Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Устройство автоматического анализа гелевых электрофореграмм на базе ЭВМ Ю
І.І. Электрофорез белков и их комплексов в полиакрил-амидном геле 10
1.2. Фотометрирование гелевых электрофореграмм... 12
1.3. Структура и основные характеристики устройства ввода электрофореграмм в ЭВМ 21
1.4. Блок фотометрирования устройства ввода электрофо реграмм 30
1,5. Блок сканирования устройства ввода электрофоре грамм 38
1.6. Блок сопряжения устройства ввода электрофоре грамм 41
ГЛАВА 2. Машинный количественный анализ электрофоретических спектров белков и их комплексов 49
2.1. Постановка задачи машинной обработки электрофореграмм на ЭВМ "Электроника-100" 49
2.2. Математическое описание денситометрической реализации,.,... 57
2.3. Аналого-цифровое преобразование денситометрической реализации 60
2.4. Математическое обеспечение автоматического анализа электрофоретических спектров 65
2.5. Оценка погрешности измерения характеристик электрофореграмм 76
ГЛАВА 3. Результаты апробации автоматического количествен ного анализа электрошоретических спектров в био логических исследованиях 77
3.1. Структурная схема использования программно-алго ритмического обеспечения автоанализатора в биологических исследованиях 77
3.2. Применение автоанализатора в сравнительных исследованиях микроорганизмов 8
3.3. Применение автоанализатора в типировании липо-протеидемий популяционной выборки 95
Основные результаты и вывод! Работы
Список литературы
- Структура и основные характеристики устройства ввода электрофореграмм в ЭВМ
- Блок сканирования устройства ввода электрофоре грамм
- Аналого-цифровое преобразование денситометрической реализации
- Применение автоанализатора в сравнительных исследованиях микроорганизмов
Введение к работе
Актуальность темы. Решение многих биологических и медицинских задач требует проведения широких исследований больших групп организмов. Это необходимо при таксономическом анализе микроорганизмов, при реализации программ лабораторных обследований в клинике в процессе диспансерных и эпидемиологических наблюдений. При этом исследователи активно используют сравнительные характеристики белков и их комплексов, получаемые методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле.
Аналитическое электрофоретическое фракционирование призвано решать многие современные задачи белковой химии: количественный анализ спектров белков и их комплексов, выявление и сравнительное типирование множественных молекулярных форм белков, определение чистоты и однородности белковых препаратов и др. широкое и необходимое внедрение гелевых электрофорезов в практику биологических и медицинских исследований больших групп организмов требует биофизических подходов к решению этого вопроса. Для решения данной проблемы необходимы разработка и создание комплекса аппаратуры автоматического анализа (имеющего в своем составе ЭВМ) гелевых электрофореграмм биополимеров, который обеспечивает высокопроизводительное надежное изучение протеинограмм биологических объектов, включающего в себя количественную оценку состава спектров белков и их комплексов. Решение этой проблемы особенно необходимо для обеспечения возможности проведения популяционных исследований.
Цель работы. Создание комплекса аппаратуры автоматического анализа гелевых электрофореграмм биополимеров для получения количественной оценки состава спектров белков и их комплексов.
Основные задачи исследования. В задачу работы входит:
Разработка технического и математического обеспечения для обработки результатов электрофоретических исследований биополимеров, включащего в себя комплекс аппаратуры и совокупность программ, которые позволяют наиболее эффективно решать задачи денситометрирования гелевых электрофореграмм, сбора денсито-метрической информации на ЭВМ, количественной обработки электрофоретических спектров белков и их комплексов с дальнейшим типи-рованием комплексных результатов их анализа.
Апробация разработанного комплекса аппаратуры и математического обеспечения на примерах исследования:
а) электрофоретических спектров белковых систем (мембран
ных и внеклеточных) микроорганизмов;
б) электрофоретических спектров липопротеидов сыворотки
крови здоровых и больных людей.
Общая характеристика работы. Техническое обеспечение для обработки результатов электрофоретических исследований в данной работе реализовано в виде специально разработанного автоматического анализатора электрофоретических спектров белков и их комплексов на базе мини-ЭВМ "Электроника-100". В состав комплекса технических средств анализатора включены: денситометрический преобразователь, преобразователь аналог-код, мультиплексер и ЭВМ "Электроника-ТОО".
Особенностью разработанного анализатора в отличие от других автоматических денситометров (Исаи -400,OF-5, Inte^raf ) является то, что впервые ЭВМ использована не только в режиме сбора обработки, но и в режиме управления основными узлами денси-тометрического преобразователя (преобразователем аналог-код и высоковольтным і источником питания). Это позволило в автоанализа-
торе расширить диапазон измерения оптической плотности до 4 Д. Использование индикатора на базе электроннолучевой трубки, со-пряженной с ЭВМ, вместо традиционных регистрирующих устройств (потенциометрических самописцев) позволило на порядок повысить скорость перемещения предметного стола в денситометрическом преобразователе. Это значительно уменьшило диспропорцию между- временем ввода электрофореграмм в ЭВМ и временем ее обработки на вычислительной машине, что в целом позволило существенно сократить общее время анализа электрофоретических спектров.
Принцип работы автоанализатора состоит в дискретизации растр-элементом электрофореграммы на отдельные элементы разложения, измерении и преобразовании в цифровой код значений оптической плотности каждого элемента разложения электрофореграммы, формирование в ОЗУ ЭВМ массивов цифровых значений денситограмм, которые в дальнейшем обрабатываются алгоритмами количественного и сравнительного анализа.
Машинная количественная обработка электрофоретических спектров биополимеров реализована в виде специально разработанного математического обеспечения, в состав которого включены пакет программ обработки денситограмм в масштабе реального времени и пакет программ обработки информации в режиме "свободного времени". Пакетом программ обработки денситограмм в масштабе реального времени решаются следующие задачи:
Непосредственный ввод от денситометрического преобразователя цифровых значений оптической плотности элементов разложения электрофореграмм в ЭВМ.
Организация массивов цифровых значений оптической плотности вводимых в ОЗУ ЭВМ электрофореграмм.
Дистанционное управление преобразователем аналог-код и высоковольтным источником питания ФЭУ с помощью ЭВМ.
4. Проверка достоверности ввода информации в ОЗУ ЭВМ путем формирования дискретных амплитудных значений денситограмм на экране ЭЛТ.
Пакетом программ обработки фонового режима решаются следующие задачи:
Формирование "нулевого" уровня денситограммы (для градиентных гелей - несколько "нулевых" уровней).
Определение координат и высот пиков денситограммы.
Вычисление процентных количественных содержаний вещества в идентифицированных фракциях и расчет относительных координат.
Сравнительный анализ денситограмм по параметру Ri и коэффициентам их автокорреляционных функций.
Вывод результатов количественной обработки ( Rf - параметра, процентных количественных содержаний вещества во фракциях, коэффициентов близости) на ЭПМ "Консул-254".
С помощью разработанного анализатора с целью его апробации методом автокорреляционного анализа проведено сравнительное изучение электрофоретических спектров мембранных белков (14 штаммов стафилококков), внеклеточных белков (12 штаммов стафилококков) и исследование электрофоретических спектров липопротеидов сыворотки крови 237 людей.
Научная новизна и основные результаты работы. Впервые на базе отечественных средств измерительной и вычислительной техники создан автоматический анализатор гелевых электрофореграмм. Разработанное устройство защищено двумя авторскими свидетельствами5^. Создано из программ для ЭВМ "Электроника-100" математическое обеспечение, позволяющее в режиме "он-лайн" осуществлять
х/ А.С. № 738602 и № 805998.
обработку электрофоретических спектров белков и их комплексов.
С помощью разработанного анализатора совместно с клиницистами и клиническими биохимиками исследованы электрофоретические спектры липопротеидов сыворотки крови людей. При этом определены процентные количественные содержания вещества в электрофоре-тически разделенных фракциях пре-бета-, бета- и альфа-липопроте-идов, Показана целесообразность включения такого количественного определения состава липопротеидов в комплекс широких (популяци-онных) обследований людей.
Использование автоанализатора для получения данных по сравнительному анализу денситограмм электрофоретических спектров белковых систем микроорганизмов положительно оценено микробиологами. На основании автокорреляционной оценки степени близости сопоставленных денситограмм было проведено группирование 14-ти штаммов стафилококков, которое согласовалось с видовыми признаками 6. aures и ^.epidermis . Хорошее согласование со штаммовыми характеристиками стафилококков также было получено по результатам автокорреляционного анализа денситограмм электрофоретических спектров внеклеточных белков 12 штаммов стафилококков. Дальнейшее развитие этих наблюдений представляет большой интерес для эпидемиологических исследований.
Практическое внедрение. На базе ГНИИЭМ для использования разработанного автоанализатора в 1978 году был создан центр, который по мере необходимости обслуживал (кроме лабораторий института) три терапевтические клиники Горьковского медицинского института им. С.М.Кирова (на базе областной и двух городских больниц) и медицинский пункт одного предприятия г. Горького.
Результаты исследования спектров белков и их комплексов с помощью автоматического количественного анализа электрофореграмм включены в программу обучения студентов кафедры молекулярной
биологии Горьковского госуниверситета им. Н.И.Лобачевского и используются в учебном практикуме, а также в научно-исследовательской работе сотрудников биологического факультета ГГУ.
Автор защищает следующие положения:
Устройство для автоматического количественного анализа электрофоретических спектров белков и их комплексов.
Математическое обеспечение для количественной обработки электрофоретических спектров белков и их комплексов.
Результат апробации системы на нескольких конкретных задачах, показывающие возможность ее дальнейшего использования
в широких (популяционных) биологических и медицинских исследованиях.
Структура и основные характеристики устройства ввода электрофореграмм в ЭВМ
В настоящее время существует достаточно обширный ассортимент денситометров (табл.ї), выпущенных в основном зарубежными фирмами, в состав которых входят как простейшие ден-ситометрические преобразователи, позволяющие получать денси-тограмму, так и денситометры с более сложной архитектурой и конструкцией, на базе которых возможна организация систем автоматической обработки электрофореграмм. На рис. 1.5а приведена структурная схема простейшего денситометрического преобразователя. Основными узлами денситометра являются: 1. блок сканирования (БСК), который за счет перемещения предметного стола с ЭФГ обеспечивает разложение ее растром на отдельные елементы разложения; 2. блок фотометрирования с высоковольтным источником питания (ВИЛ), который осуществляет измерение оптической плотности элементов разложения ЭФГ; 3. регистрирующее устройство (РУ), которое обеспечивает запись денситограммы в виде графика.
Организация схемы управления (СУ) в блоке фотометрирования зависит от способа измерения оптической плотности. Наиболее распространенными схемами измерения оптической плотности являются однолучевая, двухлучевая и компенсационная 20, 21 . На базе структурной схемы,приведенной на рис. 1.5а,организована конструкция денситометров марки "БИАН-170И(СССР), " &сап -400" (Великобритания), " DensitoEab - Ї74" (ФРГ). Основным недостатком данного схемного решения является низкое быстродействие анализатора, которое обусловлено жесткой синхронизацией системы сканирования ЭФГ с инерционными блоками измерения и регистрации оптической плотности элементов разложения электрофореграмм. На рис. 5.1.6 приведена структурная схема системы, которая, используя архитектуру простейшего денситометрического преобразователя и элементы аппаратуры связи (аналогоцифровой преобразователь, интерфейс) с вычислительной машиной, позволяет организовать машинную обработку электрофоретических спектров.Такая идеология построения систем для автоматической обработки электрофореграмм заложена в конструкцию денситометров марки У\Ш -5 (ФРГ), fate-гарЪ (Швейцария). Paragon (США.),Шго&са:п -2202 (Швеция). В качестве вычислительных устройств в данных денситометрах были использованы различные варианты интеграторов для обсчета пиков многоэкстремальных денситограмм (электронные,цифровые,цифровые с графическим дисплеем). Аналогичная идеология построения систем для анализа электрофореграмм была взята рядом авторов [14,76,80,81] при организации систем автоматической обработки электрофоретических спектров с использованием в качестве вычислительных устройств различных вариантов мини-ЭВМ. Создание систем "денситометр-ЭВМ" в основном обусловлено задачами разработки и создания надежных алгоритмов, и в то же время "гибких", для обработки многоэкстремальных кривых в условиях различных помех ("ложных" пиков, "плечей", перекрываний пиков), а также задачами, связанными с накоплением экспериментальных данных, созданием банка данных и ретроспективной обработкой. Однако, подобная организация систем автоматической обработки электрофореграмм с использованием денси-тометрических преобразователей с низким быстродействием приводит к большой диспропорции между временем ввода информации в ЭВМ и временем ее обработки. Это в конечном счете оказывается на общем времени анализа электрофоретических спектров. Данный недостаток можно компенсировать, например, путем использования программных возможностей ЭВМ для реализации функций блока измерения оптической плотности элементов разложения
ЭФГ. На рис. 1.5в приведена структурная схема системы автоматической обработки электрофореграмм, при которой ЭВМ, включенная в комплекс технических средств анализатора, может обеспечить программным способом функции цифрового логарифматора сканограммы, режим однолучевого и двухлучевого способа измерения оптической плотности, а также возможность автоматического переключения поддиапазонов чувствительности денситометра (путем управления аналого-цифровым преобразователем и высоковольтным источником питания) [78,79] . Кроме того, данная структурная схема позволяет использовать также быстродействующие регистраторы для накопления сканограмм, как накопители на перфоленту, магнитную ленту и диски. К преимуществам технических решений, заложенных в данную структурную схему для автоматической обработки электрофореграмм следует отнести перспективность ее реализации на базе микропроцессорной техники.
При этом возможная схема автоматической системы для обработки электрофоретических спектров может быть организована в виде многоуровневой структуры. Причем, на первом уровне один микропроцессор может решать задачи, связанные с измерительными и управляющими операциями при определении значения оптической плотности элементов разложения электрофореграмм и формировании денситометрических кривых (т.е., реализует функции денситомет-рического преобразователя), а на втором уровне другой микропроцессор обеспечивает вычислительные функции (например, обсчет пиков) и передачи данных в мини-ЭВМ (третий уровень) для последующей обработки экспериментальных данных (формирование банка данных, ретроспективная обработка). Учитывая вышеизложенное, в данной работе в качестве базовой структуры при организации системы автоматического анализа электрофореграмм была взята схема, приведенная на рис. 1.5в. Такая структура позволила значительно улучшить такие технические характеристики, как быстродействие (на порядок по отношению к предыдущим схемам), диапазон измерения оптической плотности (до 4D) и производительность (180 ЭФГ/час).
Блок сканирования устройства ввода электрофоре грамм
Сканированием называется относительное перемещение носителя информации и светового луча, при котором происходит формирование растр-элемента на носителе. В настоящее время к наиболее распространенным методам сканирования можно отнести: 1. Сканирование, при котором перемещение светового луча с прямоугольным сечением по полю носителя производится с постоянной скоростью. 2. Функциональное сканирование, при котором перемещение светового луча (или носителя информации) производится по определенному закону. 3. Сканирование световым лучом с переменным сечением. В зависимости от конфигурации носителей информации возможно применение комбинаций рассмотренных методов сканирования.
Процесс сканирования осуществляется с помощью генератора светового луча, механизма перемещения образца носителя информации и узла управления. Генератором светового луча и оптической системой формируется растр-элемент образца, дискретизирующий носитель информации на отдельные элементы разложения. Однако при сканировании объекта лучом конечных размеров происходит искажение пространственного спектра носителя информации.
Пространственный спектр "к "-го элемента разложения Мс( »5х,и}у,к) по определению представляет собой комплексную функцию, связанную с распределением яркости на элементе фотометрирования парой преобразования Фурье[24] . где 05х , сЛу - круговые пространственные частоты спектра в направлении осей X. и V Пространственный спектр просканированного объекта фотометрирования связан со спектром исходного носителя информации: e,(0Sx,6Sy)=A(6Sx,(Jy) ( x. v) 1Л9 причем где A(oSx,o5y) - пространственная частотная характеристика сканирующего луча, 6 ( х, ) - пространственный спектр исходного изображения, Р (X , У) - аппаратная (импульсная переходная) функция сканирующего луча. Для прямоугольной диафрагмы аппаратная функция имеет вид: а,Ъ - параметры луча сканирования. Пространственная частотная характеристика такого луча: То есть сканирующий луч, имеющий приведенную такую пространственную частотную характеристику, воспроизводит пространственные частоты:
При сканировании изображения, содержащего высокие пространственные частоты, необходимо применять сканирующий луч с малыми размерами а , Ь . Однако при этом резко снижается амплитуда информативного сигнала (за счет снижения светового потока сканирующего луча), что ведет к резкому снижению помехоустойчивости устройства из-за уменьшения соотношения сигнал/шум.
Характерной особенностью изображения электрофореграммы являются прямоугольные полосы различной ширины, которые параллельны друг другу и перпендикулярны направлению сканирования луча, для выделения всех фракций на электрофореграмме в блоке сканирования устройства ввода формировался луч в виде узкой, но длинной полоски, перпендикулярной направлению сканирования. Пространственная частотная характеристика такого луча:
При такой конфигурации диафрагмы граница пропускания пространственных частот определяется только наименьшей величиной параметра " a ". в блоке сканирования устройства наименьшая величина параметра " a " составила 0,1 мм,которая обеспечила разрешающую способность по строке сканирования 0,2 мм. Величина параметра 11 Ь " определялась радиусом сечения электрофореграммы и рассчитывалась по формуле (I.I6), приведенной в 1.2.
Учитывая,что электрофореграмма представляет сплошной прозрачный цилиндр, обладающий свойством линзы, и поэтому выделение растр-элемента на изображении электрофореграммы связано с усложнением конструкции оптического канала фотометрирующего устройства- в блоке сканирования был применен способ выделения растр-элемента на оригинале.
Существенной особенностью применения мини ЭВМ при автоматизации научного эксперимента является проблема "привязки" машины к объекту [25] . Блоки сопряжения,которые выполняют связующие функции между мини ЭВМ и объектом, получили названия УСО. Обычно УСО содержит набор необходимых входных и выходных преобразователей информации, а также схемы управления и согласования,реализующие необходимые стыковочные (интерфейсные) функции между преобразователями и ЭВМ. В настоящее время существующие УСО можно разделить на две группы: первая группа- это УСО, осуществляющие подключение объектов к мини ЭВМ по радиальному принципу, и вто рая группа - по магистральному принципу.
К достоинствам УСО радиального режима подключения следует отнести простоту интерфейсных управляющих сигналов, асинхронный режим работы, небольшое число команд ввода (вывода для работы с блоком связи и серийный выпуск отечественной промышленностью данного класса УСО.
Большую известность в настоящий момент приобретает система аппаратуры связи ЭВМ с объектом типа "КАМАК". Возведенная до ранга международных стандартов принципами своей организации, эта аппаратура успешно применяется при решении задач по автоматизации научного эксперимента
Аналого-цифровое преобразование денситометрической реализации
Правильный выбор интервала дискретности л t или частоты преобразования F позволяет с достаточной степенью точности определить значения преобразуемой реализации на интервалах между отсчетами. При выборе частоты преобразования обычно учитывают требуемую точность преобразования, спектральный состав исходного сигнала и характер кривой аппроксимации, применяемой для восстановления сигнала после квантования[2і] .
В общем случае систем с фильтрацией задача необходимой частоты преобразования сигналов с ограниченным спектром частот решена В.А.Котельниковым. Из теоремы Котельникова следует, что с ограниченным спектром частот от 0 до f может быть определена совокупностью дискретных отсчетов, взятых через интервал времени[30]: , 1 _ П ДІ = гу- - 7Т (2.13) din Wn При этом выходной сигнал устройства аппроксимируется с помощью ряда: Y(t=Z У (К лі) -— (2.14) К= -f-(t-KAt) где 9. = 2(д5п - частота преобразования, К - целое число, y(Kut)- отсчетные значения сигнала в моменты t = К At Практическое применение теоремы Котельникова в устройствах дискретной техники встречает серьезные затруднения, что стало предметом оживленной дискуссии в отечественной литературе[31].Дело в том, что ряд важных условий, при которых выведена теорема (обязательное ограничение спектра полосой пропускания фильтра, применение идеальных фильтраций и модуляции и др.), не может быть выполнено в реальной аппаратуре. Поэтому физически реализуемый после квантования выходной сигнал y(t) лишь приближенно равен исходному, при этом условие (2.14) существенно уточняется. К числу основных ошибок, связанных с применением теоремы Котельникова, относят следующее; ошибки за счет появления составляющих на частотах, превышающих половину частоты преобразования SI ; ошибки за счет отбрасывания членов ряда, с помощью которых аппроксимируется Y(t) ; ошибки, обусловленные не идеальной фильтрацией, применяемой при восстановлении Y(t) , и ошибки, обусловленные конечной длительностью квантующих импульсов. Применение выражений (2.13) и (2.14) в устройстве ввода ЭФГ оправдывается тем, что частотный спектр получаемых сигналов ограничивается инерционностью сканирующей аппаратуры. Для ориентировочной оценки ширины спектра выходного сигнала денситометрического преобразователя можно воспользоваться формулой: п.г. Л „ _ (2.15) 2d где Up — скорость развертки, которая определяется скоростью движения предметного стола денситометра, а - размер растр-элемента вдоль строки сканирования. Если спектр выходного сигнала определить граничной частотой fпг , то при использовании идеального выходного фильтра появляется ошибка A(t) , обусловленная наличием высокочастотных составляющих вне полосы пропускания фильтра. При этом восстанавливаемый сигнал равен: , ч — їЬі:п( 5лг (t-Кді) У, t)= Z У (К лі) — (2.16) а ошибка AL = У,(І) - У(1) Ее значение ограничено выражением (t) j- 1 Sin (Лпг t ] (2.17) должна составить 200 гц.
Приведенная выше оценка частоты преобразования F по граничной частоте fnr денситометра является верхней оценкой. В случае, когда весь частотный диапазон денситометра не используется, тогда оценка частоты среза f л возможна непосредственно по аналитическому выражению денситометрической реализации. Для расчета fп аналитическое выражение денситометрической реализации было представлено в виде суперпозиции только кривых гаус-совского распределения
Применение автоанализатора в сравнительных исследованиях микроорганизмов
Липопротеиды низкой плотности (ЛПНП) или бета-ЛП менее ге-терогенны, чем хиломикроны и ЛПОНП. ЛПНП - самые богатые холестерином частицы. В организме они транспортируют до 2/3 всего холестерина и поэтому ЛПНП считают самым атерогенным классом из ли-попротеидов [94,95"] . При фракционировании с помощью колоночной храмотографии было доказано, что ЛПНП состоит из ряда субфракций, различающихся, по крайней мере, зарядом и содержанием холестерина [96]
Липопротеиды высокой плотности (ЛПВЛ) или альфа-ЛП отличаются от ХМ, ЛПОНП, ЛПНП более высоким содержанием белка (более 30$). В ЛПВП различают в настоящее время несколько подклассов: JOMIj, ЛЕЮэ и ЛПВПд. В дополнение к хорошо известным подклассам ЛПВП обнаружен неизвестный ранее подкласс ЛПВП в плазме крови новорожденных и названный ЛПВП . В плазме взрослых людей этот подкласс отсутствует. Физиологическая роль ЛПВПг с пока неизвестна [97] . Повышенное содержание холестерина в ЛПВП - ги-перальфалипопротеидемия - рассматривается как антириск-фактор ишемических болезней сердца [98]
Гиперлипопротеидемий и их классификация. Повышение (гипер-липопротеидемия) или понижение (гиполипопротеидемия) концентрации отдельных классов липопротеидов сыворотки крови наблюдается при многих заболеваниях [99] . Нарушения липидного обмена и связанные с ними изменения количественного содержания липопротеи -99 дов сыворотки крови, особенно богатых ХС, имеют существенное значение в патогенезе атеросклероза. Разработка единых подходов к изучению гиперлипопротеидемий (ГЛП) стала возможной после появления их классификации, предложенной Fredrich&on с соавторами в 1965 году и одобренной ВОЗ в 1970 году.
Тип I (гиперхиломикроемия). Основное изменение в ЛП крови: высокое содержание ХМ и резкое повышение содержания ТГ крови. Уровень ХС либо в пределах нормы, либо немного повьшен. В основе этого типа лежит недостаточность фермента липопротеидлипазы. Встречается редко. II тип (гипербеталипопротеидемия). Этот тип ГЛП делится на два подтипа: 1) IIа тип - основные изменения в ЛП крови: повышение содержания ЛПНП на уровне нормального содержания ЛАОНП; 2) II0 тип - основные изменения в ЛП крови: повышенное содержание ЛПНП и ЛПОНП. II тип ГЛП характеризуется высоким, а в некоторых случаях очень высоким уровнем ХС крови. Содержание ТГ в крови может быть нормальным (IIа тип), либо повышенным (II тип). Первичная ГЛП типа II наблюдается уже в раннем возрасте и часто связана с про грессирующим атеросклерозом. II тип является наиболее распрост раненным типом ГЛП. III тип ("флотирующая" ГЛП). Основными изменениями в Ж кро ви являются необычно высокое содержание ХС и несвойственная ли попротеидам электрофоретическая подвижность (флотирующие бета-ЛП). III тип встречается редко и часто сочетается с проявлениями ате росклероза. IV тип (гиперпребеталипопротеидемия). Основное изменение в ЛП крови: повышенный уровень ЛПОНП (пре-бета-ЛП). Этот тип ГЛП характеризуется высоким содержанием в крови ТГ при нормальном или относительно невысоком уровне ХС. Клинически этот тип проявляется развитием атеросклероза коронарных сосудов. ІУ тип ГЛП развивается в зрелом возрасте и представляет собой распространенный тип ГЛП в нашей популяции.
У.тип (гиперхиломикронемия и гиперпребеталипопротеидемия). Основные изменения ЛП в крови: наличие высокой концентрации ХМ и повышенной концентрации ЛПОНП (пре-бета-ЛП). Содержание ТГ резко увеличено, концентрация ХС нормальная. У тип ГЛП встречается у взрослых людей и не имеет широкого распространения [100 -102] .
Современные биохимические методы типирования гиперлипопро-теидемий. Для установления типов ГЛП в настоящее время используют такие аналитические методы как мембранную фильтрацию, ультрацентрифугирование в сочетании с определением концентрации ХС и ТГ в сыворотке крови, электрофорез плазмы крови в полиакриамидном геле (ПААГ)[95,102] . Определение ХС в сыворотке крови осуществляется методомАЬеРВ [103]. Для определения концентрации ТГ в сыворотке обычно используют метод Carbon [104]
Препаративное выделение ЛП сыворотки крови осуществляется с помощью ультрацентрифугирования. За счет различий в плотности и размерах частиц ЛП отдельных классов, варьированием плотностью растворителя, скоростью и временем центрифугирования достигается разделение ЛП на фракции. Разделение ЛП проводится как постепенно, т.е. с отдельным сбором каждой фракции в соответствующем растворе с определенной плотностью и последующим удалением выделенного класса, так и одновременное выделение - путем ультрацен-трйфугирования в 4-х ступенчатом градиенте плотности [104] . Наиболее распространенным анализом ЛП является зональный электрофорез на поддерживающих средах (агар, крахмал, ПААГ) [102]
