. / 233 / и другие /95, 155 /. К достоинствам данного метода определения pHi следует отнести достаточно высокую точность определения рН, оперативность, отсутствие повреждений плазмолем-мы клеток, использование малых концентраций индикаторов. В нашей работе для измерений величины рН был использован наиболее распространенный рН-индикатор ФДА.
Молекулы ШДА. не несут заряда и практически не флуоресцируют в водном растворе. Вследствие электронейтральности молекулы ФДА легко проникают в клетки, диффундируя через цитоплазматическую мембрану в цитоплазму по градиенту концентрации, и подвергаются ферментативному гидролизу под действием неспецифических ацетил-эстераз с образованием флуоресцеина. Флуореецеин при рН 6,0 находится, в основном, в анионной и дианионной форме и, вследствие этого, накапливается в клетках.
Спектр флуоресценции флуоресцеина в средах с различными значениями рН различается незначительно. Спектр возбуждения флуоресценции флуоресцеина обладает ярко выраженными рН-зависи-мыми свойствами. В средах с низкими значениями рН максимум спектра возбуждения находится при 435 нм, для сред с рН 6,5 спектр возбуждения флуоресценции флуоресцеина имеет максимум при 485 нм (рис.2), Отношение интенсивностей флуоресценции при возбуждении флуоресценции флуоресцеина в полосах 485 и 435 нм находится в однозначной взаимосвязи со степенью диссоциации его молекул. В свою очередь, степень диссоциации связана с рН раствора, в котором находится флуоресцеин, уравнением Гендерсона-Хас- о где Afc и НА" — концентрации дианионной и анионной форм молекул зонда. Другие ионные формы молекулы могут быть исключены из рассмотрения, так как их концентрации невысоки, а флуоресцентные характеристики близки к характеристикам рассматриваемых форм. Для сред с рН 6,5 в результате подстановки величин А "" и НА"", полученных из соотношений, связывающих их с интенсивностью флуоресценции при возбуждении светом с длинами волн 485 и 435 нм, получаем следующее соотношение между рН раствора флуоресцеина и отношением интенсивностей флуоресценции п - Y I анионной форм флуоресцеина, у лг и fw- - квантовый выход флуоресценции флуоресцеина в кислой и щелочной средах,к - эмпирически определяемая величина, постоянная для данного вида образцов и зависящая от параметров регистрирующей установки Величину рН раствора по измеренной величине п можно определить также графически, используя для этих целей номограмму, представленную на рис.3. Точность определения рН в этом случае зависит, в основном, от точности определения величины п .
Для окрашивания флуоресцеином клеток к 2 мл клеточной суспензии добавляли 2 мкл раствора ФДА в тетрагидрофуране. После 20 мин инкубации при 30 С, в течение которых в клетках накапливается флуоресцеин (рис,4), клетки отмывали 2 раза от $ЦА и внеклеточного флуоресцеина и помещали в буферный раствор с рН 7,8 при температуре тающего льда. На рис4 представлена зависимость изменения интенсивности флуоресценции клеточных суспензий от времени после добавления ФДА, Скорость увеличения интенсивности флуоресценции растет в первые несколько минут после добавления ФДА, что свидетельствует о том, что скорость гидролиза, по крайней мере частично, контролируется процессом диффузии зонда через клеточную мембрану, С увеличением времени инкубирования увеличивается концентрация флуоресцеина в клетках, о чем свидетельствует увеличение интенсивности флуоресценции отмытых после инкубации с ФДА клеток. Однако рост содержания флуоресцеина в клетках происходит лишь в первые 20-30 мин операции окрашивания клеток. При больших временах скорость выхода флуоресцеина из клеток уравновешивает процесс гидролиза ФДА — в результате практически весь рост интенсивности флуоресценции клеточных суспензий связан с увеличением концентрации флуоресцеина во внеклеточной среде.
Использование флуоресцентных зондов для исследования структурно-функциональных превращений мембран лимфойдных клеток.
Характеристики флуоресценции ряда зондов в составе клеток и клеточных мембран были использованы нами для сравнительного изучения структурного и функционального состояния мембран в различных лимфоидных клетках. В табл.I представлены результаты измерений степени поляризации флуоресценции ДФГТ в лимфоидных клетках из различных источников, а также в клетках опухоли АГ-22а , находящихся в растворе с рН 7,4 при температуре 24 С. Значения Рпфрр различны для отдельных типов клеток, причем даже для клеток из одного источника в зависимости от их функционального состояния величи на Рдфрт изменяется в значительных пределах (например, АГ-22а).
Величина степени поляризации флуоресценции ДФГТ определяется структурными и биохимическими особенностями мембран, связавших его / 222 /. Однако в случае исследований целых клеток величина Рдфрг зависит не только от состава клеточных мембран, но и от характера распределения красителя между отдельными мембранными системами клетки. В литературе имеются противоречивые данные относительно локализации ДШГТ в клетках» Не вызывает сомнений тот факт, что зонд ДФГТ проникает в клетку и метит внутриклеточные мембранные структуры и липидные капли, находящиеся в ряде клеток /116,196/. Действительно, при исследовании окрашенных зондом клеток и выделенных из них цитоплазматических мембран обычно получают, что Рщ рр для клеток меньше, чем для цитоплазматических мембран. Это соотношение выполняется и для лимфоидных клеток, находящихся в различных морфофункциональных состояниях, причем в клетках с более высокими значениями Рдфрр поверхностная мембрана также характеризуется более высокими значениями Рд$рх /92,97,98,151,161/.
В ряде работ предполагается, что корреляция величин рпфрр» полученных для целых клеток и выделенных из них цитоплазматических мембран, обусловлена тем, что поверхностная мембрана лимфоидной клетки составляет большую часть всех мембранных компонентов и, следовательно, большая часть сигнала ДЕГТ обусловлена свечением зонда в составе цитоплазматической мембраны клетки. Данное предположение подтверждают результаты определения доли фракции цитоплазматических мембран в суммарной фракции клеточных мембран, которая для лимфоидных клеток составляет 40-55% /161,222/, Кроме того следует отметить, что известный методический прием исследования изменений структуры мембран в различных по морфологическому состоянию клетках - выделение отдельных мембранных фракций - также имеет ряд недостатков. Среди них можно назвать: невозможность точного учета вклада загрязнения выделенной фракции компонентами мембран из других фракций, устранение различий в структуре мембран, связанных с характеристиками целых клеток (осмотическое давление, давление в замкнутом липидном бислое и т.п.).
Внутриклеточные мембраны содержат относительно большее количество ненасыщенных жирных КИСЛІТ и липидв,а также меньшее по сравнению с цитоплазматической мембраной количество холестерина /Іб/. В соответствии с этими данными находятся результаты определения Рпфрт» величина которой, как отмечалось выше, меньше в фракции внутриклеточных мембран, Следовательно, перенос ДЖТ внутрь клеток и окрашивание зондом внутриклеточных структур должны сопровождаться уменьшением величины РДФГТ а изменение РДФГТ в процессе мечения клеток может служить критерием окрашивания внутриклеточных мембран / 97 /. На рис.18 показана кинетика изменений величины Рдфрт. после добавления зонда к суспензии клеток. Степень поляризации флуоресценции дат после добавления в суспензии различных клеток изменяется незначительно на ггротяжении 3--40 минут операции мечения клеток. Аналогичные данные получены нами и для других типов клеток. Особенности использованного нами метода регистрации величины pmspp не позволяли исследовать кинетику изменений Рпфрр сразу после добавления зонда к клеткам. Однако, поскольку практически весь краситель связывается клетками в течение исследованного интервала времени, отсутствие изменений Рп&рр может быть связано с ггоеимущест-венной локализацией ДФГТ в поверхностной мембране клетки, либо с высокой скоростью проникновения ДФГТ внутрь клеток. В литературе имеются противоречивые данные относительно связывания ДФГТ в клетках, однако взаимосвязь между величинами Рттфгт для мембран и для клеток, установленная на основании литературных данных, позволяет предположить, что различия в величинах РДФГТ» представленных в табл.1 характеризуют также различия в текучести клеточных мембран. Табл.1 содержит-результаты определения Рдфрр в режиме непрерывного возбуждения флуоресценции. Из этих данных на основании полуэмпирических зависимостей между РДФГТ и /222/, а также Рдфргр и So /93/, были рассчитаны микровязкость и величина параметра липидного порядка клеточных мембран. При условии, что вклад флуоресценции внутриклеточных мембран в свечение ДФГТ-меченых клеток не велик, рассчитанные значения характеристик свидетельствуют о различиях в структурной организации липидного компонента поверхностных мембран исследованных клеток.
Сравнительная характеристика физико-химических свойств лимфоцитов периферической крови человека в норме, при лейкозе и при действии фитогемагглютенина.
Для дальнейшего рассмотрения процесса клеточной трансформации нами проведено исследование характеристик лимфоцитов периферической крови человека, полученных от здоровых доноров, больных хроническим лимфолейкозом, а также лимфоцитов в культуре при действии поликлонального митогена $ГА. На рис.41 приведены спектры флуоресценции клеточных суспензий в ультрафиолетовой и видимой областях спектра длин волн. Интенсивность флуоресценции клеток в полосах 335 и 440 нм больше в суспензиях клеток больных хроническим лимфолейкозом, одна ко отношение j- для этих клеток в 1,4 раза меньше по сравнению с клетками здоровых доноров. Для клеток, стимулированных к пролиферации ФГА, интенсивность флуоресценции также значительно изменяется по сравнению с контролем: интенсивность ультрафиолетовой флуоресценции выше в 1,2 раза, а интенсивность флуоресценции в видимой области спектра составляет 0,8 от интенсивности флуоресценции клеток, проинкубированных такое же время в среде без ФГА, Таким образом, уменьшение отношения интенсивностей флуоресценции в различных спектральных областях — при действии ФГА на лимфоциты составляет более 30 %,
Отношение =— , как было показано выше, может характеризовать удельную активность процессов ПОЛ в клетках. Следовательно, увеличение в популяции лимфоцитов периферической крови человека больших по размерам бласттрансформированных клеток при лейкозе и при стимуляции митогеном (об этом, в частности, свидетельствует увеличение интенсивности флуоресценции в полосе 335 нм клеточных суспензий) сопровождается снижением суммарного содержания продуктов ПОЛ.
. Результаты измерений величины р для ДФГТ, АНС и ША в суспензиях обсуждаемых типов клеток представлены в табл.1 и 2. Величина рдфуур для лейкозных клеток, как и для клеток селезенки в случае лейкоза «& , меньше значений, соответствующих лимфоцитам здоровых доноров. Меньшая величина микровязкости клеточных мембран больных хроническим лимфолейкозом, определяемая с помощью ДФГТ, не может быть объяснена, как это делается в работе / 160 /, влиянием примеси тромбоцитов в образцах лимфоцитов.
Контроль с помощью микроскопа клеточных суспензий после выделения показал практически полное отсутствие тромбоцитов в исследованных образцах клеток. Таким образом, лейкозные лимфоциты в периферической крови человека характеризуются более высокой текучести клеточных мембран по сравнению с лимфоцитами здоровых доноров, что находится в соответствие с данными работ /159,161, 184,197/.
Инкубация лимфоцитов периферической крови в присутствии ЁГА в течение 24 часов сопровождается уменьшением РЩ-ГФ с 0,260 до 0,232, что, вероятно, связано со стимуляцией части лимфоцитов в культуре митогеном. В работах / 111,117 / показано, что изменение Рттфрт после добавления лектина в суспензию лимфоцитов имеет различный характер. Можно предположить, что разнонаправ-ленность изменений текучести клеточных мембран после стимуляции лимфоцитов митогенами отражает различные механизмы , по которым происходят изменения Рпфрр в процессе взаимодействия молекул лектина с поверхностными рецерторами, активации и бласттрансфор-мации лимфоцитов последовательно. Использованные нами образцы ФГА-стимулированных лимфоцитов (после добавления ФГА 24 часа) позволяют судить об изменениях, характерных для бласттрансфор-мированных клеток в сравнении с покоящимися нестимулированными лимфоцитами, поскольку начальные стадии взаимодействия лектинов с клетками протекают значительно быстрее / 57 /,
Неспецифическая стимуляция ФГА части клеток крови с последующим превращением их в делящиеся бластные клетки - процесс по своей феноменологии близкий к процессу увеличения числа опухолевых клеток в крови. Основным морфологическим отличием препаратов лимфоцитов, полученных от здоровых доноров и больных лейкозом, а также между лимфоцитами, культивированными без и в присутствии ШГА, является различное содержание бластных клеток.
Поэтому однотипность изменений исследованных характеристик клеток при лейкозе и при стимуляции ФГА позволяет предположить, іто данные изменения не специфичны по отношению к опухолевому терерождению клеток, а являются следствием увеличения пролифе-эативной активности клеток. Следует также отметить, что подобие изменения описаны выше в 4.1 для клеток селезенки мыши, гасло властных клеток в которой увеличивается при лейкозе ,по данным лаборатории патофизиологии лейкозов БелНИИ гематоло- ии и переливания крови число бластных клеток в интактной селе-іенке составляет 1%, а на б день развития лейкоза - около 100$).
