Введение к работе
Актуальность проблемы. Поиск новых, более информативных показателей для оценки состояния организма в норме и при заболеваниях является актуальной задачей медико-биологической науки. Такой поиск ведется различными методами, включая биофизические. В частности, в последние годы внимание исследователей привлекают изменения конформации (например, у прионов) и других физико-химических свойств белков, связанные с развитием патологических процессов в организме.
Одним из белков, легко подвергающихся модификациям, является альбумин - белок (около 66 кДа), составляющий около половины массы белков плазмы крови и присутствующий во всех жидкостях организма. В составе межклеточной жидкости альбумин взаимодействует почти со всеми клетками и в процессе циркуляции изменяется в зависимости от состояния органов и тканей Около 15 лет назад в НИИ ФХМ был создан флуоресцентный метод для обнаружения модификаций альбумина Метод основан на нековалентном взаимодействии с альбумином оригинального специфического красителя, получившего название К-35 В сыворотке или плазме крови К-35 флуоресцирует практически только из альбумина, что позволяет изучать этот белок без его выделения из плазмы, то есть в нативном состоянии [Грызунов и Добрецов 1994,1998]
Этот новый тест позволил обнаружить изменения центров альбумина при ряде заболеваний. Причем изменения оказались зависимы от тяжести состояния больного и прогноза развития заболевания Клинические исследования показали высокую информативность флуоресцентного теста при распространенном перитоните, острых отравлениях, острых сердечно-сосудистых состояниях, при хронических заболеваниях печени, при ряде офтальмологических заболеваний [Гринберг 1999, Родоман 2001, Luzhnikov 2002, Титов 2002, Курышева 2000]
Биофизические основы изменений альбуминовых центров при заболеваниях и механизмы высокой чувствительности показателей флуоресцентного теста к состоянию организма оставались во многом неясными Раскрытие этих основ имеет как фундаментальное, так и прикладное значение для медико-биологической науки и биофизики
Ранее взаимодействие К-35 с альбумином характеризовали лишь двумя измеряемыми флуоресцентными параметрами (см Рис I на стр 7) Имело смысл увеличить число измеряемых параметров за счет регистрации кинетики затухания флуоресценции зонда, чтобы иметь больше информации об изменениях в молекуле альбумина. Эти новые параметры нуждались в физической интерпретации. Особенно актуально стоял вопрос об интерпретации гетерогенности затухания флуоресценции К-35 в альбумине
Усовершенствовав таким образом метод, можно было попытаться обнаружить и исследовать изменения молекулы альбумина при психических расстройствах, особенно при их первом эпизоде (когда обычные лабораторные показатели чаще всего остаются в пределах нормы).
Изменения альбуминовых центров были обнаружены при самых разных заболеваниях [Грызунов и Добрецов 1998] Такая универсальность реакции альбумина на патологический процесс может быть связана с тем, что стресс, который сопровождает каждое заболевание, приводит к изменению связывающих центров альбумина. Необходимо было проверить это предположение в прямых опытах
Анализ состояния проблемы позволил сформулировать цель и задачи настоящего исследования
Цель работы - повышение информативности флуоресцентного альбуминового теста и раскрытие механизмов его чувствительности к изменениям связывающих центров альбумина при заболеваниях.
Задачи исследования:
1 Методом флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением КГ10 сек исследовать молекулярные механизмы взаимодействия флуоресцентного зонда К-35 с альбумином.
-
Расширить информативность флуоресцентного альбуминового теста путем воздействия на молекулу альбумина средами разного ионного состава и регистрации процессов затухания флуоресценции зонда К-35 с временным разрешением 10~10 сек.
-
Используя новые параметры, исследовать связывающие центры альбумина у больных параноидной шизофренией и депрессией при первом эпизоде болезни до начала терапии и при хроническом течении заболевания
4 В прямых опытах на животных выяснить, существует ли связь между особенностями их поведения, реакцией на стресс и свойствами связывающих центров альбумина.
Научная новизна работы. В работе с помощью флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением 10"10 сек раскрыты молекулярные механизмы взаимодействия с молекулой альбумина флуоресцентного зонда К-35, используемого для регистрации изменений альбуминовых центров Впервые показано, что различным временам затухания флуоресценции зонда соответствуют различные участки связывания в альбуминовой глобуле
Возможности альбуминового флуоресцентного теста были расширены путем воздействия на молекулу альбумина средами разного ионного состава и регистрации процессов затухания флуоресценции с временным разрешением 10"10 сек Это позволило впервые зарегистрировать изменения связывающих
центров альбумина при первом эпизоде шизофрении и при депрессии до начала лечения
Впервые в экспериментах на животных показана связь между особенностями поведения, стрессом и свойствами альбуминовых центров. Выявлены молекулярные и патофизиологические факторы, определяющие высокую чувствительность флуоресценции К-35 и альбуминовых центров к состоянию организма
Положения, выносимые на защиту.
-
С использованием флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением 10~10 сек изучены молекулярные механизмы взаимодействия зонда К-35 (Ы-(карбокси)фенилимида диметиламинонафталевой кислоты) с альбуминовыми центрами. Молекулы К-35, флуоресцирующие с разным временем затухания, связываются с четырьмя различными центрами в альбуминовой глобуле. Эти центры имеют различные свойства, и наносекундная спектроскопия позволяет наблюдать за каждым типом центров в отдельности.
-
Информативность альбуминового флуоресцентного теста ' была расширена путем использования наносекундной спектроскопии и воздействия на молекулу альбумина средами разного ионного состава Это подход позволил выявить изменения связывающих центров альбумина при первом эпизоде параноидной шизофрении и при тревожной депрессии до начала лечения Изменения альбумина у хронических больных могут быть зарегистрированы методом стационарной флуорометрии
-
Особенности поведения, стресс и свойства альбуминовых центров взаимосвязаны Возможно, стресс является неспецифическим фактором, обуславливающим изменение альбумина при различных заболеваниях
Практическое значение работы и внедрение.
Раскрытие молекулярных механизмов взаимодействия альбумина с флуоресцентным зондом К-35 открывает путь к созданию новые, более информативные тесты для оценки состояния больных при различных заболеваниях
С помощью наносекундной флуоресцентной спектроскопии были обнаружены изменения связывающих центров альбумина при первом эпизоде шизофрении до начала лечения и зарегистрирован эффект терапии депрессии на ранних стадиях лечения Эти результаты могут явиться основой для создания принципиально новых методов прогноза и оценки эффективности терапии при этих заболеваниях.
Выявленная в работе взаимосвязь между особенностями поведения, стрессом и свойствами связывающих центров альбумина может открыть новые
возможности для объективной биофизической оценки изменений, происходящих при стрессе.
Результаты работы используются в учебном процессе на медико-биологическом факультете РГМУ, в практике работы лаборатории патологии мозга МНИИ психиатрии Росздрава и лаборатории биофизических методов диагностики ФГУ НИИ ХМ Росздрава.
Апробация работы. Результаты работы были доложены, на III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), на I съезде физиологов СНГ (Дагомыс, 2005), на международном конгрессе по биологической психиатрии (Вена, 2005), на конференциях РАН «Фундаментальные науки - медицине (Москва, 2006, 2007), на Третьем междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2007), на международной конференции по применению синхротронного излучения (Новосибирск, 2006), на конференции «Взаимодействие науки и практики в современной психиатрии» (Москва, 2007, 2008), на конференции «Медицинская физика и инновации в медицине» (Троицк, 2008), на II Международной конференции «Современные информационные и телемедицинские технологии для здравоохранения» (Минск, 2008)
Результаты работы были обсуждены на заседаниях Ученого Совета ФГУ НИИ ФХМ Росздрава, конференциях молодых ученых ФГУ НИИ ФХМ Росздрава, итоговых конференциях НИИ ФХМ МЗ РФ, на заседаниях и семинарах отдела биофизики ФГУ НИИ ФХМ Росздрава.
Публикации. По результатам исследования опубликовано 20 работ, в том числе, 7 статей (из них три - в ведущих научных периодических изданиях) и 13 тезисов
Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы с описанием результатов работы, обсуждения, выводов, списка работ по теме диссертации, списка цитированной литературы, благодарностей Работа изложена на 137 страницах печатного текста, содержит 7 таблиц, проиллюстрирована 34 рисунками. Библиография включает 219 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.
Похожие диссертации на Изменение связывающих центров альбумина при психических расстройствах и при стрессе : детектирование флуоресцентным методом с использованием наносекундной спектроскопии
