Введение к работе
Актуальность проблемы. Микроскопическое исследование морфологии образцов тканей традиционно является одним из главнейших методических подходов в экспериментальной биологии уже на протяжении нескольких столетий. Тем не менее, потребности развития современной биологии диктуют необходимость проведения исследований биохимических процессов в интактных (живых) системах. Внедрение неинвазивных методов диагностики в экспериментальную биологию представляет собой одну из наиболее активно развивающихся областей биомедицины. Применение методов неинвазивной диагностики в биологических исследованиях позволяет: 1) получать и анализировать информацию, отражающую изменение физиологических и молекулярных параметров во времени в живом организме с высоким пространственным разрешением, т.е. вплоть до уровня визуализации отдельных клеток (шкала разрешения от 50 мкм до 2 мм); 2) одновременно регистрировать различные классы изображений, анатомически точно картирующие живые ткани и отражающие функциональный статус органов; 3) более эффективно внедрять достижения фундаментальной физико-химической биологии непосредственно в клинические испытания. В последнее время широкую известность получила неинвазивная диагностика на молекулярном уровне (т.н. «molecular imaging»), основанная либо на использовании сигнала молекулярных зондов, введенных искусственно, либо на интерпретации сигнала, вызванного присутствием эндогенных молекул живой системы. Молекулярная неинвазивная диагностика в живых системах развивается на стыке многих наук, включающих, прежде всего, медицинскую физику, биофизику, синтетическую органическую химию и молекулярную биологию. В последние годы на практике было показано, что одним из необходимых условий для успешного проведения неинвазивной диагностики на молекулярном уровне является применение молекулярных зондов (т.н. «репортеров»), которые обладают способностью генерировать специфические сигналы, отражающие наличие компонентов микроокружения зонда в живом организме. Эти сигналы регистрируются при помощи современных диагностических методов (магнитно-резонансная томография (МРТ), гамма сцинтиграфия, позитронно–эмиссионная томография (ПЭТ), оптическая визуализация флуоресценции в ближнем инфракрасном диапазоне). Для применения подобных зондов в живых системах необходимым условием является наличие биосовместимости, специфичности и низкой эффективной (граничной) концентрации зонда в живой ткани организма. В 90-х и начале 2000-х годов нами были разработаны несколько классов подобных биосовместимых зондов для визуализации биологически важных процессов в живых интактных системах. Наиболее широкое практическое использование и научное признание получили биосовместимые зонды для визуализации: 1) лизосомной и экстраклеточной ферментативной активности катепсинов; 2) визуализации ангиогенеза и аномальной проницаемости стенки сосудов; 3) оксидоредуктазной (в том числе, пероксидазной) активности. Эти три класса зондов объединяет способность усиливать специфические сигналы, которые регистрируются приборами, разработанными для диагностической визуализации в живых системах. Их активность в первом случае основана на эффекте резонансного переноса энергии флуоресценции (как излучательного, так и темного), а во втором и третьем случаях – на эффекте увеличения молярной релаксивности парамагнитных катионов (т.е. изменения способности укорачивать времена релаксации протонов воды). Это происходит за счет положительных изменений корреляционных времен в парамагнитных зондах, достигнутых либо с применением методов химической иммобилизации, либо в результате ферментативной реакции. Все три класса диагностических зондов в настоящее время успешно используются для решения нескольких фундаментальных и прикладных задач в ряде лабораторий, в том числе, в качестве коммерчески доступных макромолекулярных оптических зондов для преклинических исследований (Visen Medical, Inc.), МРТ препаратов для преклинического тестирования экспериментальных лекарственных средств (Novartis Research Inst., Sanofi) или в качестве носителя для доставки биологически активных пептидов и рекомбинантных белков (PharmaIn Corp).
Целью работы явилось развитие методических подходов к визуализации специфической ферментативной активности и активации факторов транскрипции в живых системах. В качестве основных направлений работы были выбраны прикладные исследования, целью которых являлось изучение ответа живого организма на стимуляцию воспалительного каскада, в частности, модельное исследование визуализации оксидоредуктазной активности при развитии нестабильной атеромы и рака, а также активации стромы и ангиогенеза в раковых опухолях.
Задачи исследования. Для достижения целей работы были поставлены и поэтапно решены следующие задачи:
-
Разработка и синтез макромолекулярного наноносителя (PGC) для диагностических меток (НМН).
-
Изучение поведения парамагнитного аналога PGC в кровотоке нормальных животных и в экспериментальных моделях рака, ишемии головного мозга и инсульта с помощью МРТ.
-
Создание зонда для оптической визуализации протеолиза в живых системах на основе PGC.
-
Изучение и идентификация источников протеолитической активности в раковых опухолях путем флуоресцентной визуализации в интактных животных в ближнем инфракрасном диапазоне длин волн.
-
Разработка, синтез и изучение свойств парамагнитных субстратов оксидоредуктаз (пероксидаз растений и миелопероксидазы), а также тирозиназ и лакказ.
-
Разработка метода визуализации активности миелопероксидазы в модельных системах в качестве маркера нестабильной атеромы.
Научная новизна и практическая значимость. В 1992 году нами был впервые разработан и запатентован макромолекулярный синтетический парамагнитный нанозонд (Protected Graft Copolymer, PGC), с характерной длительной циркуляцией в кровотоке и относительно узким молекулярно-массовым распределением. Этот зонд был использован для визуализации обьема крови в моделях рака и тромбоза легочных артерий, а также для одновременного определения объема и скорости кровотока в головном мозге в норме и патологии при индуцированном ишемическом инсульте. Использование PGC в сочетании с МРТ показало, что этот нанозонд позволяет определить эффективность антиангиогенных терапевтических средств на ранних стадиях испытаний на экспериментальных животных. Высокоэффективное мечение PGC радиоизотопом 99mТс дало возможность провести предварительные клинические испытания (Фаза 1А) этого зонда в качестве макромолекулярного радиоизотопного маркера для вентрикулографии, а также позволило исследовать некоторые особенности метаболизма PGC в организме человека.
Важной особенностью подобных контрастирующих веществ (зондов) является сильное изменение свойств диагностических меток в ковалентно связанной форме. В то время как релаксивность парамагнитных хелатов Gd(III) (т.е. способность катионов гадолиния к сокращению времени релаксации координированных протонов воды), связанных с PGC, возрастает в несколько раз, интенсивность флуоресценции ковалентно связанных молекул инфракрасных флуорохромов резко уменьшается. Использование этого явления в исследованиях на животных впервые позволило использовать возрастание интенсивности флуоресценции в ткани в результате деградации PGC лизосомными катепсинами для полуколичественной оценки протеолитической активности в раковых опухолях. Дальнейшие исследования на моделях рака позволило идентифицировать фракции клеток опухолей с наиболее выраженной протеолитической активностью, присутствие которых связано с повышенной инвазивностью аденокарцином.
В начале 2000-х годов нам впервые удалось показать, что каталитическую активность пероксидаз в живой ткани можно обнаруживать с помощью МРТ, при условии, если в качестве восстанавливающего субстрата были использованы парамагнитные моно- и бис- фенэтиламидные или оксииндолэтиламидные производные хелатов парамагнитного Gd(III) в качестве пероксидазо- чувствительных контрастирующих зондов. Данные производные восстанавливают окисленные формы пероксидаз с высокой эффективностью, и в результате ферментативного окисления вступают в реакции гомоолигомеризации, а также ковалентной модификации белков, и, тем самым, повышают релаксивность хелатированного гадолиния. Релаксометрические измерения показали, что МРТ сигнал возрастает преимущественно за счет удлинения корреляционного времени реориентации спинов протонов воды (tр), взаимодействующих с локальным электромагнитным полем парамагнитного катиона. Данные контрастирующие зонды были использованы для визуализации трех классов оксидоредуктаз: 1) миелопероксидаз (т.е. эндогенных высокомолекулярных белков первичных секреторных гранул гранулоцитов); 2) пероксидаз растений, используемых в качестве меток для ферментативного обнаружения антител, связанных с антигенами в системах in vitro, а также in vivo; 3) тирозиназ; 4) лакказ. Миелопероксидаза (МПО) секретируется преимущественно нейтрофилами, при трансмиграции через стенку сосудов в ответ на локальную активацию эндотелиальных клеток. Активация происходит в результате воздействия различных эндогенных и экзогенных факторов, с высокой вероятностью приводящим к развитию ишемической болезни. Обнаружение миелопероксидаз в живой ткани организма при помощи неинвазивной диагностики позволяет проводить прямое обнаружение очагов воспаления в стенке кровеносных сосудов, что важно для проведения оценки нестабильности атеросклеротической бляшки. Подобная оценка нестабильности при помощи МРТ была проведена нами в живых моделях спонтанного атеросклероза и экспериментального аневризма сонных артерий. Детекция миелопероксидазной активности, проведенной на основе анализа результатов томографической визуализации ферментативной активности, в отличие от определения концентрации МПО в плазме крови, позволит различать стабильные и нестабильные атеросклеротические бляшки и определять степень риска острых сердечно- сосудистых заболеваний. Подобная же практическая направленность наших исследований на живой модели, полученной искусственно с применением катетеризации и частичной окклюзии сонной артерии кролика, позволила произвести оценку специфичности визуализации воспаления в области расширения стенки экспериментальной аневризмы. Как и в случае атеросклеротического поражения стенок сердечно-сосудистой системы, развитие нестабильности аневризм артерий головного мозга зависит от интенсивности местных воспалительных процессов. Предсказание нестабильности аневризмы на основании МРТ визуализации с применением парамагнитных субстратов миелопероксидазы важно потому, что субарахноидальное кровоизлияние из разорвавшейся аневризмы приводит к геморрагическому инсульту с летальным исходом у 55-60% пациентов.
Обнаружение ферментативной активности иммуноконъюгатов в живых системах при помощи МРТ было впервые предложено и исследовано нами в 2001 году с применением модельных систем с целью визуализации клеток, экспрессирующих маркеры клеточной поверхности, типичные для онкологической трансформации. Активность данных рецепторов (например, EGFR, т.е. рецептора эпидермального фактора роста) можно ингибировать антителами, которые препятствуют димеризации рецепторов и, как следствие, ингибируют рецептор-опосредованную передачу сигнала. Мы показали, что блокирующие химерные антитела, используемые в клинических испытаниях в качестве антипролиферативного средства при раке головы и шеи, можно ковалентно связывать с пероксидазами для визуализации рецепторположительных опухолей. Эксперименты, проведенные с помощью МРТ в живых моделях плоскоклеточной карциномы и глиомы человека у атимусных мышей и крыс, соответственно, показали, что после двухстадийного последовательного внутривенного введения конъюгатов антител и субстрата происходит не только общее возрастание МРТ сигнала (по сравнению с контрольным введением субстрата без конъюгатов), но и замедление скорости выведения парамагнитного МРТ контраста, связанное с образованием олигомеров и хелат-белковых конъюгатов.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Разработанный макромолекулярный носитель (PGC) является нанобиотехнологической системой, предназначенной для синтеза зондов-носителей диагностических меток, используемых для проведения исследований в живых системах с применением МРТ, радиоизотопных и флуоресцентных методов.
-
Связывание парамагнитных катионов PGC приводит к 2-3 кратному увеличению молярной спин-спиновой и спин-решеточной релаксации. Визуализация и биораспределение парамагнитного зонда на основе PGC в кровотоке нормальных животных свидетельствует о длительном времени полужизни при отсутствии детектируемой токсичности и иммунногенности.
-
PGC применим для визуализации и слежения за изменениями перфузируемого объема крови, отражающими особенности кровоснабжения раковой опухоли и ответ на антиангиогенную терапию.
-
Ковалентное связывание карбоцианиновых красителей с PGC приводит к самотушению флуоресценции, позволяя разрабатывать зонды для визуализации источников протеолитической активности в раковых опухолях с применением флуоресцентной визуализации в интактных животных в ближне-инфракрасном диапазоне длин волн.
-
Низкомолекулярные конъюгаты парамагнитных хелатов и соединений, содержащих монофенольные или триптаминовые остатки, являются эффективными субстратами-восстановителями пероксидаз, катализирующих образование продуктов с высокой релаксивностью парамагнитного Gd(III). Визуализация рецепторов на поверхности клеток может быть достигнута с применением МРТ, пероксидазной амплификации и парамагнитных зондов пероксидазной активности.
-
Зонды пероксидазной активности позволяют производить визуализацию локальных очагов тканевой миелопероксидазы в модельных системах. Визуализация миелопероксидазной активности при помощи разработанных зондов позволяет определять наличие нестабильности в атероме и аневризме сосудистой стенки.
Апробация работы
Материалы работы были представлены на открытом семинаре Радиологического факультета Университета штата Массачузеттс (февраль 2009 г.). Основные результаты работы были доложены на следующих международных конференциях:
Международном симпозиуме «Современные методы спектроскопии в исследовании структуры и функции биополимеров в биологии и медицине» (Май 2007, Дубна); Международного общества магнитного резонанса в медицине ISMRM: (Берлин, 1992 г.; Нью- Йорк, 1993 г.; Сан Франциско, 1994 г.; Сидней 1998 г.; Гонолулу, 2003 г.; Киото, 2004 г.; Сиаттл, 2006 г.; Берлин, 2007 г.);
Североамериканского радиологического общества RSNA (Чикаго 1992 г., 1997 г., 2003 г.);
Американской ассоциации по изучению рака AACR (Сан Франциско 2002 г.; Вашингтон, 2003 г., 2005 г.; Лос Анджелес 2005 г., Денвер 2009 г.);
Общества ядерной медицины SNM (Торонто, 2001 г.);
Американского химического общества ACS (Филадельфия, 2004 г.);
Academy of Molecular Imaging AMI (Орландо 2002 г., Сан Диего, 2003 г.; 2004 г. (1-e место в категории научных докладов);
The Society of Molecular Imaging SMI (Бостон, 2002 г.; Сан Франциско, 2003 г.; Сант Луис, 2004 г.; Кельн, 2005 г.; Провиденс, 2007 г.; Ницца, 2008 г.);
Гордоновской конференции по доставке лекарств (Блу Скай, Монтана 2004 г.); Международных конференциях по наномедицине и доставке лекарств (Балтимор, 2005 г.; Торонто, 2008 г.);
The Controlled Release Society CRS (Ницца, 1994 г.; Палм Бич, 2007 г.)
На Нобелевском Форуме (Стокгольм, 2007 г.).
Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных исследований и обработки полученных результатов, а также в проведении теоретических исследований. Основные результаты получены либо лично автором, либо под его непосредственным руководством. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Публикации
Результаты исследования опубликованы в 102 работах, включающих статьи, монографии, тезисы конференций и патенты. Диссертация обобщает данные 44 основных статей.
Структура диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов работы и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 220 страницах, содержит 44 рисунка и 12 таблиц. Список литературы включает 350 источников.
