Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние проблемы (обзор литературы) 12
1.1. Основные понятия о лазерах и лазерном излучении 12
1.2. Основные свойства лазерного излучения 13
1.3. Использование лазерного излучения в медицине и биологии 14
1.4. Взаимодействие НИЛИ с биологической тканью 20
1.5. Физико-химические, биохимические и фотобиологические основы взаимодействия НИЛИ с биологическим объектом 22
1.6. Влияние НИЛИ на различные уровни организации живой материи 26
1.7. Механизмы фотобиологического действия низкоинтенсивного лазерного излучения 32
1.8. Влияние НИЛИ на иммунную систему организма 38
Глава 2. Материалы и методы исследований 43
2.1. Параметры использованного НИЛИ 43
2.2. Объекты исследования и постановка экспериментов 44
2.3. Методы выделения фагоцитирующих клеток 45
2.4. Моделирование процесса фагоцитоза в условиях in vitro и оценка активности и завершенности фагоцитарного процесса 47
2.5. Изучение цитокиновой активности фагоцитирующих клеток 49
2.6. Методы оценки функциональной активности фагоцитирующих клеток 51
2.7. Цитохимическая оценка функционально-метаболического состояния фагоцитов 54
2.8. Методы статистической обработки результатов 58
Глава 3. Влияние нили на активность процесса фагоцитоза бактерий 59
3.1. Подбор оптимальных параметров НИЛИ для оценки действия на фагоцитирующие клетки 59
3.2. Оценка фагоцитарной активности макрофагов и нейтрофилов под влиянием НИЛИ 61
3.2.1. Влияние красного НИЛИ с длиной волны 681 нм на активность процесса фагоцитоза бактерий перитонеальными макрофагами 64
3.2.2. Влияние инфракрасного НИЛИ с длиной волны 817 нм на активность процесса фагоцитоза бактерий перитонеальными макрофагами 67
3.2.3. Влияние инфракрасного НИЛИ с длиной волны 850 нм на активность процесса фагоцитоза бактерий перитонеальными макрофагами 70
3.2.4. Влияние инфракрасного НИЛИ с длиной волны 850 нм на активность процесса фагоцитоза бактерий нейтрофилами периферической крови человека 73
3.3. Сравнительная характеристика влияния различных видов НИЛИ на фагоцитарную активность макрофагов и нейтрофилов 76
3.4. Установление дозозависимых эффектов влияния НИЛИ различных параметров на основные показатели фагоцитарной активности 83
Глава 4. Влияние нили на цитокиновую активность фагоцитирующих клеток 91
4.1. Влияние красного НИЛИ (681 нм) на индукцию провоспалительных цитокинов (ИЛ-1 и ФНО-а) в процессе фагоцитоза бактерий макрофагами 92
4.2. Влияние ИК НИЛИ (817 нм) на индукцию провоспалительных цитокинов (ИЛ-1 и ФНО-а) в процессе фагоцитоза бактерий макрофагами 94
4.3. Влияние ИК НИЛИ (850 нм) на индукцию провоспалительных и регуляторных цитокинов в процессе фагоцитоза бактерий макрофагами 96
4.4. Влияние РІК НИЛИ (850 нм) на индукцию провоспалительных и регуляторных цитокинов в процессе фагоцитоза бактерий
нейтрофилами человека 102
Глава 5. Влияние нили на функционально- метаболическую активность фагоцитирующих клеток 115
5.1. Изменение локомоторной активности макрофагов и нейтрофилов под влиянием ИК НИЛИ (850 нм) 116
5.2. Влияние ИК НИЛИ (850 нм) на активность киллинга бактерий фагоцитирующими клетками 118
5.2.1. Изменение основных показателей кислороднезависимого киллинга бактерий фагоцитами под влиянием ИК НИЛИ (850 нм) 118
5.2.2. Изменение основных показателей кислородзависимого киллинга бактерий фагоцитами под влиянием ИК НИЛИ (850 нм) 127
5.3. Изменение основных показателей метаболического состояния фагоцитирующих клеток под влиянием ИК НИЛИ (850 нм) 134
Заключение 146
Выводы 163
Список использованных литературных
- Использование лазерного излучения в медицине и биологии
- Методы выделения фагоцитирующих клеток
- Влияние красного НИЛИ с длиной волны 681 нм на активность процесса фагоцитоза бактерий перитонеальными макрофагами
- Влияние ИК НИЛИ (817 нм) на индукцию провоспалительных цитокинов (ИЛ-1 и ФНО-а) в процессе фагоцитоза бактерий макрофагами
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время в большинстве стран мира широко используется низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ) в биологических исследованиях и в практической медицине в качестве эффективного лечебного и профилактического средства (Ohshiro, Calderhead, 1988; Lubart et al., 1990; Козлов, Буйлин, 1993; Илларионов, 1992, 1997; Владимиров, 1994, 1998; Кару, 1995, 1998; Байбеков, 1996; Tuner, Hodl, 1996; Брилль, 1997, 2005; Скобелкин, 1997; Применение лазеров ..., 1999; Абрамов, 2002; Клебанов, 2003; Черенков и др., 2005). От других видов лазерного излучения НИЛИ отличается низкой энергией. Актуальность его использования обусловлена тем, что этих небольших доз излучения достаточно для получения выраженной ответной реакции живой клетки, ткани и даже всего организма (Илларионов, 1994; Головин и др., 2003).
Ежегодно в отечественной и зарубежной печати публикуется большое количество научных работ по изучению биостимулирующих эффектов НИЛИ (Байбеков и др., 1991; Илларионов, 1992; Козлов, Буйлин, 1993; Непомнящих и др., 1994; Гримблатов, 1996; Tuner J., Hodl L., 1996; Артемьев, Ецко, 1997; Каплан, 1997; Кибисов, 1997; Девятков и др., 1987; Утц СР., Волнухин В.А., 1998; Артюхов и др., 1999; Брилль, 1999, 2005; Бугаева и др., 2004). Анализ этих публикаций свидетельствует о явном преобладании клинических испытаний по применению НИЛИ над экспериментальными исследованиями. Поэтому исследование молекулярных, субклеточных и клеточных механизмов, лежащих в основе всего многообразия эффектов, оказываемых НИЛИ на организм, является актуальным и имеет большое значение как для фундаментальной науки, так и для медицинской практики (Девятков, 1987; Владимиров, 1994; Байбеков, 1996; Гладких, 1996; Брилль, 1997; Lubart et al., 1997; Кару и др., 1998; Schindl et al., 2003).
Изучение тонких морфофункциональных перестроек в иммунной системе, и, в частности, в системе фагоцитирующих клеток, под влиянием НИЛИ представляет научный интерес и может иметь прикладное значение
7 (Кузник, Васильев, Цибиков, 1989). Известно, что фагоцитоз является одним из главных механизмов естественной резистентности и ранним этапом специфического иммунного ответа (Ярилин, 2000; Сепиашвили, Шубич, Дорофеева, 2003).
Актуальность исследований процесса фагоцитоза и факторов, стимулирующих его завершенность, связана еще с широким распространением в последнее время микроорганизмов, устойчивых к бактерицидным факторам фагоцитирующих клеток (Тихомирова, 2005). В связи с этим поиск путей достижения эффективного киллинга бактерий имеет огромное значение в практической медицине при лечении различных гнойно-воспалительных и инфекционных заболеваний.
В то же время, несмотря на имеющиеся в литературе данные об имму-номодулирующем действии НИЛИ на организм, в отношении влияния его на функциональное состояние фагоцитирующих клеток, многое остается неясным, что и предопределило направление наших исследований.
Цель работы - изучить влияние НИЛИ, генерируемого полупроводниковыми лазерными диодами, in vitro на процесс фагоцитоза бактерий, цито-киновую и функционально-метаболическую активность перитонеальных макрофагов белых мышей и нейтрофилов периферической крови человека.
Для достижения указанной цели нами были поставлены и решены следующие задачи:
Провести подбор оптимальных параметров НИЛИ для оценки фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов белых мышей.
Изучить влияние НИЛИ на процесс фагоцитоза in vitro бактерий пери-тонеальными макрофагами белых мышей и нейтрофилами периферической крови человека по основным показателям: индексу адгезии (ИА), фагоцитарному индексу (ФИ) и индексу завершенности фагоцитоза (ИЗФ).
Определить действие НИЛИ на синтез основных провоспалительных и регуляторных цитокинов (ИЛ-1, ФНО-а, ИФН-у, ИЛ-4, ИЛ-8) перито-
8 неальными макрофагами белых мышей и нейтрофилами периферической крови человека в процессе фагоцитоза in vitro бактерий.
Оценить влияние НИЛИ in vitro на активность кислородзависимого и кислороднезависимого киллинга бактерий перитонеальными макрофагами белых мышей и нейтрофилами периферической крови человека.
Изучить изменение метаболической активности перитонеальных макрофагов белых мышей и нейтрофилов периферической крови человека в процессе фагоцитоза in vitro бактерий на фоне действия НИЛИ.
Оценить характер и иммунобиологическую значимость действия НИЛИ на процесс фагоцитоза бактерий на субклеточном и клеточном уровнях.
Определить возможность использования различных критериев комплексного иммунологического и метаболического мониторинга функции фагоцитирующих клеток для оценки эффективности действия НИЛИ.
Научная новизна. Впервые было проведено комплексное исследование фагоцитарной, цитокиновой и функционально-метаболической активности перитонеальных макрофагов белых мышей и нейтрофилов периферической крови человека под влиянием in vitro НИЛИ с различными параметрами и дозами облучения на клеточном и субклеточном уровнях. Установлено, что НИЛИ красной области спектра (681 нм) в дозах излучения 20-160 мДж/см не оказывает влияние на процесс фагоцитоза бактерий макрофагами и подавляет его активность при дозах 320 - 1500 мДж/см2. ИК НИЛИ (817 и 850 нм) оказывает стимулирующее действие на все стадии фагоцитоза бактерий макрофагами и нейтрофилами.
Впервые показано влияние НИЛИ in vitro на синтез провоспалительных и регуляторных цитокинов - ИЛ-1, ФНО-а, ИФН-у, ИЛ-4 и ИЛ-8 нейтрофилами и макрофагами в процессе фагоцитоза бактериальных клеток. Дана оценка состояния кислороднезависимого и кислородзависимого киллинга бактерий, метаболической активности фагоцитирующих клеток на фоне действия ИК НИЛИ (850 нм). Определен комплекс наиболее информативных
9 показателей эффективности действия НИЛИ на функционально-метаболическую активность фагоцитирующих клеток.
Теоретическая и практическая значимость. В результате проведенной работы были отобраны наиболее информативные показатели количественных и качественных иммуноморфологических и функционально-метаболических изменений для оценки характера действия НИЛИ на функциональную активность фагоцитирующих клеток для рекомендации к применению в биологических и медицинских исследованиях. Полученны результаты могут быть использованы в клинической практике с целью выбора оптимальных параметров излучения для достижения эффекта стимуляции фагоцитарной функции организма.
Материалы диссертационного исследования используются при чтении лекций общих (иммунология, микробиология) и специальных (современные методы иммунологических исследований, молекулярная иммунология) курсов студентам биологического факультета СГУ. Полученные результаты использованы при подготовке курсовых и дипломных работ студентами биологического факультета СГУ. По материалам данной работы было опубликовано научное издание «Методы изучения процесса фагоцитоза и функционально-метаболического состояния фагоцитирующих клеток», которое рекомендовано к печати Учебно-методической комиссией и утверждено Ученым советом биологического факультета Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского (протокол № 5 от 23.12.05 г.). Работа выполнена в рамках НИР СГУ № 45434 «Изучение механизмов действия низкоинтенсивного лазерного излучения на функциональную активность клеток иммунной системы в норме и при инфекционной нагрузке».
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: - студенческих научных конференциях биологического факультета Саратовского государственного университета им. Н.Г.Чернышевского (Саратов, 2001; 2002; 2003); студенческой научной конференции Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова (Саратов, 2001);
Ш-м Международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2002);
Международной научно-практической конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет» (Санкт-Петербург, 2002);
7-ой Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003); V-ом Съезде иммунологов и аллергологов России (Санкт-Петербург, 2003); - Симпозиумах по оптическим технологиям в биофизике и медицине «SARATOV FALL MEETING» (Саратов, 2003; 2004; 2005);
Объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004);
IV-ом Съезде фотобиологов России (Саратов, 2005);
Международном конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» (Москва, 2005); VII-ой общероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Москва, 2006);
Х-ом Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2006).
Положения, выносимые на защиту:
НИЛИ красной области спектра (681 нм) в дозах излучения 20 -160мДж/см2 не оказывает влияние на процесс фагоцитоза бактерий макрофагами и подавляет его активность при дозах 320 -1500мДж/см2; в дозах 600 и 900 мДж/см2 вызывает гиперпродукцию ИЛ-1 при фагоцитозе бактерий и не влияет на синтез ФНО-а при всех дозах излучения.
ИК НИЛИ (817 и 850 нм) оказывает стимулирующее действие на все стадии фагоцитоза бактерий макрофагами и нейтрофилами; усиливает синтез провоспалительных цитокинов.
ИК НИЛИ (850 нм) усиливает интенсивность «респираторного взрыва» и активность миелопероксидазы в процессе кислородзависимого киллинга бактерий в макрофагах и нейтрофилах; влияет на содержание гликогена и липидов в цитоплазме фагоцитирующих клеток.
Наиболее информативными показателями эффективности действия НИЛИ на фагоциты являются индекс завершенности фагоцитоза, содержание провоспалительных цитокинов - ИЛ-1, ФНО-а и ИФН-у, уровень активных форм кислорода в индуцированном НСТ-тесте и активность миелопероксидазы.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ: 9 статей (в том числе 5 - в реферируемых изданиях), 4 тезисов и 1 научное издание.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, главы «Современное состояние проблемы (обзора литературы)», главы «Материалы и методы исследований», трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 185 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 таблицами и 22 рисунками. Список литературы содержит 239 источников, в числе которых 188 отечественных и 51 зарубежных работ.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Министерства образования и науки РФ ведомственной научной программы «Развитие научного потенциала высшей школы» (раздел № 3.3 «Развитие научно-исследовательской работы молодых преподавателей и научных сотрудников, аспирантов и студентов»).
Использование лазерного излучения в медицине и биологии
В настоящее время в большинстве стран мира наблюдается интенсивное внедрение лазерного излучения в биологических исследованиях и в практической медицине (Девятков и др., 1987; Ohshiro, Calderhead, 1988; Захаров и др., 1989в; Lubart et al., 1990; Клебанов, 1996, 20.03; Tuner, Hodl, 1996; Ско-белкин, 1997; Илларионов, 1998; Тучин, 1998; Применение лазеров ..., 1999; Денисов, 2001).
В России лазеры применяются в биологии и медицине уже более 35 лет. В начале 70-х годов лазерное излучение стали применять для диагностики и лечения в различных областях медицины (Гамалея, 1972). В последующих исследованиях особое внимание медиков обратило на себя терапевтическое воздействие лазеров на биологические составляющие человеческого организма (Пасынков, 1975; Parrish, 1980; Козлов, Буйлин 1993).
Применение лазеров в медицинской практике и биологических исследованиях основывается на взаимодействии световой энергии с биотканями и здесь выделяют три вида фотобиологических эффектов:
1. Невозмущающее воздействие, когда биосубстанция (органическая ткань, жидкость) не изменяет своих свойств в процессе взаимодействия со светом при его рассеивании и отражении. Такой тип используется для создания различных диагностических приборов на основе лазерной спектроскопии (Захаров и др., 1989в; Применение лазеров ..., 1999).
2. Фотодеструктивный эффект, при котором в силу теплового, гидродинамического и других видов воздействия света возникает деструкция тканей, что используется в лазерной хирургии, фотодинамической терапии (ФДТ) раковых опухолей (Dougherty, 1993; Pass, 1993; Hillegersberg, Kost, Wilson, 1994; Соколов и др., 1995; Тучин, 1998; Егоров и др., 1999; Краснов-ский, 2005).
3. Фотохимический эффект - поглощённый биотканями свет возбуждает в них атомы и молекулы, вызывающие фотохимические реакции, лежащие в основе применения НИЛИ как мощного терапевтического средства (Fine, Klein, 1966; Омаралиев, Беляев, 1986; Wilander, Oberg, 1986; Пагава, 1989; Бадалов, 1990; Авруцкий и др., 1991; Байбеков и др., 1991; Илларионов, 1992; Основы лазерной ..., 1993; Назиров, Ваккасов, Байбеков, 1994; Tuner, Hodl, 1996; Артемьев, Ецко, 1997; Утц, Волнухин, 1998).
Впервые для лечения лазер был использован в хирургии (Гамалея, 1972). Действие лазера в хирургии базируется на превращении энергии лазерного луча в тепловую энергию. Локальное нагревание тканей сфокусированным лучом лазера дает широкий спектр изменений от денатурации и коагуляции до испарения воды и плавления структурных белков. При этом становятся возможными основные хирургические манипуляции, включающие коагуляцию крови в сосудах и локальный гемостаз, сварку тканей, полное удаление локального участка ткани. Лазерная рана, в целом, заживает несколько быстрее, чем скальпельная. Относительно активно происходит формирования рубца и восстановление клеточной структуры повреждённого органа (Прикладная лазерная медицина, 1997).
За последние годы лазерные технологии нашли широчайшее применение при лечении заболеваний терапевтическими методами (Маслова, Черток, 1991; Крейман, Удалый, 1992; Основы лазерной ..., 1993; Илларионов, 1994; Байбеков и др., 1996; Гримблатов, 1996; Мамонтова, 1996; Терапевтическая эффективность ..., 1986; Козлов, 1997; Денисов, 2001; Абрамов, 2002). Многочисленные клинические испытания убедительно свидетельствуют о том, что низкоинтенсивное лазерное излучение, прежде всего, видимого и ближнего инфракрасного диапазонов, может эффективно использоваться для профилактики и лечения травматических повреждений (Брилль, Шапкин, Саф-ронов, 2003), сосудистых нарушений (Жуков, Лысов, 1996), системно-функциональных расстройств (Зарембо, 1989; Пагава, 1989; Утц, 1996), а так же дегенеративно-дистрофических заболеваний (Каримов, Камалов, 1979; Коновалов и др., 1989; Шварева, 1989; Авруцкий и др., 1991; Козлов, Буйлин, 1993, 1995; Назиров, Ваккасов, Байбеков, 1994; Артемьев, Ецко, 1997; Каштан, 1997). Многие авторы отмечают, что использование НИЛИ эффективно при лечении различных острых и хронических инфекционных заболеваний (Идрисова, 1976; Бадалов, 1990; Мусабаев, Спицина, 1993; Джалилов, 1994; Ибадова и др., 1995), а также при гнойно-септических и гнойно-воспалительных осложнениях (Закревский, Василевич, 1980; Омаралиев, Беляев 1986; Карпухин и др., 1989; Коновалов и др., 1989).
Низкоинтенсивное лазерное излучение отличается от других видов лазерного излучения тем, что оно обладает низкой энергией. Установлено, что для получения выраженной ответной реакции живой клетки, ткани и даже всего организма достаточно применения малых доз энергии лазерного излучения, не превышающих долей или единиц джоулей (Илларионов, 1994; Ла-рюшин, Илларионов, 1997; Денисов, 2001; Головин и др., 2003). Поэтому с целью терапевтического воздействия на организм человека применяют НИЛИ с плотностью потока энергии не более 200 мВт/см (Крейман, Удалый, 1992; Боголюбов, Пономаренко, 2003).
Терапевтический эффект НИЛИ связан с его фотоактивизирующим и нормализующим (в терапевтических дозах) действием на активность важнейших ферментов метаболизма, биосинтез белков, ДНК, РНК, пролиферацию клеток, регенерацию тканей, активность иммунной системы и системы микроциркуляции крови и лимфы (Байбеков и др., 1991). При этом многими исследователями было отмечено, что лазерное воздействие с низкой энергией активизирует многие метаболические процессы в организме, повышает энергетический обмен, оказывает анальгезирующий эффект и противовоспалительное действие, стимулирует репаративные процессы, а также нормализует общий иммунитет и повышает резистентность организма (Глейм, 1981; Кару и др., 1983; Кузьмина, 1984; Кузник, 1989; Байбеков и др., 1991; Козлов, Буй-лин, 1995; Брискин и др., 1996).
Методы выделения фагоцитирующих клеток
В качестве объекта исследований были использованы фагоцитирующие клетки иммунной системы организма - нейтрофилы из периферической крови человека и макрофаги из перитонеального экссудата белых мышей, ресус-пензированные в питательной культуральной среде 199. Данная среда содержит дивалентные катионы, все необходимые для жизнедеятельности клеток питательные элементы, в том числе гидролизат лактальбумина, и имеет рН 6,5 - 7,2, который контролируется индикатором метилротом. При 37 С жизнеспособность клеток в среде сохраняется достаточно долго, а наличие сыворотки крови способствует фагоцитозу (Фрейдлин, 1986; Мазуров и др., 2000).
Для проведения облучения нами была собрана установка, состоящая из источника постоянного тока, лазерного излучателя, укрепленного на штативе и встроенного в стеклянный конус с целью создания асептических условий при постановке эксперимента и 96-луночного круглодонного полистирольно-го планшета для иммунологических исследований. Действие НИЛИ осуществляли непосредственно на клеточные взвеси фагоцитов до начала фагоцитоза в условиях in vitro. Клетки в питательной культуральной среде 199 вно 45 сили в объеме 20 мкл в лунки планшета. Дозу излучения варьировали в зависимости от экспозиции облучения при постоянной мощности излучения.
Для проведения сравнительного анализа характера действия НИЛИ для каждого вида излучения использовали одни и те же дозы. Так, для изучения фагоцитарной активности под влиянием красного (681 нм) и двух инфракрасных (817 и 850 нм) излучений клетки облучали 8 различными дозами: 20, 40, 80, 160, 320, 640, 1280 и 1500 мДж/см , что соответствовало экспозициям облучения - 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 и 300 с и мощности - 5 мВт. При изучении цитокиновой и функционально-метаболической активности макрофагов и нейтрофилов использовали дозы излучения 300, 600 и 900 мДж/см2 (экспозиция - 60, 120 и 180 с, соответственно; мощность - 5 мВт). В качестве контроля использовали клетки, не подвергнутые облучению НИЛИ.
Методы выделения фагоцитирующих клеток Выделение нейтрофилов из периферической крови человека. Ней-трофилы выделяли из гепаринизированной (20 ЕД/мл) периферической крови человека с помощью центрифугирования на двойном градиенте плотности фиколла-урографина 1,077 г/см3 и 1,093 г/см3 (English, Andersen, 1974; Практикум по иммунологии, 2001). Одним из преимуществ данного метода является отсутствие необходимости лизиса эритроцитов, который приводит к существенному повреждению выделяемых клеток (Долгушин, Бухарин, 2001). Кровь забирали стерильным шприцем в количестве 10 мл из локтевой вены у здоровых доноров-добровольцев обоего пола в возрасте от 20 - 25 лет, всего 15 человек. Далее кровь помещали в специальные стерильные силиконизиро-ванные пробирки Vacuette с гепарином (Sodium heparin, 20 МЕ/мл) и тщательно перемешивали. После этого гепаринизированную кровь отстаивали с 3 %-ым раствором декстрана Т-500 («Pharmacia», Швеция) в соотношении 10:1 в термостате при 37 С в течение 15-20 мин. После седиментации эритроцитов и гранулоцитов, плазму, содержащую лейкоциты и мононуклеа-ры, снимали пипеткой. Осадок, содержащий эритроциты и гранулоциты разводили раствором Хенкса в соотношении 1:3 и использовали для дальнейше 46 го выделения нейтрофилов. Для этого в силиконизированные центрифужные пробирки пастеровской пипеткой наслаивали сперва градиентный раствор фиколл-урографина с плотностью 1,092 г/см , затем второй градиентный раствор с плотностью 1,077 г/см3, а сверху наслаивали осадок после отстаивания, содержащий эритроциты и нейтрофилы. После 45 мин центрифугирования со скоростью 1500 g в пробирках образовывались шесть фракций: первая (нижняя) - осадок эритроцитов и мертвых клеток, вторая - раствор фиколл-урографина (1,093 г/см ), третья - кольцо нейтрофилов (98 - 100 %), четвертая - раствор фиколл-урографина (1,077 г/см3), пятая - кольцо мононуклеа-ров (лимфоциты и моноциты), шестая - остатки плазмы (рис. 2).
Влияние красного НИЛИ с длиной волны 681 нм на активность процесса фагоцитоза бактерий перитонеальными макрофагами
При изучении влияния НИЛИ красной области спектра (681 нм) на фагоцитарную активность макрофагов в монослойной культуре использовали следующие дозы излучения: 20, 40, 80, 160, 320, 640, 1280 и 1500 мДж/см2, что соответствовало экспозициям облучения - 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 и 300 с и мощности - 5 мВт.
В результате микроскопии и соответствующей обработки окрашенных препаратов с фагоцитирующими макрофагами после инкубации при 37 С в течение 1, 3 и 6 ч при воздействии красного (681 нм) НИЛИ были определены основные показатели фагоцитарного процесса для каждой из испытуемых доз излучения - индекс адгезии через 1 ч процесса фагоцитоза (ИА), фагоцитарные индексы через 1, 3 и 6 ч процесса фагоцитоза (ФИЬ ФИ3, ФИ6), индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ). Результаты, демонстрирующие фагоцитарную активность макрофагов при фагоцитозе S. aureus на фоне воздействия НИЛИ красного диапазона, представлены в таблице 2.
Анализ фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов под влиянием красного НИЛИ (681 нм) показал, что действие небольших доз излучения (20 - 160 мДж/см2) существенных изменений в основных показателях фагоцитоза по сравнению с контрольными значениями не вызывает, од-нако при более высоких дозах (320 - 1500 мДж/см ) было отмечено заметное подавляющее действие данного вида излучения на активность фагоцитоза.
При расчете ИА макрофагов через 1 ч фагоцитарного процесса было показано достоверное снижение адгезии бактерий на поверхности фагоцитов при воздействии максимальных доз излучения - 640 мДж/см (66,5 ± 3,23 %, Р 0,05), 1280 мДж/см2 (65,4 ± 5,26 %, Р 0,05) и 1500 мДж/см2 (64,2 ± 5,83 %, Р 0,05); для остальных же доз излучения статистически достоверных различий с контролем (76,3 ± 5,28 %, Р 0,05) выявлено не было. Оценка ФИ через 1 ч фагоцитоза также показала достоверное снижение процента активных макрофагов при воздействии излучения с дозами: 320 мДж/см (28,3 ± 3,30 %), 640 мДж/см2 (20,0 ± 3,12 %), 1280 мДж/см2 (22,7 ± 4,73 %) и 1500 мДж/см2 (22,5 ± 3,60 %, Р 0,05) по сравнению с контролем (36,8 ± 4,57 %, Р 0,05). К 3 ч фагоцитоза подавление активности макрофагов было более выраженным и показано статистически значимое снижение процента фагоцитирующих клеток для красного НИЛИ с дозами 80, 320, 640, 1280 и 1500 мДж/см2 (37,2 ± 4,89 %, 33,1 ± 3,84 %, 25,4 ± 4,55 %, 24,3 ± 3,37 %, 27,1 ± 4,41 %, Р 0,05; соответственно). При этом активность макрофагов в контроле составляла 47,4 ±5,21 %. К 6 ч фагоцитарного процесса значения ФИ при воздействии всех испытуемых доз НИЛИ возвращались к контрольному значению и достоверно от него не отличались.
По результатам расчета ИЗФ было показано, что завершенность процесса фагоцитоза достоверно снижалась практически при всех испытуемых дозах излучения по сравнению с контролем (0,57 ± 0,045 усл.ед., Р 0,05). Только для дозы 80 мДж/см снижение ИЗФ при статистической обработке оказалось не достоверным (0,51 ± 0,038 усл.ед., Р 0,05). Особенно заметное снижение показателей завершенности фагоцитоза было отмечено при более высоких дозах излучения. Так, установлено снижение ИЗФ практически в 1,5 раза по сравнению с контролем при действии НИЛИ красного диапазона в дозе 320 мДж/см (0,35 ± 0,038 усл.ед., Р 0,05) и около 3 раз - при воздействии НИЛИ дозами 640, 1280 и 1500 мДж/см2 (0,17 ± 0,032 усл.ед., 0,19 ± 0,045 усл.ед., 0,20 ± 0,037 усл.ед., соответственно; Р 0,05). Таким образом, при воздействии на макрофаги максимальными из испытуемых доз излучения было выявлено состояние незавершенного фагоцитоза, что связано с активным внутриклеточным размножением бактерий внутри фагоцита. Такое состояние может быть вызвано подавлением бактерицидной активности фагоцитирующих клеток. Кроме того, при микроскопическом изучении препаратов было отмечено изменение морфологии макрофагов. Появлялись деформированные клетки с явными морфологическими признаками начинающегося апоптоза. Отмечены в клетках такие цитологические изменения, как уплотнение цитоплазмы, разрушение ядерного аппарата, нарушение целост 67 ности клеточной мембраны, разбухание клетки. При увеличении дозы излучения к 6 ч фагоцитоза до 70 % клеток были разрушены.
Таким образом, при воздействии лазерными лучами красной области спектра (681 нм) с дозами до 320 мДж/см на фагоцитирующие макрофаги значительных изменений в активности процесса фагоцитоза выявлено не было. Однако при увеличении дозы излучения показано снижение их активности по сравнению с контролем. При этом было отмечено разрушение и гибель большинства клеток, а также подавление процесса фагоцитоза, что приводило к его незавершенности. Возможно, это связано с прямым воздействием НИЛИ (681 нм) на работу ядерного аппарата клетки. Так как известно, что для молекул ДНК характерен максимум спектральной чувствительности именно в данном диапазоне длин волн. Все приведенные факты явно свидетельствуют о негативном влиянии красного НИЛИ (681 нм) на фагоцитарную активность макрофагов.
Влияние ИК НИЛИ (817 нм) на индукцию провоспалительных цитокинов (ИЛ-1 и ФНО-а) в процессе фагоцитоза бактерий макрофагами
Далее были проведены исследования по изучению влияния ИК НИЛИ (850 нм) на цитокинсинтезирующую активность перитонеальных макрофагов белых мышей при фагоцитозе бактериальных клеток S. aureus (штамм 100 б) в условиях in vitro. На макрофаги воздействовали лазерным излучением с до-зами 300, 900 и 1500 мДж/см , что соответствовало экспозициям облучения 60, 180 и 300 с и мощности 5 мВт. Через 3 и 6 ч инкубации клеток в культу-ральной среде 199 определяли концентрации провоспалительных и регуляторных цитокинов, таких как ИЛ-1, ФНО-а, ИФН-у, ИЛ-4 и ИЛ-8. В качестве контроля использовали данные по цитокиновои продукции перитонеальных макрофагов без воздействия НИЛИ (табл. 7).
При анализе полученных данных была установлена индукция синтеза основных провоспалительных цитокинов на фоне действия ИК НИЛИ (850 нм) - ИЛ-1 и ФНО-а. Показано дозозависимое увеличение содержания ИЛ-1 в культуральной среде с фагоцитирующими макрофагами через 3 ч инкубации под влиянием данного вида излучения по сравнению с контролем. К 6 ч процесса макрофаги наиболее активно синтезировали ИЛ-1, однако это увеличение продукции в данном случае не зависело от дозы излучения (рис. 9-А).
Для динамики продукции ИЛ-1 отмечено, что в контроле содержание данного цитокина было 15,7 ± 2,19 пг/мл через 3 ч фагоцитоза и снижалось до 9,4 ± 2,26 пг/мл к 6 ч. При воздействии НИЛИ с дозой 300 мДж/см , напротив, к 6 ч инкубации концентрация ИЛ-1 была выше, чем через 3 ч (25,8 ± 1,41 и 36,1 ± 2,37 пг/мл, соответственно). Концентрации ИЛ-1 при действии дозой 900 мДж/см достоверно не отличались для обоих сроков исследования (38,5 ± 2,3 и 36,1 ± 2,33 пг/мл, соответственно) и при действии дозой 1500 мДж/см2 эти значения были выше на 3 ч (41,4 ± 2,35 пг/мл), чем на 6 ч фагоцитоза (27,5 ± 2,39 пг/мл). Таблица 7 Содержание некоторых провоспалительных и регуляторных цитокинов в среде культивирования перитонеальных макрофагов, подвергнутых облучению ИК НИЛИ (850 нм), при фагоцитозе бактерий S. aureus
Было установлено, что изменение дозы излучения оказывало значительное стимулирующее влияние на синтез ФНО-а, наибольшее содержание которого отмечено при воздействии НИЛИ с дозой 1500 мДж/см (3 ч - 83,5 ± 5,88 пг/мл и 6 ч - 69,3 ± 4,37 пг/мл) по сравнению с контролем (3 ч - 17,9 ± 4,23 пг/мл и 6 ч - 22,2 ± 4,12 пг/мл, при Р 0,05) (рис. 9-Б). Показано, что достоверные различия в концентрации ФНО-а через 3 и 6 ч фагоцитоза были при действии на макрофаги дозами 900 и 1500 мДж/см2; для контроля и дозы 300 мДж/см2 таких различий выявлено не было. Причем при действии дозой 900 мДж/см2 на 3 ч содержание ФНО-а было выше, чем на 6 ч, а при действии дозой 1500 мДж/см2, напротив, к 6 ч инкубации достоверно снижалось по сравнению с 3 ч.
Оценка продукции ИФН-у перитонеальными макрофагами в процессе фагоцитоза бактерий позволила отметить также стимулирующее действие ИК НИЛИ (850 нм). Как к 3 ч, так и к 6 ч фагоцитоза концентрация ИФН-у увеличивалась в среднем в 2 раза по сравнению с контролем. Однако данное увеличение не носило дозозависимый характер (рис. 10-А).
Показано, что ИК НИЛИ (850 нм) не оказывало влияния на продукцию ИЛ-4 макрофагами как через 3 ч, так и через 6 ч фагоцитоза. Статистически значимые различия содержания ИЛ-4 в культуральной среде с облученными и необлученными макрофагами не были обнаружены при действии всех испытуемых доз излучения при Р 0,05 (рис. 10-Б).
Содержание ИЛ-8 в среде культивирования фагоцитирующих перито-неальных макрофагов незначительно, но достоверно увеличивалось через 3 ч процесса фагоцитоза под влиянием ИК НИЛИ (850 нм) по сравнению с кон-трольным значением (контроль - 26,7 ± 1,74 пг/мл; 300 мДж/см - 33,2 ± 2,37 пг/мл; 900 мДж/см2 - 32,4 ± 2,38 пг/мл и 1500 мДж/см2 - 34,9 ± 2,38 пг/мл, при Р 0,05). Однако к 6 ч инкубации эти значения возвращались к контролю и статистически от него не отличались, не зависимо от дозы предварительного облучения (рис. 11).
Таким образом, в результате проведенной оценки цитокинсинтезирую-щей активности перитонеальных макрофагов было установлено, что ИК НИЛИ с длиной волны 850 нм оказывает стимулирующее влияние на синтез ИЛ-1, ФНО-а, ИФН-у, ИЛ-8 и не оказывает никакого влияния на синтез ИЛ-4. Для ИЛ-1 и ФНО-а это увеличение зависело от дозы излучения.
Следующая серия экспериментов была посвящена изучению цитокин-синтезирующей активности нейтрофилов крови человека под влиянием ИК НИЛИ (850 нм). Индукцию синтеза провоспалительных и регуляторных цитокинов ИЛ-1, ФНО-а, ИФН-у, ИЛ-4 и ИЛ-8 определяли при фагоцитозе бактериальных клеток клинического штамма Staphylococcus aureus 100 б. Секреторную активность нейтрофилов оценивали на фоне действия ИК НИЛИ с дозами 300, 900 и 1500 мДж/см , что соответствовало экспозициям облучения 60, 180 и 300 с и мощности 5 мВт. В качестве контроля использовали данные по цитокиновой продукции нейтрофилов без воздействия НИЛИ (табл. 8).
