Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Литературный обзор 12
I. Иммунная система, ее главный элемент (лимфоцит) и их роль и изменения в процессе опухолевого роста 12
2. Неспецифическая реакция организма и клеток его иммун ной системы на однократное введение под кожу физиоло гического раствора 16
3. Физико-химические свойства клеток при опухолевом росте изменения физико-химических характеристик клеток тканей, в которых развивается опухоль 18
4. Исследование заряда поверхности клеток в различных функциональных состояниях организма методом электрофо реза 24
Глава 2. Материалы и методы 50
Глава 3. Ассиериментальше результаты и обсщение 65
I. Изменения интенсивности флуоресценции 1-анилинонафта-лин-8-сульфоната, связанного лимфоцитами, отражают, в основном, изменения их мембранного потенциала (разности потенциалов между внешней и внутренней поверхностями мембраны) при постоянных значениях ионной силы и осмотического давления окружающих мембрану сред 66
2. Изменения физико-химических свойств лимфоцитов (мембранного потенциала, размеров, осмотической активностиклеток, биосинтетической активности нуклеиновых кислотв клетках) в ходе индуцированного канцерогенеза и общейреакции на повреждение обусловлены изменением их состояния 74
3. Изменения мембранного потенциала лимфоцитов в ходе индуцированного канцерогенеза и общей реакции на повреждения
4. Мембранный потенциал и заряд поверхности лимфоцитовв ходе индуцированного канцерогенеза, общей реакции на повреждение и в контроле 90
5. Изменения биосинтетической активности нуклеиновых кислот в лимфоцитах в ходе индуцированного канцероге неза и оощей реакции на поврезвдение 98
6 . Изменения размеров лимфоцитов в ходе индуцированного канцерогенеза и общей реакции на повреждение 120
7. Изменения осмотической активности лимфоцитов в ходе индуцированного канцерогенеза и общей реакции на по вреждение 123
8. Реакция мышей линии на введение физиологическо го раствора с уретаном и без него 147
9. Общий анализ полученных результатов 158
Литература 170
- Неспецифическая реакция организма и клеток его иммун ной системы на однократное введение под кожу физиоло гического раствора
- Исследование заряда поверхности клеток в различных функциональных состояниях организма методом электрофо реза
- Изменения мембранного потенциала лимфоцитов в ходе индуцированного канцерогенеза и общей реакции на повреждения
- . Изменения размеров лимфоцитов в ходе индуцированного канцерогенеза и общей реакции на повреждение
Введение к работе
Известно, что различные физиологические и патологические состояния организма определяются как специфичностью воздействия, так и неспецифической реакцией организма на разные воздействия. Общая реактивность организма определяет его защитную способность, темп и характер развития патологического процесса. Поэтому актуальной проблемой биофизики и медицины является задача детальной характеристики изменения реактивности организма. По ряду соображений наиболее удобным объектом для такой характеристики можно считать лимфоциты /18,40,56/. Однако используемые в настоящее время характеристики лимфоцитов, лежащие в основе показателя состояния организма, преимущественно, цитологические и биохимические. В то же время можно полагать, что более тонкими являются физико-химические характеристики состояния клеток /79/, и прежде всего, электрические свойства их поверхности .
В связи со сказанным основными задачами диссертационной работы стали разработка и использование физико-химических методов характеристики состояния лимфоцитов при изменении общего состояния организма животного. В качестве объектов исследования был избран процесс индуцированного канцерогенеза /30,142/ и реакция организма на однократное введение под кожу неканцерогенного вещества (0,2 мл физиологического раствора) - общая реакция на повреждение /29/.
Целью работы являлось выяснение различий изменений физико-химических свойств лимфоцитов с первых часов развития индуцированного канцерогенеза и общей реакции на повреждение.
Научная новизна работы.
В результате проведенной работы показано, что изменения интенсивности флуоресценции красителя-зонда 1-анилинонафталин-8- сульфоната, связанного лимфоцитами, отражают, в основном, изменения мембранного потенциала клеток (разности потенциалов между внутренней и внешней поверхностями мембраны) при постоянных значениях ионной силы и осмотического давления окружающих мембрану сред. Известно, что отношение интенсивности флуоресценции связанного клетками акридинового оранжевого в красной части спектра (640 нм) к интенсивности флуоресценции его в зеленой части спектра (530 нм) отражает биосинтетическую активность нуклеиновых кислот в клетках /35/, электрофоретическая подвижность клеток отражает заряд их поверхности /25/, а изменения объема клеток в зависимости от концентрации окружающего их раствора - осмотическую активность клеток /62/.
По этим характеристикам лимфоцитов прослежено изменение состояния организма мышей линии А в ответ на подкожное введение 0,2 мл физиологического раствора и при развитии аденом легких, индуцированных уретаном, введенным в том же количестве физиологического раствора /30,142/.
Обнаружено, что существуют определенные фазы изменений физико-химических свойств лимфоцитов в ходе развития индуцированного канцерогенеза и общей реакции на повреждение, что подтверждает данные работы /30/ по изменению электрофоретической подвижности лимфоцитов в этих процессах.
Обнаружено, что в ходе индуцированного канцерогенеза и общей реакции на повреждение физико-химические свойства лимфоцитов изменяются двумя различными путями, приводящими в первом случае к увеличению осмотически активного объема клеток, а во втором - к уменьшению. Эти различия осмотической активности лимфоцитов в ходе индуцированного канцерогенеза и общей реакции на повреждение являются надежным критерием различения этих процессов.
Показано, что критерий различения путей изменения осмотического состояния лимфоцитов в ходе индуцированного канцерогенеза и общей реакции на повреждение в равной мере относится к лимфоцитам селезенки, тимуса и крови.
При анализе экспериментального материала представлены соображения в пользу существования двух уровней мембранного потенциала в разных функциональных состояниях лимфоцитов.
Практическое значение работы. Обнаруженные различия в изменениях физико-химических свойств лимфоцитов в ходе индуцированного канцерогенеза и общей реакции на повреждение могут быть использованы для целей дифференциальной диагностики в экспериментальных исследованиях.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения и выводов.
В первой главе представлены литературные данные о роли и изменениях иммунной системы и ее главного элемента (лимфоцита) в процессе опухолевого роста, неспецифической реакции организма и клеток его иммунной системы на однократное введение под кожу физиологического раствора. Описаны имеющиеся сведения об изменениях физико-химических свойств клеток тканей, в которых развивается опухоль. Представлены данные об изменении физико-химических свойств лимфоцитов при опухолевом процессе: размеров, заряда поверхности, мембранного потенциала, интенсивности синтеза нуклеиновых кислот и белков. Представлены литературные данные о модели опухолевого роста, индуцированного уретаном, и физико-химических изменениях в организме и его иммунной системе в этой модели.
Описаны имеющиеся сведения о возможности исследования физико-химических свойств клеток различными методами: об исследовании изменений заряда поверхности клеток методом электрофореза, о возмож- - 8 -ности исследования мембранного потенциала при помощи флуоресцентного красителя-зонда 4-(Г\~диметиламиностирил)-1-метилпиридиния, об исследовании биосинтетической активности нуклеиновых кислот в клетках при помощи красителя акридинового оранжевого, о возможности оценки изменений физико-химических характеристик клеток при помощи флуоресцентного красителя-зонда І-анилинонафталин-8-сульфо-ната. Поскольку одной из возможных физико-химических характеристик состояния клеток может быть их осмотическая активность /108/, в этой главе представлены данные об осмотическом поведении клеток в неизотонических средах.
Для сопоставления в дальнейшем (в главе 3) изменений мембранного потенциала лимфоцитов в ходе индуцированного канцерогенеза и общей реакции на повреждение с изменениями мембранного потенциала нервного волокна и симпласта высшего растения при повреждении описаны имеющиеся сведения об электрических сигналах, распространяющихся по симпласту высшего растения (вариабельном сигнале) и нервному волокну при повреждении.
Во второй главе описаны материалы и методы, применявшиеся в эксперименте. В ней подробно рассмотрены методы исследования интенсивности флуоресценции связанных лимфоцитами красителей-зондов І-анилинонафталин-8-сульфоната и 4-(П -диметиламиностирил)-1-ме-тилпиридиния, метод оценки биосинтетической активности нуклеиновых кислот в клетках при помощи красителя акридинового оранжевого, метод исследования заряда поверхности клеток по их электрофоретичес-кой подвижности, метод исследования осмотической активности клеток по изменению их объема в зависимости от концентрации окружающего клетки раствора, стандартный метод исследования размеров клеток по их диаметру.
В третьей главе представлены полученные экспериментальные данные и их обсуждение.
В этой главе показано, что изменения интенсивности флуоресценции связанного лимфоцитами І-анилинонафталин-8-сульфоната отражают, в основном, изменения мембранного потенциала лимфоцитов (разности потенциалов между внутренней и внешней поверхностями мембраны) при постоянных значениях ионной силы и осмотического давления окружающих мембрану сред.
В этой главе подробно описаны результаты исследования физико-химических свойств лимфоцитов в ходе индуцированного канцерогенеза и общей реакции на повреждение по измерению интенсивности флуоресценции связанного лимфоцитами І-анилинонафталин-8-сульфоната как показателя мембранного потенциала клеток, по исследованию отношения интенсивностей флуоресценции связанного лимфоцитами акридинового оранжевого в красной и зеленой частях спектра как показателя биосинтетической активности нуклеиновых кислот в клетках, по исследованию электрофоретической подвижности лимфоцитов как показателя заряда поверхности клеток, по измерению диаметра лимфоцитов как показателя размеров клеток, по исследованию изменений объема лимфоцитов в зависимости от концентрации окружающего их раствора как показателя осмотической активности клеток. Показано, что изменения физико-химических свойств лимфоцитов являются адекватным показателем состояния организма животного.
Подробно описаны обнаруженные экспериментально отличия путей изменения физико-химических свойств лимфоцитов в ходе индуцированного канцерогенеза и общей реакции на повреждение. Показано, что в ходе общей реакции на повреждение после деполяризации и гиперполяризации мембраны лимфоцитов наблюдается ее повторная деполяризация. При развитии реакции увеличиваются размеры клеток, их неосмотический объем, уменьшается степень набухания лимфоцитов в гипотоничес- - 10 -ких средах.
Показано, что в ходе индуцированного канцерогенеза после деполяризации и гиперполяризации мембраны лимфоцитов наблюдается ее повторная гиперполяризация. При развитии процесса происходит большее, по сравнению с общей реакцией на повреждение, увеличение размеров лимфоцитов. Неосмотический объем клеток в ходе индуцированного канцерогенеза не изменяется, а степень набухания в гипотонических средах увеличивается, в отличие от общей реакции на повреждение. При развитии индуцированного канцерогенеза изменяется биосинтетическая активность нуклеиновых кислот в лимфоцитах, чего не наблюдается в общей реакции на повреждение.
Сделан вывод о том, что различия осмотической активности лимфоцитов в ходе индуцированного канцерогенеза и общей реакции на повреждение являются надежным критерием различения этих процессов.
В этой главе представлены соображения в пользу существования двух уровней мембранного потенциала в разных функциональных состояниях лимфоцита. Найдены зависимости между зарядом поверхности клетои и ее мембранным потенциалом. Показано, что изменения мембранного потенциала лимфоцитов в ответ на введение животным физиологического раствора с уретаном или без него аналогичны изменениям мембранного потенциала нервного волокна и симпласта высшего растения при повреждении.
В этой главе показано, что изменения физико-химических свойств лимфоцитов в ходе индуцированного канцерогенеза обусловлены индукцией опухолей, а не реакцией на уретан как химическое соединение.
В конце главы приведен общий анализ полученных результатов.
В заключении кратко подведены основные итоги работы и рассмотрены перспективы дальнейших исследований. - II -
В выводах сформулированы основные результаты работы.
Список публикаций по теме диссертации содержит пять наименований.
Апробация работы. Основные результаты работы неоднократно докладывались на научном семинаре кафедры биофизики физического факультета МГУ, а также на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982).
Неспецифическая реакция организма и клеток его иммун ной системы на однократное введение под кожу физиоло гического раствора
Как уже подчеркивалось, различные физиологические и патологические состояния организма определяются как специфичностью воздействия, так и неспецифической реакцией организма на разные воздействия /57/. Насонов Д.Н. и Александров В.Я. писали: "...Одним из самых удивительных свойств живых клеточных элементов, подме - 17 -ченных еще физиологами прошлого столетия, является способность клеток однозначно реагировать на действие самых разнообразных по своей физической и химической природе внешних агентов".
Индукцию химического канцерогенеза часто осуществляют путем введения в организм канцерогена, растворенного в физиологическом растворе /30/. Поэтому исследование неспецифической реакции организма на введение физиологического раствора параллельно изучению опухолевого роста, индуцированного введением канцерогена в том же количестве физиологического раствора, представляет несомненный интерес. Ниже приведены литературные данные об изменениях некоторых характеристик состояния организма и лимфоцитов в ответ на однократное введение под кожу мыши 0,2 мл физиологического раствора - данные об общей реакции организма на повреждение /29/.
В экспериментах на мышах линии А /29/ подчеркивается,что в ходе ОРП возникает двухфазное изменение разности электрических потенциалов (РЭП) между конечностями и грудным отделом позвоночника мыши. В первые десять дней после укола РЭП меньше контрольных значений, а в последующие 15 дней - больше. Синхронное изменение РЭП, полученное в трех различных отведениях, показывает, что реакция охватывает весь организм в целом /29/.
Авторы исследования /29/ отмечают, что их эксперименты согласуются с исследованиями А.А.Заварзина относительно общего изменения физиологического состояния организма при воспалительной реакции и позволяют предположить, что за изменения РЭП при повреждении ответственна базальная мембрана - пограничное образование между эпителием и соединительной тканью, которое регулирует взаимосвязь между ними.
В работе /30/ представлены результаты исследования методом клеточного электрофореза заряда поверхности лимфоцитов селезенки- 18 мышей линии А в ходе ОРП. В этой работе показано, что заряд поверхности лимфоцитов изменяется в ответ на введение под кожу физиологического раствора.
Таким образом, литературные данные показывают, что однократное введение под кожу мыши 0,2 мл физиологического раствора приводит к изменениям электрических характеристик состояния организма и лимфоцитов. 3. Физико-химические свойства клеток при опухолевом росте.п.1. Изменения физико-химических характеристик клеток тканейА в которых развивается р_пухр_ль.
Рядом авторов обнаружены изменения в интенсивности синтеза нуклеиновых кислот в клетках, изменения в поверхности, биохимии, размерах клеток тканей, в которых непосредственно развивается опухоль /6,12,13,37,94,102,114,134,138/.Так, на начальных стадиях химического и вирусного канцерогенеза обнаружено /94,114,138/ подавление синтеза дезоксирибонуклеи-новой кислоты (ДНК) клеток тканей, в которых позже развивалась злокачественная опухоль. Обнаружено увеличение синтеза ДНК клетками легких мышей линии А после подкожного введения животным уре-тана (в дозе 0,25 мг/г), который индуцирует опухоли в легких /37/. Причем, это увеличение отмечается еще в предопухолевом периоде. Балаш А. и Блажек И. /6/ подчеркивают отличие клеток тканей, в которых развивается опухоль, от нормальных клеток по размерам, структуре поверхности, специфической функции. Ряд исследователей /102,134/ отмечают изменение соотношения свободной и связанной воды в клетках тканей, в которых развивается опухоль, по сравнению с нормальными клетками. Это соотношение оценивалось по време - 19 нам ядерной магнитной релаксации протонов воды.
Таким образом, в представленных выше работах показано, что физико-химические характеристики клеток тканей, в которых развивается опухоль, отличаются от физико-химических характеристик нормальных клеток.
п.2._Имшения і при опухолевом осте:_размеов,_заряда поверхнр ти мем бранного потенциала интенсивности синтеза нуклеиновыхкислот_и_белков.
Ряд работ посвящен изучению изменений физико-химических свойств лимфоцитов в процессе опухолевого роста: размеров, заряда поверхности, мембранного потенциала, интенсивности синтеза нуклеиновых кислот и белков.Многими исследователями подчеркивается /127,145,146/, что в первой фазе развития канцерогенеза лимфоциты готовятся к наступлению на трансформированные клетки: в лимфоцитах наблюдается усиление синтеза ДНК, который обеспечивает функциональную готовность иммунокомпетентных клеток к образованию различных цитотоксических факторов белковой природы, оказывающих деструктивное действие на опухолевые клетки.
Уманский Ю.А. и сотрудники также занимались исследованием этой проблемы /70,71/. За I час до исследования состояния лимфо-идных органов они вводили мышам внутрибрюшинно тимидин-Н с удельной активностью 10 мкгори/мл по 1,0 мкюри на I г веса животного. Из селезенки и лимфатических узлов они готовили отпечатки, которые фиксировали метанолом. Отпечатки покрывали жидкой фотоэмульсией и экспонировали в темноте при t =4С в течение недели. Затем отпечатки проявляли, окрашивали по-Романовскому, микроско - 20 пировали и определяли индекс меченых лимфоцитов (то есть количество лимфоцитов, в ядрах которых происходит синтез ДНК). По количеству зерен серебра в каждом меченом лимфоците оценивали интенсивность синтеза ДНК в ядре данной клетки. Уманским Ю.А. и сотрудниками было обнаружено /70,71/, что в процессе индуцированного метилхолантреном канцерогенеза лимфоциты активно реагируют на развивающуюся опухоль. Так, у мышей линии ВА1В/с в ядрах лимфоцитов лимфатических узлов в течение латентного периода развития опухоли наблюдается увеличение интенсивности синтеза ДНК. Предполагается, что повышение интенсивности синтеза ДНК в лимфатических узлах представляет собой обычный ответ на гетерогенный антиген. При появлении опухоли в лимфоцитах лимфатических узлов отмечается снижение интенсивности синтеза ДНК. В селезенке через месяц после введения мышам канцерогена отмечается снижение интенсивности синтеза ДНК в ядрах лимфоцитов по сравнению с контролем. У мышей с развившейся опухолью в лимфоцитах селезенки интенсивность синтеза ДНК тоже понижена.
Исследование заряда поверхности клеток в различных функциональных состояниях организма методом электрофо реза
Исследование заряда поверхности клеток в различных функциональных состояниях организма методом электрофореза.Одним из методов определения заряда поверхности клеток явлется электрофорез - направленное движение клеток в электрическом поле /23,25,59,65,143/. Электрофоретическая подвижность клетки (ЭФП) представляет собой отношение скорости, приобретенной клеткой в электрическом поле, к величине напряженности этого поля и определяется зарядом поверхности клетки при прочих равных условиях измерения.
Многие авторы исследуют заряд поверхности лимфоцитов по их ЭФП в различных функциональных состояниях организма /9,41,47/. При лимфатической лейкемии методом электрофореза обнаружена группа ядросодержащих клеток с зарядом поверхности, равным заряду поверхности нормальных эритроцитов /41/. В процессе развития противоопухолевой реакции зарегистрировано увеличение заряда поверхности лимфоцитов по увеличению их ЭФП /137/.Таким образом, судя по литературным данным 4, можно оценивать заряд поверхности клеток в различных функциональных состояниях организма методом электрофореза. 5. Исследование мембранного потенциала, заряда поверхности клеток и биосинтетической активности нуклеиновых кислот в клетках при помощи флуоресцентных красителей.
Как следует из выше сказанного, важными характеристиками состояния лимфоцитов служат их мембранный потенциал, заряд поверхности и биосинтетическая активность нуклеиновых кислот в них. С точки зрения простоты, доступности и чувствительности в случае малого количества клеток метод, основанный на использовании флуоресцентных красителей в изучении этих свойств клеток,часто не имеет себе равного /17/. Флуоресцентные красители в последнее время все чаще используются при изучении структуры и функций клеток . Широко использование этих красителей для исследования характеристик состояния клеток в различных физиологических и патологических состояниях организма .
Флуориметрии отдельных клеток посвящено большое число обзоров и монографий /4,7,35,45,78/. Исследованием клеток с помощью флуоресцентных красителей занимался, в частности, Ньютон /131/. Клетке присуща собственная флуоресценция /7,35,78/, однако флуоресценция красителя в ней в десятки раз ярче.
Для интерпретации флуоресцентного ответа клетки на изменение внешних или внутренних условий нужно знать, где локализуется краситель и какие изменения в клетке вызывает его связывание с ней. Краситель выступает как неспецифический индикатор изменения состояния клеток. Когда же изменения обнаружены, то нужно выяснить их физический механизм. Выяснение физической природы многих эмпирически наблюдавшихся изменений состояния клетки можно вьшолнить /17/, используя разные красители и изучая разные параметры флуоресценции - 02 Ь анилинонао т ин -суль онат как индикатор изменений и шсо-химических характеристик клеток Согласно литературным данным /17,46,67,84,98/, одним из флуоресцентных красителей-зондов, наиболее часто используемых для оценки изменений физико-химических характеристик клеток, является І-анилинонафталин-8-сульфонат (АНС) (рис.1(a)). С какими группами связывается АНС в мембране? Точного ответа на этот вопрос в литературе нет. Данные, посвященные исследованию локализации АНС в биологических мембранах, весьма противоречивы. Исследовали /103/ роль белков и липидов, с которыми может связываться АНС, удалением первых протеазами, а вторых - фосфолипазами. Было обнаружено /103/, что обработка клеток фосфолипазой снижала связывание АНС, а обработка протеазами не влияла на связывание зонда. По данным других работ протеазы снижали связывание зонда, а фосфолипазы - нет (цит. по /17/). Цредполагается (цит. по /17/), что часть АНС связана с белками, а часть - с липидами. В пользу этого свидетельствует тот факт, что кривая затухания флуоресценции АНС в белково-липидных мембранах описывается суммой двух экспонент, тогда как в изотропных средах (органических растворителях) затухание моноэкспоненциально (цит. по /17/). Владимиров Ю.А. и Добрецов Г.Е. отмечают /17/, что при связывании с мембраной молекула АНС не может погрузиться глубоко в бислой, так как заряженная сульфогруппа должна оставаться на поверхности. Горизонтальная ориентация длинной оси молекулы /87/ не позволяет погрузить в бислой фенильное кольцо. Отмечается /17/, что при расположении АНС в мембране из фосфатидилхолина молекула зонда одной поверхностью фенильного кольца примыкает к глицериновым участкам фосфолипида, а другой контактирует с водой (рис.2).Какие же физико-химические свойства клеток можно исследовать при помощи АНС?
Изменения мембранного потенциала лимфоцитов в ходе индуцированного канцерогенеза и общей реакции на повреждения
раствора отнесенное к контрольной величине среднее значение интенсивности флуоресценции АНС, связанного лимфоцитами, увеличивается по сравнению с единицей. При этом 1 равно (6,38+0,10) отн.ед. для селезенки, (5,72+0,11) отн.ед. для тимуса и (5,38+ 0,12) отн.ед. для крови, что, соответственно, в (1,09+0,03) раза, в (1,17+0,03) раза и в (1,10+0,03) раза больше контрольного значения I , которое в это время равно (5,84+0,16) отн.ед. для селезенки, (4,90+0,10) отн.ед. для тимуса и (4,88+0,10) отн.ед. для крови.
Из таблиц 4,5,6 видно, что примерно со 2-3 дня развития 0РП отнесенные к контрольным величинам средние значения интенсивности флуоресценции АНС, связанного лимфоцитами селезенки, тимуса и крови, падают ниже единицы, уменьшаются день за днем, достигая минимума к 7-9 дню, а затем увеличиваются и становятся равными единице к 11-12 дню. На этом этапе значение I , соответствующее точке минимума отнесенного к контрольной величине среднего значения интенсивности флуоресценции АНС, связанного лимфоцитами, равно (4,18+0,09) отн.ед. для селезенки, (3,38 0,08) отн.ед. для тимуса и (3,45+0,20) отн.ед. для крови, что, соответственно, в (1,47+0,03) раза, в (1,51+0,06) раза и в (1,48+0,25) раза меньше контрольной величины І в той же точке.
Примерно с 12 дня развития 0РП начинается новый и последний этап изменения отнесенных к контрольным величинам средних значений интенсивности флуоресценции АНС, связанного лимфоцитами селезенки, тимуса и крови: ІФ/1 растет по сравнению с единицей, достигая максимума к 14-16 дню, а к 17-19 дню возвращается к единице. В течение этого периода времени значения Іф/ік остаются больше единицы. При этом значение I , соответствующее точке максимума отнесенного к контрольной величине среднего значения ин - 85 -тенсивности флуоресценции АНС, связанного лимфоцитами, равно (7,20 0,15) отн.ед. для селезенки, (6,00+0,18) отн.ед. для тимуса и (5,94+0,23) отн.ед. для крови, что, соответственно, в (1,16 +0,04) раза, в (1,15+0,05) раза и в (1,15+0,07) раза больше контрольной величины 1 в той же точке. После 17-19 дня значения 1Ф/1К не отличаются от единицы.
Таблицы 4,5,6 показывают, что при развитии ИК, как и в случае 0РП, имеют место немонотонные изменения средних значений интенсивности флуоресценции АНС, связанного лимфоцитами селезенки, тимуса и крови мышей линии А. На протяжении всех дней развития ИК I варьирует от (4,04+0,20) отн.ед. до (6,68 0,08) отн.ед. для селезенки, от (3,05+0,13) отн.ед. до (5,84+0,12) отн.ед. для тимуса и от (3,23 0,58) отн.ед. до (5,92+0,11) отн.ед. для крови.Таблицы 4,5,6 показывают, что на протяжении первых 12 дней развития ИК интенсивность флуоресценции связанного лимфоцитами АНС изменяется примерно так же, как и на протяжении того же периода развития ОРП.
Через 4 часа после введения животным уретана, растворенного в физиологическом растворе, отнесенное к контрольной величине среднее значение интенсивности флуоресценции связанного лимфоцитами АНС увеличивается, по сравнению с контрольным уровнем. При этом I в случае ИК равно (6,68+0,08) отн.ед. для селезенки, (5,84+0,12) отн.ед. для тимуса и (5,92+0,11) отн.ед. для крови, что, соответственно, в (1,14+0,03) раза, в (1,19+0,03) раза и в (1,21+0,03) раза больше контрольного значения І в это время.Примерно со 2-3 дня развития ИК отнесенные к контрольным величинам средние значения интенсивности флуоресценции АНС, связанного лимфоцитами селезенки, тимуса и крови, становятся меньше единицы, дрстигают минимума к 7-9 дню, а затем увеличиваются до - 86 единицы к 12 дню. На этом этапе значение I , соответствующее точке минимума отнесенного к контрольной величине среднего значения интенсивности флуоресценции АНС, связанного лимфоцитами, равно (4,04+0,20) отн.ед. для селезенки, (3,05+0,13) отн.ед. для тимуса и (3,23+0,58) отн.ед. для крови, что, соответственно, в (1,53+0,09) раза, в (I,6&f0,09) раза и в (1,53+0,29) раза меньше контрольной величины 1 в той же точке.С 12 дня развития ИК изменения интенсивности флуоресценции связанного лимфоцитами АНС отличаются от изменений того же параметра в ходе ОРП.
Если в серии ОРП с 12 по 17-19 день 1ф/1к больше единицы, то в серии ИК 1у/1 не отличается от единицы с 12 по 22-23 день развития процесса. Примерно с 23 дня развития ИК отнесенные к контрольным величинам средние значения интенсивности флуоресценции АНС, связанного лимфоцитами селезенки, тимуса и крови, становятся меньше единицы, достигают минимума к 28 дню, затем увеличиваются до единицы примерно к 32 дню. Таким образом, приблизительно с 23 по 32 день развития ИК Ь// к меньше единицы, в то время как 1ф/Ік в этот период развития ОРП остается на контрольном уровне. В течение этого периода времени в случае ИК среднее значение интенсивности флуоресценции АНС, связанного лимфоцитами, соответствующее точке минимума Iv/ік » равно (5,16+0,22) отн.ед. для селезенки, (4,33+0,12) отн.ед. для тимуса и (4,45+0,21) отн. ед. для крови, что, соответственно, в (1,20+0,05) раза, в (1,23+ 0,04) раза и в (1,21+0,07) раза меньше контрольной величины І в той же точке.Как уже было сказано в литературном обзоре, при изменении физиологического состояния организма возможно изменение мембранного потенциала лимфоцитов /90,95/. В связи с этим представляет интерес исследование мембранного потенциала лимфоцитов в ходе ИК и ОРП. Выше было показано, что изменения мембранного потенциала лимфоцитов можно исследовать по изменениям интенсивности флуоресценции связанного ими АНС. Причем, увеличение интенсивности флуоресценции АНС, связанного лимфоцитами, означает уменьшение их мембранного потенциала, и наоборот, уменьшение интенсивности флуоресценции связанного лимфоцитами АНС означает увеличение их 77 мембранного потенциала (МП).
В таблицах 4,5,6 представлена кинетика изменения средних значений интенсивности флуоресценции (I , отн.ед.) АНС, связанного лимфоцитами селезенки, тимуса и крови мышей линии А, в процессах развития ОРП, ИК и в контроле, а также зависимость отнесенных к контрольным величинам средних значений интенсивности флуоресценции ІШС, связанного теми же клетками, от времени, прошедшего с момента введения животным физиологического раствора
Таблицы 4,5,6 показывают, что средние значения интенсивности флуоресценции АНС, связанного лимфоцитами селезенки, тимуса и крови контрольных мышей линии А, изменяются незначительно на протяжении всех дней эксперимента: I варьирует от (5,78-+0,16) отн. ед. до (6,58 0,II) отн.ед. для селезенки, от (4,86 0,12) отн.ед. до (5,54+0,16) отн.ед. для тимуса и от (4,45+0,20) отн.ед. до (5,9С 0,20) отн.ед. для крови при среднем значении по всем дням, равном, соответственно, (6,42+0,03) отн.ед., (5,21+0,03) отн.ед. и (5,23+0,06) отн.ед. Видно, что в случае селезенки І в среднем в 1,23 раза больше, чем в случае тимуса и крови. А значения I для тимуса и крови практически совпадают.
После введения мышам линии А 0,2 мл физиологического раствора средние значения интенсивности флуоресценции АНС, связанного лимфоцитами селезенки, тимуса и крови, существенно изменяются с пределами варьирования от (4,18 0,09) отн.ед. до (7,40+0,13) отн.ед. для селезенки, от (3,38 0,08) отн.ед. до (6,00+0,18) отн. ед. для тимуса и от (3,38 0,15) отн.ед. до (6,20+0,14) отн.ед. для крови. Как показывают таблицы 4,5,6, изменение I при развитии ОРП имеет немонотонный характер.
. Изменения размеров лимфоцитов в ходе индуцированного канцерогенеза и общей реакции на повреждение
Как следует из литературного обзора, в процессе опухолевого роста лимфоциты могут увеличиваться в размерах /70,71,106,108/ Поэтому представляет интерес исследование размеров клеток в процессах развития ИК и ОРП. В работе размеры лимфоцитов выражены в виде их диаметра.
В таблицах 14,15,16 представлена кинетика изменения средних значений диаметра (Ds мкм) лимфоцитов селезенки, тимуса и крови мышей линии А в процессах развития ОРП, ИК и в контроле, а также зависимость отнесенных к контрольным величинам средних значений диаметра тех же клеток от времени, прошедшего с момента введения животным физиологического раствора (Оф/Ок) и уретана (0 /Ок).
Таблицы 14,15,16 показывают, что средние значения диаметра лимфоцитов селезенки, тимуса и крови контрольных мышей изменяются незначительно на протяжении всех дней эксперимента: D варьирует от (6,32+0,05) мкм до (7,30+0,09) мкм для селезенки, от (6,31+0,06) мкм до (7,34+0,09) мкм для тимуса и от (6,290,09) мкм до (7,I8fO,10) мкм для крови при среднем значении, равном, соответственно, (6,84+0,04) мкм, (6,93+0,04) мкм и (6,77+0,05) мкм. Из представленных данных видно, что средние значения диаметра лимфоцитов селезенки, тимуса и крови контрольных животных очень мало отличаются друг от друга.
После введения мышам 0,2 мл физиологического раствора среднее значение диаметра D лимфоцитов изменяется с пределами варьирования от (6,52+0,08) мкм до (8,21+0,10) мкм для селезенки, от (6,51+0,07) мкм до (8,61+0,12) мкм для тимуса и от (6,47+0,10) мкм до (8,41+0,22) мкм для крови.
Таблица 14. Кинетика изменения среднего значения диаметра (D , мкм) лимфоцитов селезенки мьппей линии А в процессах развития ОРП, ИК и в контроле. Зависимость отношений Оф/О . и Оу/Окдля лимфоцитов селезенки мышей линии А от времени, прошедшего с момента введения животным физиологического раствора и уретана. Начиная с 4 дня с момента введения животным физиологического раствора,средние значения диаметра лимфоцитов селезенки, тимуса и крови, отнесенные к контрольным величинам (Оф/Dy;), начинают увеличиваться и растут день за днем примерно до 8 дня. В последующие дни развития ОРП отнесенные к контрольным величинам средние значения диаметра клеток незначительно колеблются (оставаясь больше единицы) примерно до 40-43 дня, после чего начинают уменьшаться и становятся равными единице к 50-52 дню. Этот процесс увеличения и последующего уменьшения размеров лимфоцитов в процессе ОРП имеет место как для селезенки, так и для тимуса и крови. Среднее значение диаметра лимфоцитов с 8 по 40-43 день развития ОРП равно (7,74+0,07) мкм для селезенки, (8,05+0,12) мкм для тимуса и (7,65+0,12) мкм для крови. На протяжении этого же периода времени среднее значение диаметра контрольных лимфоцитов равно (6,84+0,05) мкм для селезенки, (6,92+0,06) мкм для тимуса и (6,7W3,08) мкм для крови. Значит, с 8 по 40-43 день развития ОРП среднее значение диаметра клеток больше контрольного значения в (1,13+0,01) раза для селезенки, в (1,16+0,02) раза для тимуса и в (1,13+0,02) раза для крови. Видно, что увеличение среднего значения диаметра клеток в ходе ОРП одинаково для лимфоцитов селезенки, тимуса и крови.
Таблицы 14,15,16 показывают, что введение мышам линии А уре-тана, растворенного в физиологическом растворе, изменяет размеры клеток, наблюдаемые в контроле и ОРП. В серии ИК среднее значение диаметра лимфоцитов варьирует от (6,96+0,18) мкм до (9,20+0,12) мкм для селезенки, от (6,91+0,11) мкм до (9,34+0,11) мкм для тимуса и от (6,87+0,07) мкм до (8,90+0,10) мкм для крови.
В процессе развития ИК среднее значение диаметра лимфоцитов, отнесенное к контрольной величине (UY/UK), увеличивается по сравнению с единицей на 2-4 день с момента введения животным уре-тана, растворенного в физиологическом растворе, растет день за днем примерно до 10 дня, а после 10 дня незначительно варьирует, оставаясь выше контрольного уровня. Причем отнесенное к контрольной величине среднее значение диаметра лимфоцитов увеличивается в течение первых 8 дней развития процесса ИК так же, как и в ОРП в тот же период времени. Но поскольку рост относительного среднего значения диаметра лимфоцитов в ходе ИК заканчивается к 10 дню, а в ходе ОРП - к 8 дню, то в итоге увеличение относительного среднего значения диаметра клеток в случае ИК оказывается большим, чем в случае ОРП.
Среднее значение диаметра клеток с 10 дня развития ИК до конца опытов равно (8,35+0,09) мкм для селезенки, (8,69f0,I0) мкм для тимуса и (8,10 0,13) мкм для крови. Среднее значение диаметра контрольных лимфоцитов за этот период равно (6,81+0,05) мкм для селезенки, (6,89+0,05) мкм для тимуса и (6,70+0,07) мкм для крови. Значит, в процессе развития ИК, начиная с 10 дня, среднее значение диаметра лимфоцитов превышает контрольное значение в среднем в (1,23+0,02) раза, в (1,26+0,02) раза и в (1,21 +0,02) раза для селезенки, тимуса и крови, соответственно. Видно, что увеличение среднего значения диаметра клеток в ходе ИК примерно одинаково для селезенки, тимуса и крови.
Для большей наглядности представленная в таблицах 14,15,16 зависимость отношений Оф/Ок и Dv/Dv от времени,прошедшего с момента введения животным физиологического раствора и уретана, изображена на рис.13.
