Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. Обзор литературы 8
1.1 Физические характеристики лазерного излучения 8
1.2. Особенности действия НИЛИ на биологические объекты 11
1.3. Биологические эффекты низкоинтенсивного лазерного света 12
1.4. Возможные молекулярно-клеточные механизмы действия НИЛИ 14
1.5. Действие НИЛИ на иммунную систему человека и животных 17
1.6. Применение низкоинтенсивного лазерного излучения в терапии 20
2. Цитокины, защитные белки, оксид азота, а также естественнее киллерные клетки как основные участники реакции организма на воздействие внешних факторов 29
2.1. Фактор некроза опухолей 32
2.1.1. Функции ФНО в организме 33
2.2. Интерлейкины 35
2.2.1.Интерлекин2 38
2.2.2. ИнтерлейкинЗ 39
2.2.3.Интерлейкин6 41
2.3. Интерферон 42
2.4. Оксид азота (N0) .' 43
2.5. Белки теплового шока 48
5.3. Естественные киллерные клетки (ЕКК) 51
ЧАСТЬ II. Экспериментальное исследование 54
1. Материалы и методы исследования 54
ЧАСТЬ III. Результаты и обсуждение 60
3.1. Влияние НИЛИ на изолированные иммунокомпетентные клетки 60
3.1.1. Влияние НИЛИ на секрецию N0 перитонеальными макрофагами... 60
3.1.2. Влияние НИЛИ на цитотоксическую активность естественных киллерных клеток селезёнки 61
3.1.3. Влияние НИЛИ на продукцию ИФН-у и ФНО-а перитонеальными макрофагами 62
3.1.4. Продукция ИЛ-6 перитонеальными макрофагами и лимфоцитами селезёнки 64
3.1.5. Продукция ИЛ-2 и ИЛ-3 лимфоцитами селезёнки 65
3.1.6. Продукция БТШ70 и БТШ90 лимфоцитами селезёнки 66
3.2. Влияние НИЛИ на показатели клеточного иммунитета здоровых животных 70
3.2.1. Динамика изменения иммунологических показателей мышей после однократного облучения НИЛИ 70'
3.2.1.1. Продукция ИЛ-2 Т-лимфоцитами и содержание этого цитокина в сыворотке крови 70
3.2.1.2. Продукция ФНО-а перитонеальными макрофагами и Т- лимфоцитами селезенки 72
3.2.1.3. Продукция NO перитонеальными макрофагами 72
3.2.1.4. Продукция БТШ70 лимфоцитами селезёнки 72
3.2.2. Влияние длительного фракционированного облучения НИЛИ на состояние иммунной системы мышей 73
3.2.2.1 Количество иммунокомпетентных клеток 73
3.2.2.2. Продукция ИЛ-2 Т-лимфоцитами селезёнки и содержание ИЛ-2 в сыворотке крови 75
3.2.2.3. Продукция ФНО перитонеальными макрофагами Т- лимфоцитами,
и содержание ФНО в сыворотке крови 76
3.2.2.4. Секреция оксида азота перитонеальными макрофагами 76
3.2.2.5. Продукция БТШ 70 лимфоцитами селезёнки 78
3.2.3. Влияние НИЛИ на животных с экспериментальными опухолями 81
3.2.3. Влияние НИЛИ на животных с экспериментальными опухолями 82
3.2.3.2. Влияние однократного действия НИЛИ на опухоленосителей 86
3.2.3.2.1. Динамика изменения иммунологических показателей организма опухоленосителей после однократного воздействия НИЛИ 86
3.2.3.3. Влияние хронического облучения НИЛИ на организм опухоленосителей 89
3.2.3.3.1. Влияние НИЛИ на количество иммунокомпетентных клеток 89
3.2.3.3.2. Влияние НИЛИ на продукцию ИЛ-2 Т-клетками и его концентрацию в сыворотке крови 91
3.2.3.3.3. Влияние НИЛИ на продукцию ФНО макрофагами и Т-лимфоцитами 92
3.2.3.3.4. Влияние НИЛИ на секрецию оксида азота 94
3.2.3.3.5. Влияние НИЛИ на активность ЕКК 95
3.2.3.3.6. Влияние НИЛИ на продукцию белков теплового шока в
иммунокомпетентных клетках 96
3.2.3.3.7. Влияние НИЛИ на размер опухоли и среднюю
продолжительность жизни мышей-опухоленосителей 97
Заключение 100
Выводы 102
Список цитируемой литературы
- Особенности действия НИЛИ на биологические объекты
- Функции ФНО в организме
- Продукция ИЛ-2 Т-лимфоцитами и содержание этого цитокина в сыворотке крови
- Динамика изменения иммунологических показателей организма опухоленосителей после однократного воздействия НИЛИ
Введение к работе
Исследования закономерностей воздействия низкоинтенсивного лазерного излучения на живой организм относятся к одной из приоритетных областей отечественной науки (Артюхов и др., 2001; Владимиров и др., 2004; Каш et. al., 2005). Большой поток работ в этой области был вызван двумя причинами: во-первых, прорывом в технологических разработках, и, во-вторых, довольно успешными примерами использования лазерного излучения в различных областях медицины. При этом во многих случаях лазерная терапия не была подкреплена серьезными фундаментальными исследованиями, а успехи в прикладных областях во многом определялись интуицией практикующих врачей. Тем не менее, параллельно с внедрением лазерной терапии в медицинскую практику проводились исследования по выяснению первичных механизмов взаимодействия лазерного света с живой материей, и наиболее заметный вклад в решение этой проблемы был внесен представителями школы Ю.В. Владимирова, который сформулировал три гипотезы о механизмах действия низкоинтенсивного лазерного света (Владимиров, 1994).
Большое количество работ по изучению биологических эффектов лазерного излучения было проведено с использованием гелий-неоновых лазеров с длиной волны 632,8 нм. Имеется ряд сообщений, приводящих убедительные доказательства иммуностимулирующей активности низкоинтенсивного лазерного облучения (Kipshidze et. al., 2001; Dube et. al., 2003). Это свойство низкоинтенсивного лазерного света обусловило привлекательность его использования в терапии широкого спектра патологий, которые связаны с иммунодепрессией, например, многие хронические инфекционные заболевания, воспаления, а также злокачественный рост (Москвин и Буйлин, 2000; Genot & Klastersky, 2005). Несмотря на широкое применение лазерной терапии, пока не установлена общепринятая концепция, касающаяся первичных механизмов взаимодействия лазерного света с биологическими объектами. Кроме того, имеются проблемы, связанные с определением безопасного уровня интенсивности лазерного излучения при его использовании в клинике. Безусловно, большие дозы лазерного излучения, используемого для формирования тепловых эффектов, вызывают иммуносупрессию. Например, высокоинтенсивное лазерное излучение с дозой 37,8
Дж/см вызывало резкое угнетение активности иммунокомпетентных клеток, экспонированных in vitro, которое выражалось в подавлении продукции ряда цитокинов (Funk et. al., 1993). Имеются предположения о том, что дозы лазерного излучения, используемые для терапевтических целей, не должны превышать 10 Дж/см2 (Klebanov et. al., 1998; Владимиров Ю.А., 1994). Однако есть основания полагать, что в некоторых случаях рекомендованные терапевтические дозы могут также вызывать неблагоприятные побочные эффекты, связанные с высокой чувствительностью клеток иммунной системы к внешним воздействиям.
В настоящее время назрела явная необходимость выяснения чувствительности ключевых звеньев системы клеточного иммунитета животных к воздействию слабого лазерного излучения, причем такое исследование должно быть проведено с использованием различных моделей. Среди основных целей настоящей работы было исследование зависимостей "доза-эффект" для активности клеток иммунной системы, определяемой по секреции ряда цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-6, ИФН-у, ФНО-а), оксида азота (N0), активности естественных киллерных клеток (ЕКК) и экспрессии белков теплового шока (БТШ70 и БТШ90) - как при воздействии на клетки in vitro сверхслабого лазерного излучения, так и при облучении организма in vivo. Для получения более исчерпывающих сведений о характере взаимодействия лазерного излучения с живой клеткой считали целесообразным провести сравнительное исследование ответов клетки в нормальных условиях и при патологии. При использовании животных моделей было необходимо выяснить зависимость эффектов от области аппликации лазерного света на поверхности тела. Кроме того, выяснение чувствительности иммунокомпетентных клеток к воздействию лазерного излучения в дозах, которые на несколько порядков ниже рекомендуемых терапевтических доз, поможет обратить более направленное внимание на проблему безопасности лазерной терапии.
Цель и основные задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании иммуиотропных эффектов малых доз низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) (Х=632,8 нм, 1=0,2 мВт/см ) при воздействии на изолированные лимфоидные клетки in vitro, а также при воздействии in vivo на здоровых животных и на мышей с экспериментальными опухолями, В соответствии с выбранной целью были поставлены следующие задачи:
Исследовать зависимости "доза-эффект" для активности клеток иммунной системы, определяемой по секреции ряда цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-6, ИФН-у, ФНО-а), оксида азота (N0), активности естественных киллерных клеток (ЕКК) и экспрессии белков теплового шока (БТШ70 и БТШ90) - как при воздействии на клетки in vitro сверхслабого лазерного излучения, так и при облучении организма in vivo.
Исследовать зависимость иммуиотропных эффектов НИЛИ in vivo от локализации экспонированного участка кожи здоровых мышей и животных-опухоленосителей.
Исследовать влияние НИЛИ на скорость опухолевого роста и продолжительность жизни животных-опухоленосителей.
Особенности действия НИЛИ на биологические объекты
Лазерное излучение широко применяется в различных областях медицины - от хирургии до неврологии. Если действие высокоэнергетических лазеров, например, при хирургическом вмешательстве, вполне понятно и достаточно хорошо изучено (коагуляция, сильный нагрев и испарение, абляция, оптический пробой и гидравлический удар) (Москвин и Буйлин, 2000), то биологические эффекты низкоинтенсивного лазерного излучения, применяемого в терапии, гораздо более разнообразны и часто противоречивы. Кроме того, данные, полученные из медицинской практики сложно интерпретировать, так как лазерную терапию часто применяют в комплексе с другими методами лечения. Важно также отметить отсутствие объективных методов контроля за результатами облучения, которые позволили бы подбирать оптимальную дозу облучения в каждом конкретном случае, а так же на опасность передозировки, когда лечебный эффект сменялся неблагоприятным действием (Владимиров Ю.А., 1999). Фундаментальная наука изучает действие лазерного света на биологические объекты фактически с момента появления первых лазеров. В этой области накоплен значительный объём данных, позволяющий строить гипотезы о механизмах действия низкоинтенсивного лазерного излучения и делать определённые выводы. В данной главе будут рассмотрены установленные и доказанные факты, на взгляд автора, представляющие наибольший интерес для понимания общих принципов и механизмов влияния НИЛИ на биологические объекты, а так же гипотезы и теории касающиеся механизмов действия НИЛИ.
НИЛИ стимулирует выработку универсального источника энергии АТФ в митохондриях, ускоряет его образование, повышает эффективность работы дыхательной цепи митохондрий. В то же время количество потребляемого кислорода уменьшается. Происходят перестройки в мембранах митохондрий. В ряде работ показано увеличение внутриклеточной концентрации АТФ, связанное с повышением его синтеза при освещении (Herbert et al., 1989; Каш et al., 1995; Corral-Baques et al. 2005). Интересно, что подобные эффекты характерны для большого числа клеточных линий (HeLa, лимфоцитов, фибробластов, клеток опухолевой линии R3230AC) при воздействии на них НИЛИ с различными длинами волн.
Излучение гелий-неонового лазера приводит к увеличению содержания в ядрах клеток человека ДНК и РНК, что свидетельствует об интенсификации процессов транскрипции (Vacca et al., 1994, Hawkins, 2006). Интересно, что при этом частота хромосомных мутаций в клетках человека, вызванных химическими мутагенами, при воздействии ГНЛ уменьшается (Волегов, 2001). В настоящее время экспериментально доказано, что НИЛИ влияет на генетический аппарат клетки без грубых структурных нарушений хромосом (мутаций). Действие НИЛИ на клеточный геном носит модифицирующий характер, проявляется активацией или ингабированием отдельных генных локусов и не приводит к появлению нарушений в молекуле ДНК (Бриль и Панина, 2000).
Лазерное излучение обладает выраженным радиопротекторным действием при локальном воздействии лазерного света на организм и изолированные клетки. Радиозащитный эффект лазерного излучения обусловлен активацией репарирующих систем клетки (Восканян и Арзуманян, 1996; Берлиен и Мюллер, 1997). Это позволило использовать лазерное излучение в онкологии, на вредных производствах, в военной медицине, как профилактический и лечебный фактор в комбинации с медикаментами (Восканян и Арзуманян, 1996).
Низкие дозы излучения ГНЛ могут вызывать в клетках различного типа изменение свойств наружной мембраны. Например, при внутривенном лазерном облучении крови (БЛОК) (632,8 нм, 1 мВт) НИЛИ вызывает перестройку структурного состояния мембран форменных элементов крови, в частности НИЛИ приводит к снижению микровязкости липидного слоя (Спасов и др., 1998; Клебанов и др., 1990). Имеются данные, что ГНЛ активирует кальциевые каналы клеточных мембран (Козель и Попов, 2000; Lubart et al., 1992; Kassak, et al., 2005). Выявлено изменение содержания внутриклеточного кальция в лейкоцитах (Клебанов и др., 2001), изменение фагоцитарной активности моноцитов, гранулоцитов, розеткообразующей активности Т-и В-лимфоцитов крови человека, их способности к бласттрансформации при воздействии излучения ГНЛ как на целостный организм, так и на изолированные клетки (Стожкова, 1997; Hemvani et al., 2005). Лазерное излучение с длиной волны 400-500 нм и около 600 нм вызывало увеличение скорости деления клеток некоторых микроорганизмов, а так же увеличение белкового синтеза. При этом наблюдается выраженная зависимость стимулирующего действия лазерного облучения от дозы; интервал интенсивностей, в пределах которых наблюдался положительный эффект, составлял полтора-два порядка величины (Владимиров, 1994; Каш, 1990). Лазерное облучение (Х=632,8 нм) клеток, выделенных из эпителия сетчатки, приводит к увеличению митотического индекса, что связывают с уменьшением длительности стадии G1 клеточного цикла (Алесенко и Пальмина, 1982; Владимиров, 1999), а также стимулирует пролиферацию моноцитов крови (Gulsoy et al., 2005). Показано, что НИЛИ различных длин волн стимулирует митотическую активность как различных видов нормальных, так и некоторых линий опухолевых клеток (Sroka et al., 1999).
В опытах с изолированной эритроцитарной Cu/Zn-супероксиддисмутазой (СОД) было показано, что при облучении инактивированного при рН 5,9 фермента светом ГНЛ наблюдалась полная его реактивация (Горбатенкова и др., 1988). Также обнаружено, что под влиянием лазерного облучения (А,=632,8 нм) на фоне сниженной каталазной активности вследствие сдвига рН наблюдались структурные перестройки данного фермента и повышение его функциональной активности (Девятков и др., 1987; Klara et al., 1994). Показано влияние НИЛИ на активность Cu/Zn-СОД и моноамин-оксидазы-В в плазме крови больных синдромом Паркинсона (Vitreshchak et al., 2004).
При облучении крови непосредственно в кровеносных сосудах наблюдается активация индуцибильной NO-синтазы, которая приводит к увеличению продукции NO-предшественника эндотелий релаксирующего фактора. Это вызывает вазодилатацию сосудов, уменьшение адгезии и агрегации лейкоцитов, и таким образом, способствует ускорению реперфузии, что является основой для большинства благотворных клинических эффектов лазерной терапии (Борисенко и Осипов, 1997; В.И. Козлов и др., 1993).
Функции ФНО в организме
ФНО был открыт как белок вызывающий избирательную гибель некоторых линий опухолевых клеток, как in vitro, так и in vivo. В связи с обнаруженным противоопухолевым эффектом, ФНО привлек большое внимание исследователей всего мира. Позднее было установлено, что ФНО это целое семейство цитокинов, осуществляющих свои функции через соответствующее семейство клеточных рецепторов (Yamazaki 1994; Maranda & Robak 1997). Наиболее изученными членами семейства ФНО являются ФНОос и ФНОр. Лимфотоксин по своей структуре и по происхождению имеет близкое сходство с кахектином. Он вырабатывается Т-лимфоцитами и В-лимфобластами в ответ на специфическую антигенную или неспецифическую митогенную стимуляцию. Этот медиатор, в отличие от кахектина, не вырабатывается макрофагами и не вырабатывается в ответ на введение бактериальных ЛПС. При синтезе лимфотоксин продуцируется в меньших по сравнению с кахектином количествах, скорость его накопления ниже, чем скорость образования кахектина (Li et al, 1987, Porter, 1990). При этом гены ФНОос и ФНОр независимо регулируются различными цитокинами. Различия биологических активностей могут быть связаны различиями в характере их взаимодействия с общими рецепторами (Porter, 1990). Также выяснилось, что ФНО участвует в большинстве регуляторных процессов организма и вырабатывается в ответ на разнообразные стрессирующие стимулы: из эндогенных медиаторов стимулируют продукцию ФНО ИФН-у (van Valen et al, 1997, Ueda & Yamazaki, 2001), макрофагальный колониестимулирующий фактор (Beutler В. et al., 1986,1988), интерлейкины: ИЛ-2 (Reddy et al, 2001), ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-13 (Singh et al, 2000), ИЛ-11 (Redlich et al, 1996), ИЛ-17 (Jovanovic et al, 1998). Некоторые виды вирусов, продукты жизнедеятельности бактерий, трипаносом, плазмодия индуцируют выработку кахектина (Beutler & Cerami, 1988). Как важнейшие стимуляторы эндогенного синтеза ФНО исследованы также некоторые полипептиды (Ueda & Yamazaki, 2001), липополисахариды (Lee & Sullivan, 2001, Pfister et al, 1992), инсулин (Iida et al, 2001), 2,3,7,8-тетрахлородибензо-р-диоксин (Rier et al, 2001). Величина уровня синтеза ФНО под действием стимулирующих факторов изменяется по-разному. При использовании, например, липополисахаридов (ЛПС) продукция ФНО возрастает в 10-100 раз (Vassali, 1991; Burger, 2000), активация экспрессии гена, регулирующего синтез ФНО, возрастает в 30 раз при гипертермии (Katschinski et al., 1999), острое летальное у-излучение также резко увеличивает продукцию ФНО (Sherman et al, 1991). Большая по величине активация синтеза ФНО при повреждающих факторах объясняется редкой для клеток млекопитающих системой регуляции этого цитокина по принципу положительной обратной связи. При высокой концентрации ФНО в организме возникают токсические эффекты, снижение массы тела, метаболический ацидоз, повреждение структуры внутренних органов, кахексия и геморрагический некроз органов. В этих случаях для блокировки внутриклеточного синтеза ФНО используют актиномицин D, циклогексимид, простагландин Е2, NO (Eigler et al, 1995), рибозим (Kisich et al, 1999), некоторые антиоксиданты (van Valen et al, 1997), геранин, сорилагин (Okabe et al, 1999, 2001), талидомин, другие природные ингибиторы (Habtemariam, 2000). Подавлению экспрессии ФНО также способствуют стероиды, ингибиторы синтеза простагландинов, а также иммуносупрессивные агенты и некоторые цитокины, среди которых ИЛ-6, ИЛ-10, ИФН-а, ИФ-Р, Г-КСФ (Aggarwal & Natarajan, 1996).
Функции, выполняемые в здоровом организме кахектином и лимфотоксином, очень разнообразны. Во-первых, ФНО действует непосредственно на разные типы клеток. Так, в сравнительно низких концентрациях (10" М) ФНО-а усиливает адгезивные свойства нейтрофилов и эндотелиальных клеток сосудов, вызывая экспрессию новых адгезивных молекул на их поверхности и разрыхляя межклеточный матрикс. Кроме того, фактор некроза опухоли способствует активации нейтрофилов, усиливая фагоцитоз и продукцию супероксидных радикалов, а также экспрессию рецепторов комплемента на нейтрофилах (Beutler & Cerami, 1989, Brown, 1991; Berry et al., 2005; Hartmann et al., 2005). ФНО-а является аутокринным и паракринным активатором макрофагов, служит хемоаттрактантом для макрофагов и клеток Лангерганса в коже (Зубова & Окулов, 2001). Этот цитокин регулирует многие процессы кроветворения. Известно, что ФНО-а, ФНО-р и ИЛ-6 способны вызвать ингибирование всех типов колоний ранних костномозговых предшественников, возможно, это действие опосредуется через простагландин Е2, синтез которого увеличивается под воздействием ФНО. В литературе имеются противоречивые сведения в отношении антипролиферативного эффекта ФНО на нормальные клетки. Известно, что ФНО ингибирует все типы колониеобразующих единиц в нормальном костном мозге (Akashi К. et al., 1992). Кроме того, этот цитокин способен стимулировать рост клеток за счет активации ростовых факторов, инициировать секрецию некоторых других цитокинов, например, ИЛ-1, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, ИФН-у (Kimber & Cumberbatch, 1992). Результаты экспериментальных и клинических исследований приводят к выводу, что ФНО, наряду с некоторыми другими цитокинами (ИЛ-1, ИЛ-2), активно участвует в регуляции болевой чувствительности и патогенезе болевых синдромов (Василенко, 2000; Maihofner et al., 2005). В различных типах клеток стимуляция рецепторов к ФНО-а вызывает быстрое возрастание внутриклеточного уровня АФК (Зенков и др., 2001). Известно, что ФНО-а индуцирует продукцию NO-синтазы (Bose & Farnia, 1995; Titheradge, 1999), праймирует нейтрофилы (Bajaj et al., 1992; Utsumi et al., 1992; van Leeuwen et al. 2005) и моноциты человека (Kitagawa et al., 1996). Кроме того, чувствительность или резистентность клеток к действию ФНО коррелирует со сниженным или повышенным уровнем СОД в этих клетках. Ингибиторы протеинкиназы С усиливают ФНО-индуцированный апоптоз фибробластов; при этом количество и аффинность рецепторов к ФНО-а не изменяются, но снижается экспрессия Мп-СОД, конститутивно высокая в этих клетках (Kobayashi et al., 1997). Биологический эффект ФНО при действии на моноциты/макрофаги заключается в стимулировании прокоагулянтной активности, стимулировании продукции ГМ- и Г-КСФ, простагландина Ег, интерлейкинов ИЛ-3, ИЛ-1 и ИЛ-6 (Riedy & Stewart, 1992; Vassalli, 1992; Wanidworanun & Strober, 1993; Dewas et al, 2003). Известны работы, в которых были обнаружены антиапоптозные эффекты ФНО-а (Colotta et al., 1992; Murray et al., 1997). Считается, что антиапоптозный эффект ФНО-а может быть связан с активацией NF-кВ (Ward et al., 1999), то есть с перманентной продукцией короткоживущих ингибиторов апоптоза. Апоптогенное действие ФНО-а связывают с активацией каскада апоптозных протеаз, называемых каспазами (Tudan et al., 2000; Yamashita et al., 1999).
Продукция ИЛ-2 Т-лимфоцитами и содержание этого цитокина в сыворотке крови
На основании результатов, полученных при выполнении описанной выше серии экспериментов по изучению динамики ответа иммунной системы на однократное действие НИЛИ нами была разработана модель длительного фракционированного облучения: Подопытных животных облучали в течение 1 мин (12x10 3 Дж/см2). Так как ранее нами было обнаружено затухание ответа клеток иммунной системы через 48 часов после однократного воздействия, мы применили повторное облучение каждые 48 часов в течение 30 суток. Облучению подвергали область тимуса или область задней лапы, как описано выше. В качестве контроля были использованы необлученные животные. Основные показатели состояния иммунной системы измеряли на 10,20 и 30 день эксперимента.
На рисунке 11 представлены результаты измерения числа макрофагов перитонеального экссудата и лимфоцитов селезенки здоровых животных после воздействия лазерного света. Лазерное облучение мышей приводило к изменению количества клеток только в случае, если мы облучали зону локализации тимуса (Рис.11 А). В этом случае при суммарной дозе 0,036 Дж/см, что соответствовало 10 дням от начала воздействия, наблюдалось увеличение количества лимфоцитов селезенки; количество клеток снижалось до уровня контроля на более поздних этапах эксперимента. Интересно, что общее число перитонеальных макрофагов при этом было достоверно снижено как после 10, так и после 30 дней от начала эксперимента. Облучение задней лапы мышей не вызывало никаких достоверных изменений числа иммунокомпетеитных клеток (Рис. 11).
Низкоинтенсивное лазерное облучение зоны тимуса в дозах 0,036 и 0,072 Дж/см достоверно уменьшало продукцию ИЛ-2 Т-лимфоцитами здоровых животных, что приводило к снижению концентрации этого цитокина в сыворотке крови (Рис. 12). При этом наблюдалась четкая зависимость общего содержания этого цитокина от ИЛ-2 продуцирующей активности Т-лимфоцитов селезенки (г=0,862, р 0,05). Интересно, что при использовании этой модели облучения увеличение дозы до 0,1 Дж/см не влияло на продукцию данного цитокина.
Облучение лапы здоровых животных как на ранних, так и на более поздних сроках экспозиции также вызывало угнетение продукции ИЛ-2 Т-лимфоцитами. Но наиболее немонотонные эффекты мы обнаружили при исследовании влияния НИЛИ на динамику изменения концентрации ИЛ-2 в сыворотке крови мышей с облученной лапой. В этом случае доза 0,036 Дж/см2 (10 дней) вызывала увеличение концентрации ИЛ-2 в сыворотке крови, 0,072 Дж/см2 (20 дней) - отсутствие эффекта, а облучение в дозе 0,1 Дж/см2 (30 дней) приводило к достоверному снижению концентрации ИЛ-2 в сыворотке до следовых концентраций. Облучение тимуса здоровых животных вызывало изменение общей концентрации ФНО в сыворотке крови, которое коррелировало с изменением продукции ФНО Т-клетками облученных мышей (г=0,884, р 0,05). Достоверное повышение концентрации ФНО в сыворотке крови вызванное, вероятно, усилением продукции ФНО спленоцитами мышей (Рис. 13А, кривые 2 и 4), наблюдалось только при дозе 0,036 Дж/см (10 день воздействия). Увеличение дозы облучения приводило к исчезновению стимулирующего эффекта. ФНО-секреторная функция макрофагов мышей не изменялась при облучении тимуса в течение всего курса воздействия.
Интересно, что при воздействии красного света на внешнюю поверхность задней лапы не выявлена прямая зависимость между уровнем продукции ФНО клетками иммунной системы и концентрацией этого цитокина в крови. Так, доза 0,036 Дж/см2 вызывала увеличение общей концентрации ФНО, ФНО-продуцирующая функция исследованных иммунокомпетентных клеток в этом случае не изменялась. При суммарной дозе 0,072 Дж/см2 наблюдалось стимуляция продукции ФНО Т-клетками мышей, при этом общая концентрация ФНО в сыворотке крови и продукция ФНО макрофагами облученных мышей не отличались от контрольной группы. Более того, даже сильное угнетающее действие длительной экспозиции (30-дневный курс) задней лапы на концентрацию ФНО в сыворотке крови не сопровождалось достоверным снижением ФНО-продуцирующей функции иммунных клеток (Рис. 13 Б).
В клетках облученных здоровых животных заметное возрастание продукции NO показано только после 20 дней облучения зоны тимуса (Рис. 14). Более длительное фракционирование облучение тимуса здоровых животных приводило к угнетению секреции NO (Рис. 14, кривая 2). Экспозиция задней лапы здоровых мышей вызывало сильное угнетение секреции оксида азота макрофагами облученных мышей при всех использованных дозах.
Динамика изменения иммунологических показателей организма опухоленосителей после однократного воздействия НИЛИ
Результаты нашей работы показали существенное модулирующее действие НИЛИ на функционирование иммунной системы облученных мышей с привитой карциномой Эрлиха, при этом зависимость эффектов от полученной дозы носила сложный характер. Однако, несмотря на некоторую активацию иммунной системы опухоленосителей после однократного воздействия, хроническое облучение НИЛИ, независимо от локализации облучаемой поверхности, не приводило к повышению противоопухолевого потенциала организма. Несмотря на имеющиеся сведения о том, что НИЛИ способно оказывать стимулирующее действие на тимус и лимфатические узлы (Бугаева и др., 2003), при облучении зоны вилочковой железы мы наблюдали уменьшение продукции ФНО и активности ЕКК на 10-ый и 20-ый дни, снижение концентрации ФНО в сыворотке крови и угнетение секреции ИЛ-2 на 30-ый день у облученных опухоленосителей. Несмотря на незначительную стимуляцию продукции ФНО и
ЕКК на поздних стадиях канцерогенеза, организм опухоленосителей к этому времени был настолько ослаблен, что эти изменения не влияли существенным образом на эффективность противоопухолевой защиты организма. Более того, экспозиция зоны опухоли вызывала серьезное снижение практически всех звеньев противораковой защиты на начальных стадиях канцерогенеза, когда адекватный противоопухолевый ответ наиболее важен для защиты организма от патогенного действия злокачественного роста. Так, на 10 день эксперимента облучение самой опухоли в месте ее локализации приводило к достоверному уменьшению секреции оксида азота и ФНО макрофагами, снижению продукции ИЛ-2 и экспрессии БТШ70 и БТШ90 в спленоцитах, угнетению активности ЕКК и сокращению общего числа клеток селезенки. Не менее угнетенным оказалось состояние противоопухолевой защиты организма после 30-тидневного курса НИЛИ. К этому сроку значительно снижалась продукция ФНО в спленоцитах и общая концентрация этого цитокина в сыворотке крови, активность ЕКК оставалась невысокой, а уровень секреции N0 макрофагами мышей резко возрастал, что, как известно, на поздних стадиях заболевания является фактором, способствующим прогрессии опухоли (Jekins et al, 1995; Зенков и др., 2001). Существенно, что угнетение сопротивляемости организма росту новообразования при хронической экспозиции зоны опухолевой ткани приводило к ускорению роста опухолей и снижению продолжительности жизни опухоленосителей. Данные настоящего исследования не являются поводом для оптимистического прогноза использования НИЛИ в качестве противоопухолевого инструмента. Тем не менее, сочетание лазерного света и других методов лечения дает неплохие результаты. Так, низкоинтенсивное лазерное излучение применяется при лечении различных онкологических заболеваний как инструмент фотодинамической терапии (Антонов и др., 1990; Mito, 1999; Chen et al., 1999, 2003), адоптивной лазерной иммунотерапии (Антонов и др., 1990; Головизин, 1995) или лазерного экстракорпорального облучения крови пациентов.
Таким образом, результаты настоящей работы показали, что длительное хроническое облучение кожи мышей с солидными опухолями низкоинтенсивным светом гелий-неонового лазера в зоне вилочковои железы и, особенно, в зоне опухолевой ткани приводит к снижению естественного противоопухолевого потенциала, что способствует прогрессии опухоли и вызывает тенденцию к уменьшению средней продолжительности жизни опухоленосителей. Тем не менее, кратковременное однократное воздействие НИЛИ в течение нескольких суток после облучения приводит к стимуляции противоопухолевого иммунитета. Эти результаты указывают на перспективность дальнейших исследований в этой области, причем поиски должны вестись в плане изучения как первичных механизмов взаимодействия лазерного света с биологической системой, так и оптимизации условий и параметров лазерной терапии.
В результате проведенной работы было показано, что низкоинтенсивное лазерное облучение способно вызывать не только стимуляцию клеток иммунной системы, но при определенных условиях приводить к угнетению их активности. Например, активность естественных киллерных клеток (ЕКК), являющихся важной составляющей неспецифической иммунной защиты, можно было регулировать, изменяя дозу воздействия низкоинтенсивным красным светом, а также локализацию облучаемого участка тела. В этом случае фракционированное облучение зоны тимуса малой дозой приводило к подавлению активности ЕКК, а облучение в том же режиме поверхности кожи в области задней лапы, напротив, стимулировало активность этих клеток. Подобные же закономерности ответа клеток на пролонгированное повторяющееся каждые третьи сутки воздействие in vivo светом гелий-неонового лазера мы обнаружили при исследовании продукции цитокинов, оксида азота и белков теплового шока у здоровых животных.
Что же касается использования фракционированного режима облучения лазерным светом животных с экспериментальными опухолями, то нам не удалось обнаружить его лечебного эффекта. Действительно, при облучении опухоленосителей не было выявлено ни снижения уровня дисбаланса клеточного иммунитета, вызванного опухолевым ростом, ни торможения роста злокачественных новообразований, ни сколько-нибудь заметного увеличения продолжительности жизни животных. Тем не менее, такой экспериментальный результат не отменяет самой возможности применения лазерной терапии при злокачественном росте, но указывает на то, что использованный режим с постепенным увеличением кумулятивной дозы не является оптимальным. Действительно, в работе показано, что если была применена только однократная экспозицию in vivo, то в течение нескольких суток после воздействия лазерным светом наблюдали стимуляцию противоопухолевого иммунитета.
Показанная стимуляция ключевых звеньев клеточного иммунитета при воздействии сверхслабых доз лазерного света и возникновение противоположного эффекта (угнетения) при возрастании дозы, отражает механизм возникновения и последующего снижения (при накоплении дозы) уровня адаптивного ответа лимфоидных клеток.
