Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Некоторые сведения о сывороточном альбумине человека. строение, функции, связывающие центры 9
1.1. Какие белки называют альбуминами.. 10
1.2. Метаболизм и распределение альбумина 10
1.3. Распределение и циркуляция 11
1.4. Функции альбумина в организме 12
1.4.1. Поддержание онкотического давления плазмы 12
1.4.2. Связывание и транспорт низкомолекулярных веществ и экзогенных лигандов 14
1.4.3. Альбумин — участник окислительно-восстановительных реакций в организме 15
1.4.4. Пластическая функция альбумина 16
1.4.5. Регуляция гемостаза 16
1.4.6. Участие в поддержании кислотно-основного равновесия в крови 17
1.4.7. Регуляция апоптоза 17
1.5. Структура молекулы 17
1.5.1. Первичная последовательность 17
1.5.2. Вторичная структура. Домены 17
1.5.2.1. Распределение аминокислотных остатков и зарядов 19
1.5.3. Третичная структура 20
1.5.4. Связывающие центры альбумина 25
1.5.5. Классификация центров 25
1.5.5.1. Главные («лекарственные») центры 25
1.5.5.2. Центр связывания двухвалентных катионов 26
1.5.5.3. Тиоловая группа остатка Cys-34 28
1.5.5.4. Центры связывания неэстерифицированных жирных кислот 28
1.5.5.5. «Минорные» центры 28
1.5.5.6. Другие классификации центров 28
1.6. Влияние физико-химических факторов на свойства центров альбумина 31
1.6.1.1. рН 31
1.6.1.2. Повышение температуры 33
1.6.1.3. Концентрация неорганических солей 33
1.6.1.4. Связывание лигандов 34
1.7. Заключение по главе 1 36
ГЛАВА 2, Флуоресцентный метод исследования альбумина в биологических жидкостях 38
2.1. Изучение белков с помощью красителей (история вопроса). Флуоресцентный зонд К-35 39
2.2. Понятия «эффективная концентрация альбумина» (ЭКА) и «общая концентрация альбумина» (ОКА) 44
2.3. Флуоресцентный метод определения массовой концентрации альбумина 47
2.3.1. Методика определения 47
2.3.2. Правильность и воспроизводимость метода 48
2.3.3. Сравнение флуоресцентного метода и унифицированного метода с БКП 50
2.4. Наборы реактивов для флуоресцентного теста 52
2.4.1. Состав реактивов 52
2.4.2. Стабильность реактивов 52
2.5. Технология выполнения анализа 53
2.5.1. Калибровка анализатора 54
2.5.2. Измерение исследуемой пробы 56
2.5.2.1. Подготовка проб 56
2.5.2.2. Определение показателя «эффективная концентрация альбумина (ЭКА)» 57
2.5.2.3. Определение показателя «общая концентрация альбумина (ОКА)» 57
2.6. Флуоресцентный метод исследования свойств альбумина жидкостей глаза 57
2.7. Заключение по главе 2 59
ГЛАВА 3. Молекулярные механизмы чувствительности флуоресцентного метода исследования альбумина 60
3.1. Исследование связывания флуоресцентного зонда с макромолекулой с помощью безызлучательного переноса энергии возбуждения с флуоресцентной метки на зонд 61
3.1.1. Использование явления безызлучательного переноса энергии возбуждения между флуорофорами для исследования связывания зонда с белком 62
3.1.2. Изоиндольная флуоресцентная метка как донор энергии возбуждения 64
3.1.2.1. Реакция образования изоиндольной метки 65
3.1.2.2. Сохранность связывающих центров ЧСА после реакции с ОФА 66
3.1.2.3. Стабильность флуоресцентной метки 67
3.1.2.4. Доказательство тушения ортофталевого альдегида по механизму безызлучателыюго переноса энергии... 69
3.1.3. Определение параметров связывания К-35 с препаратами альбумина 71
3.1.3.1. Метод с использованием БПЭ 71
3.1.3.2. Метод равновесного диализа 75
3.2. Размер молекулы альбумина в растворе. Данные рассеяния нейтронов 77
3.3. Влияние маркеров связывающих центров альбумина на связывание и квантовый выход флуоресценции зонда К-35 80
3.3.1. «Лекарственный» центр 1 81
3.3.2. «Лекарственный» центр II 84
3.3.3. Центр связывания билирубина 87
3.3.4. Центр связывания двухвалентных катионов 89
3.3.5. Тиоловый центр Cys-34 90
3.3.6. Влияние лигандов на связывание К-35 с альбумином. Данные ультрафильтрации 90
3.3.7. Конкуренция или аллостерическое взаимодействие между центрами? 91
3.4. Обсуяедение результатов раздела 3.3 92
3.5. Длинноцелочечные жирные кислоты как регулятор доступности тиола остатка Cys-34. Конформационное сопряжение транспортной и аитиокислительной функций альбумина 98
3.6. Состояние каких центров альбумина отражает флуоресценция К-35? 101
3.7. Анализ гетерогенности альбуминовых центров с применением наносекуидной флуоресцентной спектроскопии 103
3.7.1. Метод изучения гетерогенного затухания флуоресценции в биологических образцах («метод амплитудного стандарта») 104
3.7.2. Выбор специальной среды (амплитудного стандарта) 106
3.7.3. Флуоресценция К-35 в растворителях. Возможные механизмы тушения 107
3.7.4. Затухание флуоресценции К-35 в альбумине. Спектр конформационных состояний центров альбумина по данным анализа затухания флуоресценции 108
3.7.5. Влияние физико-химических факторов на гетерогенность затухания К-35 из альбумина 111
3.7.5.1. Гетерогенность состояний альбуминовых центров в изолированном альбумине и в сыворотке крови человека 111
3.7.5.2. Влияние кислотности среды 112
3.7.5.3. Влияние неэстерифицированных жирных кислот 112
3.7.5.4. Затухание К-35 при изменении ионной силы раствора и в присутствии динамического тушителя флуоресценции 115
3.7.5.5. Тушение нитратом флуоресценции АНС в ЧСА 117
3.7.5.6. Влияние повышения температуры 117
3.8. Заключение по Главе 3 118
ГЛАВА 4. Информативность альбуминового флуоресцентного теста. клинические наблюдения 120
4.1. Обзор применения флуоресцентного теста 121
4.2. Изменение связывающих центров альбумина при психических заболеваниях 124
4.3. Применение флуоресцентного альбуминового теста в офтальмологии 125
4.4. Критические состояния. Новый подход к раннему прогнозу распространенного перитонита: данные многоцентрового исследования 127
ГЛАВА 5. Конформационные изменения связывающих центров альбумина как универсальная реакция на патологический процесс 130
Заключение . 138
Выводы 140
Приложение 142
- Распределение и циркуляция
- Структура молекулы
- Понятия «эффективная концентрация альбумина» (ЭКА) и «общая концентрация альбумина» (ОКА)
- Влияние маркеров связывающих центров альбумина на связывание и квантовый выход флуоресценции зонда К-35
Введение к работе
Физиологические и патологические процессы проявляются в виде физико-химических изменений на разных уровнях организации живой системы, в том числе на молекулярном. Изучение этих изменений, раскрытие их медико-биологического значения, является фундаментальной задачей медико-биологической науки. Получаемые результаты являются основой для создания новых методов диагностики, лечения и профилактики различных заболеваний/
Физико-химические изменения при различных состояниях организма затрагивают и белки. Нарушение структуры белка может быть обусловлено генетически, и в этом случае изменяется его первичная или вторичная структура. Оно может быть посттрансляционым, когда синтезируется нормальный белок, структура которого и, соответственно, функционирование, изменяются в процессе жизни этого белка в организме. В ряде случаев химическое изменение белков является специфическим диагностическим признаком патологического процесса, например, их гликозилирование при диабете.
Большую и важную группу белков в организме составляют транспортные белки. Они не проявляют заметной ферментативной активности. Главная функция этих белков — обратимое связывание низкомолекулярных веществ (лигандов) и доставка их в виде образовавшегося комплекса к клеткам-мишеням. К таким белкам относится и сывороточный альбумин человека (ЧСА), составляющий около 50 % (по массе) белков плазмы и присутствующий также в тканях. Альбумин способен обратимо связывать большое количество низкомолекулярных (примерно до 600 Да) метаболитов (билирубин, жирные кислоты, холестерин и др.) и ксенобиотиков гидрофобной и амфифильной природы. Для выполнения этой функции на молекуле альбумина есть специальные участки - связывающие центры [1,2].
Различные вещества — метаболиты и ксенобиотики — могут конкурировать за общие места связывания на альбумине, и учет этой конкуренции необходим при назначении лекарственной терапии [3-6].
Однако конкуренция может быть не единственным процессом, оказывающим влияние на состояние альбуминовых центров. В середине 1990-х годов сформировалось представление о том, что связывающие центры в молекуле альбумина сформированы до взаимодействия с лигандом, могут приспосабливаться и изменяться в процессе
взаимодействия с ним [7,8]. То есть в процессе выполнения транспортной функции коиформация и свойства альбуминовых центров изменяются.
Возникает вопрос: каково медико-биологическое значение этой реакции, и может ли количественное ее тестирование оказаться полезным в практическом плане - для целей медицинской диагностики? Не могут ли различные по своей природе физико-химические воздействия, в частности, связывание лигандов даже в разных центрах приводить к сходным изменениям в молекуле альбумина или, по крайней мере, в каком-то ее участке? К моменту начала данной работы ответа на эти вопросы не было. Их решение могло открыть новые подходы к пониманию патогенеза заболеваний, пути к созданию принципиально новых методов диагностики и оценки эффективности лечения больных.
Для решения поставленной проблемы было необходимо создать метод для исследования свойств альбуминовых центров в биологических жидкостях. Состояние альбуминовой глобулы весьма чувствительно к различным физико-химическим воздействиям, в том числе, к процедуре фракционирования сыворотки. Поэтому важно было создать метод, который позволил бы изучать альбумин без его выделения из биологической жидкости. Этот метод должен быть чувствителен к воздействиям на альбумин, в том числе к присоединению к нему лигандов.
К началу работы были созданы предпосылки для создания такого метода на основе флуоресцентных зондов. В результате сотрудничества между НИИ физико-химической медицины (чл.-корр. РАМН, профессор Г.Е. Добрецов) и НПО «Монокристалл» (проф. Б.М.Красовицкий) был синтезирован флуоресцентный зонд, получивший название К-35 (N-карбоксифенилимид диметиламинонафталевой кислоты). Особенностью этого вещества является то, что при добавлении в плазму крови более 95 % наблюдаемого сигнала флуоресценции происходит от молекул зонда, связанных с альбумином. Эти результаты открыли возможность изучения альбуминовых центров непосредственно в сыворотке, без выделения из нее альбумина. Однако к началу работы отсутствовал метод и стабильные реактивы, с помощью которых можно было бы изучать состояние альбуминовых центров независимо, от концентрации этого белка в биологической жидкости.
Первые исследования зонда К-35, выполненные Р.К.Айдыралиевым и .Ю.И.Миллером, показали высокую чувствительность его флуоресценции к состоянию альбуминовой глобулы. Однако молекулярные механизмы этой чувствительности раскрыты не были.
Предварительные результаты, полученные в НИИ ФХМ МЗ РФ, показали, что при ряде заболеваний флуоресценция зонда из сыворотки меняется. Однако широкого исследования не было проведено, в том числе из-за отсутствия удобной технологии метода. Информативность наблюдаемых изменений флуоресценции у больных также была не изучена. /
. В соответствии с поставленными вопросами были сформулированы цель и задачи данной работы.
Цель работы - изучение молекулярных механизмов и медико-биологической значимости изменений связывающих центров альбумина.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Создать метод для исследования свойств центров альбумина в нефракционированных биологических жидкостях.
2. Раскрыть механизмы чувствительности флуоресценции молекулярного зонда К-3 5 (N-карбоксифеншшмида диметиламинонафталевой кислоты) к состоянию альбуминовой глобулы.
3. Исследовать информативность изменений свойств альбумина, выявляемых флуоресцентным методом, при различных заболеваниях человека.
Распределение и циркуляция
Сывороточный альбумин получил свое название вследствие того, что именно в сыворотке (плазме) он присутствует в наиболее высокой концентрации (35-50 г/л) и составляет по массе около 60 % всех белков. В других жидкостях организма концентрация ЧСА ниже: в лимфатической системе - 15-36 г/л, в межклеточной жидкости - 3-10 г/л, в ликворе - 0,3 г/л. В сосудах тела находится 120-140 г альбумина (30 %), вне кровяного русла — около 300 г (70 %), т.е. в организме взрослого человека в норме содержится 400—450 г альбумина. Пулы альбумина плазмы и тканей обмениваются между собой. В норме каждый час около 5 % альбумина плазмы покидает сосудистое русло через стенку капилляров в органах и тканях. Двигаясь в составе интерстициальной жидкости между волокнами соединительной ткани, по каналам лимфатической системы альбумин снова может попасть в кровоток. Считают, что в норме за 24 часа весь альбумин плазмы замещается на альбумин, пришедший по лимфатической системе из тканей [17]. По-видимому, это -средняя оценка. Некоторые авторы приводят экспериментальные данные, свидетельствующие о более медленном, в течение 2—5 суток, обмене [18].
Скорость обмена альбумина между кровью и тканями не одинакова в различных компартментах тела. Возврат альбумина из кожи и мышц происходит медленнее, чем из печени или кишечника [19]. Циркуляция и распределение ЧСА в организме может изменяться при заболеваниях: например, при сердечной недостаточности, нефротическом синдроме, гепатитах, циррозах [20-22]. Нарушение распределения альбумина между сосудистым и внесосудистым компартментами оказывает более сильное влияние на фармакокинетику лекарственных препаратов, чем просто изменение концентрации альбумина в плазме [23] Альбумин выполняет в организме ряд функций, поддержание или изменение которых играет роль важную как в физиологических условиях, так и при развитии патологических процессов. 1.4.1.
Поддержание онкотического давления плазмы Это наиболее известная и, несомненно, крайне важная функция альбумина. В норме молекулы альбумина обеспечивают 80-85 % онкотического давления плазмы. Эту функцию альбумин выполняет благодаря большому количеству заряженных групп, которые могут удерживать воду (см. Рис. 2). По данным калориметрии, ЯМР с замораживанием, гидродинамических методов гидратация альбумина (количество прочно удерживаемой «незамерзающей» воды) составляет в среднем 0,42 г НгО на 1 г альбумина. Это соответствует приблизительно 1500 молекулам воды на молекулу альбумина. Максимальная гидратация молекулы альбумина оценивается как 1 г НгО на 1 г белка, т.е. около 3700 моль Н2О на 1 моль альбумина [24-27]. Отметим, что эти оценки не учитывают т.н. «слабо связанную» воду, также остающуюся в сосудистом русле, и воду в полостях белка. Способность альбумина удерживать воду в капиллярах и поддерживать тем самым ударный объем очень важна. Если концентрация альбумина в плазме по тем или иным причинам уменьшается примерно в 2 раза и достигает 22 г/л, то наблюдается синдром гиповолемии. Это состояние является критическим и является показанием для инфузии плазмозаменяющих растворов с целью поддержания онкотического давления [28]. Связывание жирных кислот с альбумином не изменяет его гидратации. Способность альбумина связывать воду изменяется при ряде заболеваний: при острой почечной недостаточности, циррозе печени, гемолитической болезни [29]. Хотя альбумин относится к белкам, острая потеря которых очень опасна для организма и может привести к летальному исходу, врожденное отсутствие альбумина (апальбумииемия) практически никак не сказывается на состоянии человека. Начиная с 1954 года, в мире описаны 34 случая анальбуминемии, и все эти наблюдения были
Структура молекулы
Число ионизированных групп в молекуле альбумина при рН 7 близко к 185 [1]. Поскольку средняя концентрация альбумина в крови человека около 0,7 мМ, то концентрация его ионизированных групп составляет примерно 130 мМ, то есть составляет около половины величины концентрации неорганических ионов. Кроме этого, альбумин — отрицательно заряженный (при физиологических значениях рН) белок, и он вносит вклад - около 10 мМ - в общий отрицательный заряд крови [71]. Имеются данные, что альбумин способен участвовать в регуляции апоптоза клеток, как правило, ингибируя его [72-74]. По-видимому, способность к регуляции апоптоза зависит от состояния тиолов альбумина и от наличия некоторых связанных с ним лигандов, в частности, жирных кислот [75]. Свойства любого белка определяются его аминокислотной последовательностью, вторичной и третичной структурой. Рассмотрим подробнее строение молекулы альбумина человека. В 1959 г MJ.Hunter и F.C.McDuffie установили, что молекула альбумина состоит из одной аминокислотной .цепочки, скрепленной дисульфидными связями, и не содержит углеводных остатков. Первичную последовательность аминокислот определили независимо J.R.Brown и B.Meloun в 1975 г. Молекула альбумина состоит из последовательности 585 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу около 66400 Да [1,76]. .
Главный вклад в стабилизацию вторичной структуры вносят водородные связи, образующиеся между пептидными группами аминокислотной цепи. Около 50-67 % аминокислотных остатков уложены в а-спирали. Самая короткая а-спираль образована пятью аминокислотными остатками и имеет длину около 0,75 им. Самая длинная а-спираль состоит из 31 аминокислотного остатка, ее длина - 4,65 нм [8,13]. Некоторые аминокислотные остатки, например, глицин и пролин не могут образовывать водородных связей. Ход а-спирали около таких остатков нарушается [77]. В неспирализованных участках белковая цепь изгибается. Между остатками цистеина образуются 17 дисульфидных связей, которые формируют 9 петель (см. Рис. 2). Рисунок петель на молекуле повторяется почти точно три раза. Повторяющиеся участки состоят из двух больших и одной маленькой петли и содержат около 190 аминокислотных остатков [1]. В результате гидрофобных взаимодействий длинных боковых цепей каждые три петли образуют глобулярную структуру, которая, называется доменом. , " Молекула альбумина человека состоит из трех доменов. Каждый из них содержит 10 а-спиралей, обозначаемых Ы - Ы0 (см. Рис. 3). Домены разделяют на структурно несколько отличающиеся субдомены - А и В. Субдомен А отличается от субдомена В тем, что содержит две короткие антипараллельные спирали h5 и h6, которые формируют маленькую петлю. Спирали hl-h4 входят в состав 1-й, 4-й, 7-й петель, спирали h5-h6 формируют 2-ю, 5-ю и 8-ю петли, a h7 - Ы0 - 3-ю, 6-ю и 9-ю петли. Исключением является субдомен IA, в котором отсутствует дисульфидная связь между спиралями hl-h3.
Вместо дисульфидной связи в I домене имеется свободная SH-группа цистеинового остатка Cys3 [13]. Каждый из трех доменов молекулы альбумина подразделяется на 2 субдомена - А (ос-спирали hl-h6) и В (а-спирали h7-hl0). Субдомены соединены большим неспирализованными участком (длина 13, 23 и 19 остатков для доменов I, II и III, соответственно). Дисульфидные связи S—S соединяют спирализованные участки. Дисульфидная связь между Ы и h3, обозначенная пунктиром, отсутствует в первом домене. Домены связаны спирализованными участками цепи (а-спирали hlO-hl). Всего альбуминовая глобула содержит 28 а-спиралей Субдомены ІА-ІВ, ПА-ПВ и ША-ШВ связаны неспирализованными участками Lys(106)-Glu(119), Glu(292)-Val(315), Glu(492)-Ala(511). Соседние домены I-II и П-Ш связаны между собой двумя большими а-спиралями, которые являются соединенными между собой вытянутыми N- и С- концевыми участками каждого из двух доменов -спирали h 10(1)—h 1 (II) и h 10(II)—h 1 (III) соответственно. Таким образом, общее число спиральных структур в молекуле альбумина равно 28 [13]. 1.5.2,1. Распределение аминокислотных остатков и зарядов Аминокислотные остатки в петлях распределены неравномерно. Asp и Glu более часто встречаются на концах петель, Gly преимущественно находится в N-конце цепи, а Тге - в С-конце. Туг в высокой концентрации содержится в 3-й и 6-й петлях, a Pro — на концах длинных петель [1]. В каждом из трех доменов соотношение гидрофобных, гидрофильных и амфифильных остатков приблизительно одинаково и равно, соответственно, 87:76:35. Очевидно, что гидрофобные и амфифильные остатки преобладают в альбумине. Часть из
Понятия «эффективная концентрация альбумина» (ЭКА) и «общая концентрация альбумина» (ОКА)
Фундаментальный лексикон» описываемого в работе флуоресцентного метода исследования альбумина составляют понятия «эффективная концентрация альбумина» (ЭКА) и «общая концентрация альбумина» (ОКА). Схема, иллюстрирующая их, представлена на Рис. 9., ОКА (г/л) - это массовая концентрация альбумина в сыворотке (плазме), соответствующая концентрации альбумина, определяемой унифицированными методами, например, методами с бромкрезоловыми красителями [161]. Величина ОКА не зависит (или зависит слабо) от состояния альбуминовых центров - присутствия лигандов в «лекарственных» центрах», наличия жирных кислот, билирубина и т.д. Для измерения ОКА альбумин помещают в специальные условия (раздел 2.3), при которых интенсивность флуоресценции К-35 из сыворотки пропорциональна содержанию в ней альбумина (Рис. 9). С помощью процедуры калибровки эта интенсивность флуоресценции может быть пересчитана в единицы концентрации альбумина (г/л).При измерении флуоресценции зонда из сыворотки при физиологических условиях (значениях рН) наблюдаемая интенсивность сигнала зависит от состояния альбуминовых центров, и отмеченная пропорциональность нарушается. Этой интенсивности флуоресценции также можно сопоставить массовую концентрацию альбумина, которая получила название «эффективная концентрация альбумина» (ЭКА) - см. Рис. 9.
До начала нашего исследования, начиная с 1950-х гг., наиболее вероятной причиной несоответствия между ЭКА и ОКА представлялась конкуренция между зондом и метаболитами (токсинами) за общие связывающие центры на альбумине [4,171,172]. Предполагалось, что у здоровых лиц связывающие центры не заняты, и поэтому ЭКА и ОКА у них должны быть равны. И действительно, анализ сывороток больных и здоровых показывал, что распределение интенсивности флуоресценции довольно резко ограничено со стороны высоких значений (см. Рис. 10).Значения интенсивности флуоресценции, соответствующие образцам сыворотки здоровых лиц, находятся у верхнего края распределения (пунктирная прямая на Рис. 10), а в сыворотках больных флуоресценция (и, соответственно, ЭКА) ниже, иногда в 2 и более раз. Дальнейшие наблюдения показали, что в подавляющем большинстве случаев такой способ «уравнивания» ЭКА и ОКА корректен, и у больных ЭКА ОКА [154, 155]. В некоторых патологических и физиологических условиях возможна ситуация, когда ЭКА ОКА, но это превышение составляет не более 20-25 %.Таким образом, ОКА — это эквивалент концентрации альбумина, измеряемой унифицированными биохимическими методами. ЭКА — показатель, отражающий как количество, так и функциональное состояние альбуминовых центров, и не выражающийся прямо через традиционные клинические лабораторные параметры. Можно записать, чтогде коэффициент В не зависит от концентрации альбумина. Этот коэффициент (индекс)может служить показателем, характеризующим альбуминовые центры. В первых работах, посвященных альбуминовому флуоресцентному тесту, этот индекс назывался «резерв связывания альбумина» (РСА) и выражался в процентах [154]. Чем более индекс ЭКА/ОКА отличен от 1, тем сильнее изменены связывающие центры альбумина по сравнению с нормой.
Был предложен еще один индекс, также выражающийся через величины ЭКА и ОКА, но относящийся При определенных условиях к организму в целом. Было показано, что если причиной уменьшения флуоресценции зонда является заполнение центров альбумина лигандами, и параметры связывания этих лигандов с альбумином одинаковы в крови и в ткани, то заполнение тканей этими лигандами (токсическими веществами) можно характеризовать т.н. «индексом токсичности» (ИТ) [177].Чем выше ИТ, тем в большей степени ткани заполнены токсическим веществом [177].Таким образом, определение показателей ЭКА и ОКА дает возможность характеризовать количество (концентрацию) альбумина, состояние (свойства) связывающих центров его молекул, рассчитывать индексы, характеризующие как молекулы ЧСА, так и ткани.Массовая концентрация альбумина (МКА) - важный клинико-лабораторный показатель. Во многих лабораториях мира его определение является обязательным. С позиций флуоресцентного альбуминового теста, измерение концентрации альбумина необходимо для характеристики свойств его молекулы (см. формулы (1)-(3)). Величину МКА определяют фотометрическими, электрофоретическими, иммунологическими методами. Унифицированными являются методы с красителями бромкрезоловым зеленым (БКЗ) и бромкрезоловым пурпурным (БКП) [161].
Еще до появления методов, основанных на поглощении света БКЗ и БКП, предпринимались попытки разработать флуоресцентный метод определения концентрации альбумина: привлекательной представлялась более чем в" 100 раз высокая чувствительность флуоресцентных методов. Первую такую попытку с использованием зонда АНС сделал Лоуренс в 1952 году. Однако серьезным мешающим фактором оказался билирубин, и метод не получил распространения. Позднее Р.К.Айдыралиев нашел условия, при которых чувствительность АНС к вариации состава сывороток снижалась [178]. Затем был найден другой зонд, получивший условное название К-33, флуоресценция которого из сыворотки была еще менее чувствительна к влиянию мешающих факторов [171]. Это достигалось не только особенностями молекулы К-33, но снижением рН измеряемой пробы до 4,0, когда альбумин переходит в F-конформацию.В ходе данной работы удалось предложить метод определения массовой концентрации альбумина, основанный на использовании флуорофора К-35. Проведение измерений при рН 4,2 в присутствии неионного детергента бридж-35 позволило практически устранить действие факторов, мешающих количественному определению альбумина в сыворотке. Концентрацию альбумина, определяемую именно этим методом, стали называть ОКА (см раздел 2.2). Разработка метода определения ОКА была выполнена совместно с А.Б.Пестовой [179]. Первые исследования его правильности и воспроизводимости проведены совместно с в.н.с, к.м.н. Т.ИЛукичевой (Научно-методическим центром по клинической лабораторной диагностике ММА им. И.М.Сеченова, зав. -д.м.н, проф. В.В.Мёныников) [176].2.3Л. Методика определенияСогласно предложенной методике, для определения концентрации альбумина флуоресцентным способом сыворотку разбавляли в 200 раз буферным раствором следующего состава; 140 мМ NaCl, 10 мМ трис-оксиметиламинометан, 2 мМ ЭДТА-Na,
Влияние маркеров связывающих центров альбумина на связывание и квантовый выход флуоресценции зонда К-35
Таким образом, в ходе работы нам удалось создать методику, позволяющую разделить вклады изменений связывания зонда в общий сигнал его флуоресценции из ЧСА. На следующем этапе необходимо было выяснить, какой механизм лежит в основе изменений флуоресценции К35 при связывании с альбумином других лигандов: конкуренция за общие места связывания или локальные конформациониые изменения участков, связывающих зонд, влияющие на квантовый выход его флуоресценции. Для решения этой задачи мы исследовали, как влияет на флуоресценцию и связывание К-35 с альбумином занятость органическими лигандами - маркерами высокоаффинных центров ЧСА: "лекарственных" центров связывания I и II, центра для жирных кислот, билирубина. Для этого использовали метод переноса энергии с ОФА-А на К-35. Как показано выше, этот метод позволяет следить за изменением связывания зонда по измерению тушения изоиндолыюй флуоресцентной метки. В этом же образце, поменяв условия возбуждения и регистрации флуоресценции, можно следить за изменением интенсивности флуоресценции К—35. В качестве лигандов - маркеров центров связывания использовали фенилбутазон (центр I), ибупрофен (центр II), билирубин, пальмитиновую кислоту (Рис. 25).
Опыты по связыванию К-35 в присутствии пальмитиновой кислоты описаны выше (раздел 0). В последующих разделах приведены данные, полученные в экспериментах с другими маркерами. 33.1. «Лекарственный» центрі Маркером I типа центров является фенилбутазон (ФБ). Изучали, как влияет заполнение высокоаффинного центра ЧСА для этого лиганда на связывание и квантовый выход флуоресценции К-35. Фенилбутазон (ФБ) добавляли в таком соотношении лиганд/альбумин, чтобы был занят один центр связывания ФБ на молекулу альбумина (константа связывания ФБКі=2 105М 1,пі=1,К2=4-5 104,П2= 1 [78]). Обезжиренный альбумин На Рис. 26 показано влияние заполнения связывающего центра I на эффективность тушения флуоресценции изоиндольной метки на ЧСА зондом К-3 5. Значения концентрации связанного зонда г рассчитывали, используя параметры связывания К-35 с альбумином без ФБ (определенные методом БПЭ и равновесным диализом - см. раздел 0). Видно, что тушение метки в присутствии ФБ идет слабее, чем в нелигандированном альбумине: наклон прямой тушения в случае ФБ меньше. Если бы ФБ не оказывал влияния на связывание К-35, то наклоны (и эффективность самого тушения) должны были бы совпадать. Следовательно, в присутствии ФБ уменьшается связывание К-35 с альбумином. Из Рис. 26 видно, что для того, чтобы достичь одной и той же величины параметра ln(F/Fo) (то есть одинаковой степени заполнения связывающих центров альбумина зондом К-35), к каждой молекуле альбумина, лигандированного ФБ, должно быть добавлено в среднем на 62,8±14,4% больше молекул К-35, чем в случае альбумина без ФБ. Поскольку константа связывания ФБ с ЧСА более, чем в 10 раз выше, чем у К-35, то можно предположить, что либо в присутствии ФБ связывание зонда идет по вторичным (низкоаффиняым) центрам, либо ФБ оказывает аллостерическое действие на первичный центр связывающий зонд.
В том же образце, в котором исследовали влияние ФБ на эффективность тушения зондом К-35 флуоресценции комплекса ОФА-А, измеряли флуоресценцию К-35 при возбуждении 425 нм (в этой области флуоресценция метка не возбуждается). На Рис. 27 представлен график зависимости интенсивности флуоресценции К-35 из альбумина до и после связывания с ЧСА одной молекулы ФБ на молекулу альбумина от концентрации добавленного К-35; в случае ФБ интенсивность флуоресценции в два раза ниже. Поскольку связывание К-35 в этом образце снизилось в 1,6 раза (см. выше), то можно ожидать, что квантовый выход флуоресценции зонда уменьшился в 1,2 раза.. Влияние ФБ на интенсивность флуоресценции К-35 в (А+ПК) было таким же, как и в обезжиренном альбумине: после добавления ФБ интенсивность флуоресценции уменьшилась в два раза/Обращает на себя внимание, что в случае (А+ПК) связывание ФБ с ЧСА в два раза уменьшило интенсивность флуоресценции и не более, чем на 25% уменьшило связывание К-35, что свидетельствует об аллостерическом взаимодействии между центрами для лекарства и зонда. 3.3.2. «Лекарственный» центр II В качестве маркера «лекарственного» связывающего центра II типа был использован ибупрофен (ИБ). Как и ФБ, ИБ добавляли в таких соотношениях лиганд:альбумин, чтобы был занят один центр связывания ИБ на молекулу альбумина (константа связывания ИБ К!=3 106 М-1, щ=1, К2=2 104, п2 = 1 [78]). Обезжиренный альбумин На Рис. 29 показано влияние ИБ на эффективность тушения изоиндолыюй метки зондом К-35. Видно, что в присутствии ИБ наклон прямой тушения ОФА-А не отличается от наклона прямой тушения в нелигандированном альбумине. Следовательно, в присутствии ИБ связывание К-35 с ЧСА не изменяется.
