Содержание к диссертации
Введение
II. Обзор литературы
Введение 10
Спектральные свойства собственных и присоединенных флуорофоров белка 10
Н.2.1. Собственные флуорофоры белка 11
Н.2.2. Присоединенные красители: продан и акрилодан 11
П.2.3. Электронная структура полосы поглощения индольного флуорофора 12
Н.2.4. Электронная структура полосы поглощения продана 13
П.З. Флуоресценция и факторы, влияющие на ее характеристики 15
П.3.1. Спектры флуоресценции 17
П.3.2. Природа флуоресцентного состояния триптофана 17
Н.З.З. Природа флуоресцентного состояния продана и его производных 18
Н.3.4. Влияние межмолекулярных взаимодействий на электронно-колебательные переходы 20
Н.3.5. Влияние универсальных взаимодействий на сдвиг и форму спектров флуоресценции 20
Н.3.6. Влияние специфических взаимодействий на спектры триптофановой флуоресценции 22
11.4. Триптофановая флуоресценция белка 24
Н.4.1. Физические характеристики окружения флуорофоров в белках 24
Н.4.2. Квантовый выход и тушение флуоресценции внутренними
группами белка 26
Н.4.3. Метод избирательного тушения флуоресценции 27
Н.4.4. Модель дискретных состояний остатков триптофана в белках 29
11.5. Форма электронно-колебательного спектра многоатомных органических флуорофоров 31 11
5.1. Теоретическое описание формы электронно-колебательных спектров 31
11.5.2. Описание формы спектров флуоресценции математической функцией 34
11.6, Компонентный анализ спектров флуоресценции белков 35
II.6.1. Разложение спектров флуоресценции по степени доступности внешнему тушителю 35
И.6.2. Разложение спектров флуоресценции по параметрам затухания флуоресценции 36
11.6.3. Определение спектров индивидуальных флуорофоров с использованием направленных мутаций 36
П.6.4. Расчетное разложение составных спектров методом наименьших квадратов 37
11.7, Исследование структурных изменений и переходов в белках методом флуоресценции 38
П.7.1, Параметры флуоресценции как мера завершенности перехода 39
П.7.2, Обнаружение промежуточных состояний 39
11,7.3, Использование флуоресцентных методов в изучении структурных переходов белков 40
П.8, Заключение и постановка задачи 41
III. Материалы и методы
III. 1. Препараты 44
Ш.2. Спектральные измерения 45
Ш.З. Обработка и анализ спектров флуоресценции 46
IV. Результаты
IV. 1. Аналитическое описание формы спектров флуоресценции 49
IV.2. Взаимозависимость параметров формы спектров флуоресценции флуорофоров. Определение формы однородного спектра 50
IV.2.1. Влияние растворителя на форму и положение спектров флуоресценции СЗ-замещенных индола 50
IV.2.2. Однородные спектры триптофановой флуоресценции в белках 53
IV.2.3. Влияние растворителя на форму и положение спектров флуоресценции продана и акрилодана 54
IV.2.4. Влияние растворителя на форму и положение спектров флуоресценции З-амино-Ы-метилфталимида, 1- и 2 ацетилантрацена 57
IV.3. Тестирование разложения спектров флуоресценции на элементаные лог-нормальные компоненты 61
IV.4. Исследование структурных переходов в мелиттине в процессе его олигомеризации 65
IV.4.1. Переходы в мелиттине под действием ионной силы 67
IV.4.2. Влияние концентрации мелиттина на процесс олигомеризации. Стехиометрия олигомеризации 69
IV.4.3. Индуцируемые рН переходы в тетрамере мелиттина 73
IV.4.4. Тепловые переходы в тетрамере мелиттина 75
IV.5. Денатурация р-лактоглобулина мочевиной 78
IV.6. Анализ лог-нормальных компонент спектров флуоресценции связанных с белками продана и акрилодана 80
IV.6.1. Взаимодействие продана с бычьим сывороточным альбумином 81
IV.6.2. Флуоресценция акрилодана в конъюгате с субфрагментом S1 миозина 83
IV.6.3. Флуоресценция акрилодана в конъюгатах с актином 88
V. Обсуждение результатов 90
VI. Выводы 95
VII. Список литературы 96
- Электронная структура полосы поглощения продана
- Спектральные измерения
- Влияние растворителя на форму и положение спектров флуоресценции СЗ-замещенных индола
- Влияние концентрации мелиттина на процесс олигомеризации. Стехиометрия олигомеризации
Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение структурных и физико-химических переходов в белках имеет важнейшее значение в исследовании их биологических и физических свойств.
Среди различных физических и химических методов исследования заметную роль играют методы, основанные на регистрации и интерпретации изменений флуоресценции. Люминесцентная спектроскопия является мощным и универсальным методом изучения структурных, физико-химических и функциональных свойств белков. Флуоресцирующие аминокислотные остатки белка - триптофан, тирозин и фенилаланин (Конев, 1965; Бурштейн, 1976, 1977а; Лакович, 1986; Permyakov, 1993), или присоединенные красители (Weber & Farris, 1979; Владимиров и Добрецов, 1980; Semisotnov et а), 1991) несут информацию об изменении физических и химических свойств окружения в процессе перехода.
При анализе переходов чаще всего рассматриваются изменения интегральных значений параметров флуоресценции целого набора фяуорофоров, которые могут быть расположены в разных участках белковой молекулы и находиться в процессе перестройки между разными структурными и (или) физическими состояниями. При этом теряется специфическая информация о различиях в изменении структурных и физических свойств в разных участках белковых молекул и о неодинаковом поведении отдельных популяций молекул в процессе перехода.
В связи с этим возникает необходимость разработки новых приемов анализа изменений спектров флуоресценции, которые должны обеспечить более полную их интерпретацию при исследовании структурных переходов в белках. Одним из таких подходов является разложение спектров флуоресценции на компоненты, соответствующие излучению отдельных фяуорофоров или их групп, что позволяет следить за изменением состояния их окружения в процессе перехода.
Целя и задачи исследования. Главной целью настоящей работы является разработка и обоснование новых подходов в изучении состояний и структурных перестроек в белках, основанных на компонентном анализе составных спектров флуоресценции остатков триптофана или присоединенных флуоресцентных меток.
Для достижения этого было необходимо решить следующие задачи:
- Исследовать взаимозависимости параметров лог-нормальной функции, описывающей контуры спектров флуоресценции фяуорофоров в различных условиях. Определить функцию, описывающую форму элементарного однородного спектра флуресценции флуорофора в белке.
Разработать методы разложения составных спектров белков на индивидуальные лог-нормальные компоненты и проверить применимость предлагаемого подхода для анализа составных спектров флуоресценции белков.
Исследовать на основе выбранных подходов структурные и физико-химические переходы в белках, вызываемые различными физико-химическими факторами.
Охарактеризовать общие приемы и возможности использования компонентного анализа спектров флуоресценции для определения молекулярных особенностей структурных и физико-химических переходов в белках. Проанализировать методические особенности, информативность и пределы применимости разработанных подходов
Научная новизна и значимость работы. Показано, что широкие асимметричные спектры флуоресценции различных органических флуорофоров описываются четырехпараметрической функцией лог-нормального распределения.
Параметры различающихся по положению спектров излучения одного и того же вида флуорофора в окружении с различной полярностью и подвижностью строго взаимозависимы. Вследствие этого форма спектра флуоресценции триптофана и ряда других сложных молекул определяется только положением его максимума и может быть представлена однопараметрическоЁ лог-нормальной функцией, что существенно упрощает процедуру компонентного анализа.
Показано, что сложные спектры белковой флуоресценции можно однозначні) разложить на компоненты, спектральные параметры которых характеризуют окружение индивидуальных флуорофоров в составе белка или классов флуорофоров с одинаковыми спектральными характеристиками.
Разработанные приемы и методы повышают информативность спектрофлуоресцентного исследования природы структурных и физико-химических переходов в белках. Высокая точность описания формы спектра дает возможность проведения в дальнейшем более глубоких экспериментальных и теоретических исследований.
Практическая ценность. Разработанные методы и подходы используются в конкретных научных исследованиях. Эмпирическая однопараметрическая лог-нормальная функция используется в изучении как фотофизических свойств флуорофоров, так в исследовании белков методом флуоресценции.
Идентификация формы спектра флуоресценции элементарного состояния остатков триптофана позволила уточнить широко используемую
интерпретационную модель статистически дискретных состояний остатков триптофана в белках.
Разработаны алгоритмы описания и разложения на компоненты спектров флуоресценции органических флуорофоров, в том числе остатков триптофана в белках и органических флуоресцентных меток и зондов.
Предложенные подходы позволяют выделить в сложном спектре излучения спектральные компоненты отдельных флуорофоров или их классов в белке и исследовать локальные изменения их окружения в процессе структурного или физико-химического перехода, что расширяет арсенал методов изучения характеристик и природы функциональных переходов в белках
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на Всесоюзных конференциях по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1980-1991); Ш Всесоюзном совещании «Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение» (Рига, 1988); Международной конференции «Физика и химия органических люминофоров 95» (Харьков, 1995); Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); Международной конференции по люминесценции и фотофизике в честь 100-летия Яблонского (Торунь, Польша, 1998); П и Ш Съездах биофизиков России (Москва, 1999 и Воронеж, 2004); научных конференциях ИТЭБ РАН; 7-ой Конференции по методам и приложению флуоресценции (Амстердам, Нидерланды, 2001).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 109 страницах, содержит 19 рисунков, 9 таблиц, 2J0 ссылок на цитируемую литературу и состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы».
Электронная структура полосы поглощения продана
Собственная флуоресценция белка обусловлена излучением остатков трех ароматических аминокислот - триптофана, тирозина и фенилалаиина (Teale& Weber, 1957, 1958; Владимиров и Бурштейн, 1960; Владимиров, 1965; Конев, 1965; Бурштейн, 19776). Остатки триптофана являются существенными для поддержания структуры и функции белка, участвуют во взаимодействиях с другими молекулами в разнообразных химических и фотохимических реакциях. Остаток триптофана является уникальной собственной флуоресцентной меткой, изменение параметров излучения которой используется для исследования структуры, динамики и функции белков (Walker et al., 1967; Hershberger et al., 1981; Бурштейн, 1983). В отличие от флуорофоров тирозина и фенилалаиина, спектр флуоресценции триптофанового флуорофора - индольной группировки - сильно зависит от таких свойств среды, как полярность, поляризуемость и релаксационная подвижность (Черницкий, 1972; Бурштейн, 1977а, б, 1983; Lakowicz, 2000; Demchenko, 1986, 1988). Вариации положения максимума спектра флуоресценции триптофана в белках достигают 45 7 нм (для тирозина и фенилалаиина лишь 2-3 нм) (Longworth, 1971; Бурштейн 1976,1977а).
Наряду с собственной флуоресценцией в исследовании белков используются и флуоресцентные красители, которые в силу иных специфических спектральных свойств позволяют получать дополнительную информацию о различных аспектах белковой структуры. Различают их использование в качестве невалентно связывающихся зондов и ковалентно присоединяемых меток (Лихтенштейн, 1974). Красители-зонды невалентно связываются с различными, в основном гидрофобными, участками белка, а метки обычно присоединяют к цистеиновым или лизиновым остаткам, и используют как репортерные группы при изучении структурных изменений в окрестности флуорофора. (Владимиров и Добрецов, 1980; Лакович, 1986; Eftink, 1991; Semisotnov et al., 1991; Haugland, 1996; Ladokhin, 2000; Demchenko et al., 2003).
Среди множества красителей, используемых в исследовании белков, наибольшей чувствительностью к полярности окружения обладает предложенный и синтезированный Вебером и Фаррисом 6-пропионил-2 (диметиламино)-нафталин (продан) (Weber & Farris, 1979). На основе продана синтезированы его различные производные. Так, в качестве ковалентной метки в исследовании свойств белков широко используется 6 акрилоил-2-(диметиламино)-нафталин (акрилодан), специфично связывающийся с сульфгидрильными группами остатков цистеина (Prendergast et al., 1983). Продан имеет небольшой размер, электронейтрален, растворим в воде до З-Ю М, имеет высокий квантовый выход флуоресценции и высокую чувствительность к свойствам растворителя (Mazumdar et al., 1992). Положение максимума спектра излучения продана изменяется от 401 нм в неполярном циклогексане до 531 нм в воде.
Спектры поглощения органических флуорофоров характеризуются несколькими длинноволновыми полосами, соответствующими синглетным 71-л переходам. Низколежащие состояния, согласно Платту (Piatt, 1949), обозначаются как La и Ьь, вышележащие и более интенсивные - как ВЬ) и Ва-состояния. В дальней ультрафиолетовой области наблюдаются интенсивные полосы поглощения триптофана с єІ97=20500М"Ісм"1 и є = 33000 М- см , соответствующие переходам в состояния Вь и Ва (Auer, 1973). Полоса поглощения в области 280 им с є280 = 5600 ІУГ см-1 обусловлена двумя почти вырожденными электронными переходами в состояния lLa и Lb, дипольные моменты которых почти взаимно перпендикулярны и расположены в плоскости молекулы (Weber, 1960; Yamamoto & Tanaka, 1972). Их различная чувствительность к полярности окружения позволяет разрешить эти переходы (Strickland et al., 1970; Andrews & Forster, 1974; Sun & Song, 1977; Valeur & Weber, 1977; Rehms & Callis, 1987; Eftink et al., 1990). Переход в Lb характеризуется структурированной полосой, положение которой почти не зависит от растворителя. В парах и в неполярных растворителях Lb является низшим возбужденным состоянием. Переход в La представляет собой широкую бесструктурную полосу, имеет высокий момент, и поэтому положение полосы этого перехода значительно зависит от свойств окружения. В полярных растворителях La занимает более низкий энергетический уровень (Walker et al., 1967; Lami, 1977; Callis, 1997).
Неполной делокализацией ти-электронов обусловлен и относительно высокий дипольный момент 3-4 Д (дебай) (Черницкий, 1972; Demchenko, 1986), а также значительное его изменение при переходе в возбужденное электронное состояние 10-11 Д (Бурштейн, 1983). Квантовомеханические расчеты показали, что поглощение фотона меняет распределение электронной плотности на атомах индольного кольца и изменяет длины связей (Slatter & Callis, 1995; Callis, 1997).
Для спектров поглощения производных индола в растворах различной полярности наблюдаются небольшие сдвиги до 3 нм, которые обусловлены как универсальными, так и специфическими взаимодействиями (Strickland et al., 1972; Бурштейн, 1976; Демченко, 1981).
Форма длинноволновой полосы спектра поглощения продана и его положение максимума зависят от свойств растворителя. Положение максимума спектра поглощения изменяется от 342 нм в циклогексане до 365 нм в воде. Молярный коэффициент экстинкции продана в воде равен 14500 М- см-1 при 365 нм (Weber & Farris, 1979), что примерно в два раза меньше, чем в других растворителях (Rottenberg, 1992). Молекула продана состоит из различных областей - ароматического ядра, карбонильной группы и аминогруппы в противоположных частях молекулы, что предполагает разнообразие в локальных взаимодействях с окружением ближнего и среднего порядка. С учетом этих взаимодействий в теоретических расчетах спектра поглощения (Novak et al., 1986; Ilich & Prendergast, 1989; Bunker et al., 1993) было показано, что нижнее возбужденное состояние обусловлено двумя разными переходами, соответствующими низкоэнергетическому {тг п}- и высокоэнегетическому {ял}-состояниям. В {пи}-состоянии метальные группы в аминогруппе расположены параллельно плоскости молекулы.
Спектральные измерения
Вид аналитической функции, представляющей контур индивидуальной полосы излучения флуорофора, и количество ее параметров имеет принципиальное значение для возможности расчетного разложения составных спектров. Определение параметров функции, описывающей компоненты составного спектра методом наименьших квадратов, математически неоднозначно и является обратной некорректной задачей (Тихонов и Арсенин, 1986). Для однозначности разложения используют такие подходы как определение параметров индивидуальных компонент из независимых экспериментов, фиксирование положения максимума, полуширины или асимметрии функции, полагая их одинаковыми для родственных соединений (Антипова-Коротаева и др., 1983; Metzler et al., 1973, Metzler et al., 1985, 1991; Морозов и др., 1987; Морозов и Бажулина, 1989), а также применение одновременной обработки всех экспериментально полученных зависимостей, которые описываются одними и теми же параметрами - глобальный анализ (Beechem et al.,1983; Knutson et al., 1983). Влияние различных факторов (уровня шума, спектрального разрешения, отношения вкладов и числа компонент) на точность разложения спектров флуоресценции на элементарные лог-нормальные компоненты было исследовано на моделях симулированных спектров в работе Бурштейна (Аборнев и Бурштейн, 1992).
Разложение гладких широких спектров на составляющие позволяет определить целый ряд важных параметров, характеризующих поглощающую или излучающую систему и недоступных для определения непосредственно из экспериментального спектра или при помощи квантовохимических расчетов. Например, это позволяет оценивать вклады в суммарный спектр разных молекулярных или структурных форм, положения, ширины их спектров и других характеристик (Metzler et al., 1973; Морозов и Бажулина, 1989).
Флуоресцентная спектроскопия является одним из наиболее широко используемых экспериментальных методов исследования структурных изменений белков. Исследование перестроек в белке методом флуоресценции основано на том, что положение максимума спектра излучения и выход флуоресценции как остатков триптофана, так и присоединенных красителей чрезвычайно чувствительны к полярности и динамическим свойствам микроокружения (Бурштейн, 1976, 1977а; Лакович, 1986; Demchenko 1986; Eftink, 1994; Пермяков, 2003). По изменению белковой флуоресценции, индуцируемой различными эффекторами, получают информацию о характере структурных переходов и свойствах локального окружения флуорофоров в белке. Для того чтобы получить количественную информацию, необходимо использовать параметры флуоресценции, которые линейно связаны со степенью завершенности перехода. II.7.1. Параметры флуоресценции как мера завершенности перехода
Для количественного анализа результатов измерений необходимо, чтобы используемый параметр флуоресценции при переходе из состояния Pi в состояние Р2 был линейно связан с концентрацией состояний или их вкладов в степень завершенности перехода между ними - а (Бурштейн, 1977а): а =[Р2]/([Р.] + [Р2]), где [Р] и [Рг] - концентрации состояний Р и Р2- Такими параметрами при измерении стационарных спектров флуоресценции являются абсолютный или относительный квантовый выход излучения, так как q = q\+CL(q2-q\), где q - измеряемый квантовый выход, q\ и q2- квантовые выходы состояний, между которыми происходит переход. Для этих целей пригодны пропорциональные выходам интенсивности флуоресценции при фиксированной длине волны, а также анизотропия и среднее время жизни возбужденного состояния (Eftink, 1994). Интенсивность флуоресценции при длине волны максимума не является мерой перехода, так как при этом не учитывается изменение формы спектра. Положение максимума спектра флуоресценции иногда используют для количественных измерений в исследовании переходов в белках. Этот параметр сложным образом зависит от меры перехода, так как необходимо учитывать форму спектра и величину квантового выхода белка до и после перехода. В работе (Quay & Condie, 1983) по изменению положения максимума спектра определили стехиометрию олигомеризации мелиттина при самоассоциации, предполагая, что форма спектра в максимуме описывается параболой, и нормируя интенсивности на квантовые выходы состояний.
Одним из способов обнаружения промежуточных состояний белка в процессе его перехода из начального состояния в конечное является анализ так называемых «фазовых» графиков (Капланас и др., 1975; Бурштейн, 1977а). Для построения такого графика используются два независимых параметра, линейно связанных с мерой завершенности перехода а. Так, интенсивности флуоресценции при разных длинах волн /(Л) и 7(Л2) могут быть представлены как переход представляется линейным отрезком. Но если в процессе перехода (при изменении а) образуется промежуточное состояние, то зависимость между /(ЛО и 1(\2) должна стать нелинейной и на фазовом графике должен наблюдаться излом. Фазовые графики являются эффективным и наглядным способом анализа флуоресцентных данных в изучении конформационных изменений (Permyakov et al., 1980) и процессов фолдинга (Kuznetsova et al., 2004).
В исследованиях переходов в белках в последнее время применяются различные физические, в том числе и флуориметрические, методы совместно с методами генной инженерии. Такой поход позволяет исследовать белки дикого типа и их мутанты и выделить в общей флуоресценции излучение определенного остатка триптофана или красителя. Это позволяет получить более детальную информацию о происходящих структурных изменениях в окрестностях индивидуальных флуорофоров, которые могут находиться в различных областях белковой глобулы. Особенно широко комплексные подходы используются при исследовании переходов в процессах сворачивания-разворачивания и функциональных свойств белков (Meagher et al., 1998; Nakamura et al., 1998; Kunz et al., 2000; Gasymov et al., 2004; Gao et al., 2005; Chedad et al., 2005).
В таких исследованиях наиболее однозначно интерпретируются структурные изменения по флуоресцентным параметрам однотриптофановых мутантов. Для выделения в излучении параметров флуоресценции индивидуального флуорофора используются различные стратегии исследования: замена одного или нескольких остатков триптофана на нефлуоресцирующие аминокислоты (Martensson et al.,1995; Gopalan et al., 1997; Chedad et al., 2005), замена нефлуоресцирующих аминокислотных остатков на остаток триптофана как флуоресцентного репортера в функционально важных областях белка, в которых отсутствуют природные флуорофоры (Kunz et al., 2000; Azuaga et al., 2003; Gasymov et al., 2004; Maki et al., 2007), или на цистеиновый остаток с последующим присоединением к нему красителя (Gasymov et al., 2004).
Влияние растворителя на форму и положение спектров флуоресценции СЗ-замещенных индола
Реактивы. В работе использовали препараты: L-триптофан, DL тирозин, ОЬ-аланил-ИЬ-триптофан, глицил-ОЬ-триптофан, 3 индолилуксусную, 3-индолилпропионовую и 3-индолилмасляную кислоты (Chemapol), триптамин-НСІ (Ferak); продан и акрилодан фирмы Molecular Probes (Eugene, OR, США); спектроскопически чистые растворители циклогексан, бензол, диоксан, хлорбензол, хлороформ, ацетон, ацетонитрил, диметилформамид, пропиленгликоль, этанол и метанол фирмы Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, США). Буферные растворы готовили из MES или Tris-HCl на деиоиизованной воде. Мочевину (Реахим) дополнительно очищали путем перекристализации из этанола. Иодид калия перед употреблением перекристаллизовывали. В опытах по тушению флуоресценции йодидом в раствор КІ для предотвращения образования 13 добавляли до 0,1 мМ №28гОз. Все использованные реактивы имели квалификацию ХЧ или ОСЧ.
Чтобы избежать эффектов концентрационного тушения и реабсорбции флуоресценции, концентрации флуорофоров не превышали Ю-4 М, что контролировали спектрофотометрически.
Белки. В работе были использованы трипсин, химотрипсин и бычий сывороточный альбумин (БСА) фирмы Sigma (St. Louis, МО, США). Бычий сывороточный альбумин был перед использованием обезжирен (Chen, 1967) и очищен от димеров и агрегатов по методике, описанной ранее (Нямаа и др., 1984). Мелиттин был выделен и очищен из пчелиного яда методом, описанным ранее (Демченко и др., 1987). [3-лактоглобулин был получен по стандартной методике (Канланас и др., 1975). Препараты 3-фосфоглицераткиназы (дрожжевой), алкогольдегидрогиназы (из печени лошади), лизоцима (куриного яйца) фирмы Sigma были очищены от низкомолекулярных примесей диализом или на колонке с сефадексом G-25. Химотрипсиноген A (Spofa) был использован без дополнительной очистки. Белок ОЕР-16 из наружной мембраны хлоропластов гороха и его однотриптофаиовые мутанты W77F и W100F были получены, как описано в работе (Pohmeyer el al., 1997). Конъюгат трипептида Lys-Cys-Phe с акрилоданом, субфрагмент 1 (S1) миозина (изомер А1), актин, конъюгаты акрилодана с субфрагментом S1 миозина и с актином были получены Андреевым О.А. как описано в работе (Емельяненко и др., 2000).
Концентрации белков и продана определяли спектрофотометрически, используя следующие значения молярных коэффициентов поглощения: для продана вводе А365= 14500 М_см 1 (Weber & Farris, 1979), для SI-А28о,% = 7,5 см-1 (Wagner & Weeds, 1977), для G-актина - А28о,%= 6,3 см-1 (Lehrer & Kerwar, 1972), для бычьего сывороточного альбумина-А28о = 6,67 см-1 (Нямаа и др., 1984), для мелиттина є28о = 5600 М см-1 (Демченко и др., 1987), для р - лактоглобулина - с280 = бООМ см-1 (Капланас и др., 1975). Концентрации конъюгатов белков с акрилоданом определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976), используя стандартные образцы фирмы Bio-Rad.
Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометрах Shimadzu UV1600U или Specord UV-VIS (Carl Zeiss, Йена, Германия). Спектры флуоресценции измеряли на автоматизированном спектрофлуориметре лабораторного изготовления с возбуждением от ртутной лампы (линии 296,7 нм для белков и 280,4 нм для низкомолекулярных флуорофоров) со сбором света флуоресценции с передней поверхности кюветы (Burslein et al., 1977). Спектральная ширина щелей монохроматоров не превышала 2 нм. Спектры флуоресценции красителей и их конъюгатов с белками измеряли на спектрофлуориметрах SLM Aminco SPF-500C или Perkin-Elmer SPF-44B с возбуждением при 360 нм. Спектральная ширина щелей на возбуждении и регистрации не превышала 3 им. Спектры флуоресценции белка ОЕР-16 и его мутантов были измерены на спектрофлуориметре ISA Fluoromax-1. Спектральная ширина щелей не превышала 2 нм. Возбуждали образцы при 295 нм. Спектры регистрировали в интервале от 305 до 450 нм с шагом 0,5 нм.
Спектры флуоресценции 1-и 2-ацетилантраценов в различных растворителях (Черкасов, 1960) были любезно предоставлены проф. А.С. Черкасовым (ГОИ, Ленинград), а спектры З-амино-N-метилфталимида (Гулис и Комяк, 1978) - И.М. Гулисом (физический факультет Белорусского государственного университета, Минск).
Все спектры флуоресценции были исправлены на спектральную чувствительность приборов (Емельяненко, 1991). Для вычисления поправочных коэффициентов были использованы водные растворы фенилаланина, тирозина и триптофана, а также растворы бисульфата хинина и 2-аминопиридина в 1 н серной кислоте. Истинные табулированные спектры флуоресценции этих стандартных растворов были получены ранее (Владимиров и Бурштейн, 1960; Melhuish, 1975). Интенсивности в исправленном спектре пропорциональны числу фотонов, испускаемых в единичном интервале длин волн в единицу времени.
В опытах по влиянию температуры образец в кювете нагревали с помощью элемента Пельтье, установленного в кюветодержателе. Температуру в кювете измеряли с помощью термопары. Величину рН растворов измеряли с помощью pll-метра рН-410 (Аквилон, Россия), снабженного универсальным электродом ЭСК-10601. Точность измерения ±0,02 рН.
Влияние концентрации мелиттина на процесс олигомеризации. Стехиометрия олигомеризации
В щелочной зоне доминировали два эффекта. С ростом рН от 7,5 до 9,0 выход флуоресценции коротковолновой компоненты I падал на 25% без изменения выхода компоненты II, что приводило к длинноволновому сдвигу суммарного спектра (рис. 12а, кривые 2, 4). Это свидетельствует скорее всего о структурной перестройке тетрамера, так как депротонирование в этой зоне рН какой-либо белковой группировки не вызывает усиления тушения флуоресценции остатков триптофана. При рН более 9,0 выходы излучения обеих компонент параллельно резко снижались в 2,2-2,5 раза (рис. 12а, кривые 2, 3), что можно объяснить эффективным тушением флуоресценции ионами ОН- с образованием депротонированной (индолятной) формы триптофана в возбужденном состоянии (Бусел и др., 1970; Бурштейн, 1976).
В наиболее удобной для анализа форме все эти изменения отражаются на псевдо-фазовом графике, который, аналогично графику в координатах интенсивностей при двух постоянных длинах волн суммарного спектра (Капланас и др., 1975; Бурштейн, 19776), выражен в координатах (а\, аи), где а\ и а\\ - величины, пропорциональные квантовым выходам флуоресценции компонент I и II, соответственно. В качестве а\ и ап можно использовать площади под спектрами компонент либо интенсивности в максимумах их спектров, которые пропорциональны площади под графиком лог-нормальной функции. В координатах (Д, Дц), измеренных как относительные площади под спектрами компонент при разных рН (рис. 126), имеется 5 элементов: (1) линейная ветвь при рН от 0,7 до 2,5, соответствующая неодинаково эффективному тушению компонент протонами (НзО+) или карбоксилами; (2) короткий отрезок в интервале рН от 2,5 до 4,0, отражающий, по-видимому, небольшую перестройку тетрамера; (3) плотная группа практически совпадающих точек в интервале рН от 4,0 до 7,5, соответствующая нативному состоянию тетрамера; (4) почти горизонтальный отрезок для интервала рН от 7,5 до 8,9, соответствующий структурным или динамическим изменениям в тетрамере и (5) экстраполируемый в начало координат линейный отрезок, полученный при росте рН от 8,9 до 11,9 и отражающий одинаково эффективное тушение флуоресценции обеих компонент ионами ОН . График в координатах (а\, а\\) оказался много лучше разрешенным, чем в привычных фазовых координатах при фиксированных длинах волн.
Исследования тепловых переходов в белках по спектрам флуоресценции существенно осложняются существованием фонового температурного тушения флуоресценции вследствие тепловой активации структурной подвижности в белке и, следовательно, увеличения частоты столкновений возбужденного флуорофора с тушащими группами (Bushueva et al., 1975a,b; 1978; 1980). Это осложняет анализ переходов по интенсивности или квантовому выходу флуоресценции и делает особенно важным анализ изменений вкладов отдельных компонент спектра излучения. Такие параметры флуоресценции, как положение максимума, ширина спектра и квантовый выход для тетраметра мелиттина, в отличие от большинства глобулярных белков, при нагревании от 20 до 95С изменяются монотонно. Максимум смещается от -332,5 до -343 нм (рис. 13а, кривая 1), а ширина спектра растет от -54 до 62 нм. Это происходит на фоне монотонного снижения выхода излучения более чем в 5 раз. И лишь после разложения спектра на три лог-нормальные компоненты становятся очевидными изменения в свойствах остатков триптофана в тетрамерном мелиттине. Вызываемое нагреванием монотонное снижение вклада коротковолновой компоненты I (рис. 13а, кривая 2) сопровождается ростом вклада компоненты II (344 нм) при нагревании от 20 до 50С и дальнейшим его падением при температуре 60С (рис. 13а, кривая 3).
Кроме того, при 55С появляется и значительно растет вклад новой компоненты с максимумом при 351 нм (компонента III, рис. 13а, кривая 4), Влияние температуры на флуоресценцию тетрамерного мелиттина. а -зависимость от температуры положения максимума спектров (кривая 1) и вкладов лог-нормальных компонент с положением максимумов при 328, 344 и 351 нм (кривые 2, 3 и 4, соответственно) в нормированные по интенсивности спектры (С =5-10 5 М, 2 М КС! в 0,01 М трис-HCl, рН 7,4) б - зависимость от отношения Т/ті величин обратного квантового выхода І/q компонент тетрамера мелиттина с Хтх 328 (кривая 1) и 344 нм (кривая 2). в - фазовое представление в кординатах (I390, Ьго) Для температурной зависимости спектров флуоресценции тетрамера мелиттина совпадающей со спектрами полностью денатурированных белков и мономерного мелиттина.
Такая картина соответствует возможной последовательности переходов состояний тетрамера из формы с доминирующей в излучении компонентой I в форму с преобладающей компонентой II, которая при температуре 50С переходит в более рыхлую форму с доминирующей компонентой III. Однако анализ зависимостей обратной величины площади под спектрами компонент I и II от коэффициента диффузии в растворителе (использовано пропорциональное коэффициенту диффузии отношение температуры к вязкости Т/ц (рис. 136)) показал, что при нагревании до 60С эти зависимости линейны, что характерно для чистого температурного тушения (Bushueva et al., 1978; 1980), и лишь при температуре 60С наблюдается резкое отклонение от линейности и падение выходов обеих компонент. Учитывая, что температурное тушение компоненты I много более эффективно, чем компоненты II, можно считать, что результирующий длинноволновый сдвиг суммарного спектра от 20 до 60С по меньшей мере частично определяется не только структурной перестройкой тетрамера, а более эффективным температурным тушением коротковолновой компоненты. В то же время, резкое падение квантовых выходов компонент I и II и рост компоненты III свидетельствуют о разрыхляющем структурном переходе в тетрамере. Это подтверждается и переломом линейной зависимости на псевдо-фазовом графике в координатах (/320, /390) при температуре 66С (рис. 13в). Такая интерпретация полностью согласуется с результатами исследования влияния температуры на структуру окружения остатков Тгр19 в тетрамерном мелиттине методами ЯМР (Iwadate et al., 1998), которое выявило разрыхление структуры тетрамера мелиттина при 60С, при которой расстояния между мономерами увеличиваются на 2 А. Истинного разворачивания структуры тетрамера мелиттина при нагревании до 95С не наблюдается. Таким образом, анализ температурных изменений вкладов лог-нормальных компонент спектров флуоресценции тетрамера мелиттина позволил выявить и интерпретировать тонкие изменения в состоянии остатков триптофана, индуцируемые нагреванием.
Денатурацию мочевиной Р-лактоглобулина из коровьего молока исследовали при рМ 4,5 в присутствии 0,15 М КС1 при температуре 4С. В этих условиях Р-лактоглобулин представляет собой димер (Timasheff et al., 1966). Мономер Р-лактоглобулина содержит два остатка триптофана (Тгр 19 и Тгрбі), однако флуоресценция одного из них (Тгрбі) полностью потушена соседней дисульфидной связью. В результате спектр флуоресценции нативного Р-лактоглобулина имеет форму стандартной лог-нормальной функции с максимумом при 330 нм. На рисунке 14а представлены зависимости от концентрации мочевины относительной площади под спектром и его положения максимума. В зоне существования единственной компоненты с максимумом при 330 нм, при концентрациях мочевины от 2,25 до 3,5 М наблюдается падение выхода флуоресценции на 8-10%, свидетельствующее о возмущении окружения триитофанового флуорофора. Кроме того, квантовый выход излучения полностью денатурированного Р-лактоглобулина с ростом концентрации мочевины от 5,25 до 7,75 М увеличивается почти на 20% без дополнительных сдвигов спектра, что можно отнести к ослаблению мочевиной эффективности тушения флуоресценции полностью доступного растворителю триптофана водой или соседними тушащими группами белка. Эти изменения можно было бы интерпретировать как показатель кооперативного денатурационного перехода между двумя состояниями - нативным и полностью развернутым.
