Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературных данных 7
І.І.Основньїе методы рептгеїіоструктурного анализа макромолекул .7
1.2. Молекулярное замещение 11
1.2.1. Метод максимального правдоподобия и его применение в задачах молекулярного замещения 16
1.2.1.1. Правдоподобие функции вращения 18
1.2.1.2. Функция правдоподобия для трансляции 20
1.2.1.3. Усиленные функции правдоподобия 21
1.2.1.4. Phaser - программа для решения задач молекулярного замещения методом максимизации правдоподобия 22
1.3 Уточнение структуры макромолекул 25
1.3.1. Проблема переопределенности задачи кристаллографического уточнения 27
1.3.2. Уточнение с ограничениями ("constraints" и "restraints") 29
1.3.3. Достоверность кристаллографического уточнения 31
1.3.4. Критерии оценки качества атомной модели 32
1.3.4.1. Стандартный кристаллографический R-фактор 33
1.3.4.2. Rfree как критерий оценки качества модели в процессе уточнения 34
1.3.5. Улучшение фаз методом модификации плотности с использованием"сотр1е!е cross-validation" 35
1,3.6 Уточнение максимизацией правдоподобия 38
1.3.7. Схемы и программы уточнения 39
1.3.7.1. Программа CNS 41
Глава Экспериментальная часть 43
2.1. Общая характеристика комплекса рибосомного белка L1 с фрагментом мРНК 43
2.2. Получение и кристаллизация комплекса TthLl-мРНК. 44
2.3. Сбор и анализ дифракционных данных , 45
2.4. Решение фазовой проблемы и построение модели 46
2.4.1. Построение стартовой поисковой модели 49
2.4.2. Позиционирование модели в независимой части элементарной ячейки и расчет фаз 51
2.4.3. Построение и уточнение модели 53
Глаеа 3. Результаты и обсуждение. -57-
3.1. Общая характеристика кристаллической структуры комплекса TthLl-мРНК -57-
3.1.1. Структура рибосомного белка TthLl в комплексе TthLl-мРНК 59
3.1.2. Структура 38-нуклеотидного фрагмента мРНК в комплексе TthLl-мРНК 62
3.1.3. РНК-белковые взаимодействия в составе комплекса TthLl-MPHK. 64
3.2. Сравнительный анализ структуры комплекса TthLl-мРНК и известных структур белка L1 в РНК-связанном и свободном состояниях . 67
3.2.1. Сравнение структур белка TthLl в связанном с мРНК и свободном состоянии 68
3.2.2. Сравнение структуры белка L1 из комплекса TthLl-мРНК с известными структурами белка L1 из различных организмов 70
3.2.3. Две конформации белка TthLl. Белок TthLl должен принять открытую конформацию, чтобы связаться с РНК 71
3.2.4. Сравнение регуляторных и рибосомного комплексов 73
Основные результаты и выводы, 79
Список литературы
- Метод максимального правдоподобия и его применение в задачах молекулярного замещения
- Достоверность кристаллографического уточнения
- Сбор и анализ дифракционных данных
- РНК-белковые взаимодействия в составе комплекса TthLl-MPHK.
Введение к работе
Проблема регуляции экспрессии генов является одной из фундаментальных проблем молекулярной биологии. Экспрессия многих генов регулируется на уровне трансляции. Сбалансированный синтез рибосомных белков в бактериях и археях осуществляется именно этим способом [1, 2, 3, 4]. Гены рибосомных белков объединены в опероны и продукт одного из генов может репрессировать свой собственный синтез и синтез белков того же оперона. Белок-регулятор преимущественно встраивается в рибосомную РНК, но при избыточном синтезе он связывается со специфическим участком в молекуле своей мРНК и мешает ее трансляции в рибосоме. Полагают, что для ряда рибосомных белков этот регуляторный связьшающий участок на мРНК структурно подобен соответствующему участку связывания белка-репрессора на рРНК. Сродство белка к рРНК больше, чем к мРНК, что позволяет использовать механизм конкурентного . связывания для регуляции синтеза белков данного оперона.
Исследования, посвященные выявлению деталей механизмов регуляции .« синтеза на уровне трансляции, интенсивно ведутся в течение достаточно длительного времени. Несмотря на то, что накоплен большой объем информации, полученной, в основном, биохимическими и генетическими методами, структурные детали этого механизма пока изучены плохо. Ранее были получены только структуры некоторых рибосомных белков-регуляторов в комплексе с фрагментами рибосомной РНК [9, 10, 11, 16] и в составе структуры рибосомы. Но поскольку конкурентный механизм регуляции синтеза основан на различии в сродстве белка-репрессора к рРНК и мРНК, для выяснения структурных основ регуляции необходимо также получение структуры комплекса этих белков с фрагментами мРНК.
Целью данной работы было получение кристаллической структуры комплекса рибосомного белка L1 из экстремально-термофильной бактерии Thermus (hemophilus со специфически связывающимся 38-нуклеотидньгм фрагментом мРНК из археи Methanococcus vannielii, анализ взаимодействия компонентов комплекса и выявление структурных основ механизма регуляции синтеза этого белка.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Обзор литературы посвящен современным методам кристаллографии макромолекул. Подробно описаны метод молекулярного замещения, который использовался для определения структуры данного комплекса, последние достижения в усовершенствовании этого метода, а таюке вычислительные методы, алгоритмы и программы, использующиеся для уточнения структуры макромолекул.
В экспериментальной части дано описание условий получения кристаллов комплекса TthLl-мРНК и сбора дифракционных данных, подробно описано решение фазовой проблемы, представлены результаты кристаллографического уточнения исследуемой структуры.
В заключительной главе изложены структурные результаты работы. Подробно описаны структуры компонентов комплекса и результаты анализа их взаимодействия. Проведен сравнительный анализ полученной структуры и определенных ранее структур белка L1 в изолированном состоянии и в комплексах с РНК. На основании этого анализа выдвинуто предположение об определяющей роли домена II белка L1 в регуляции экспрессии генов своего оперона.
Метод максимального правдоподобия и его применение в задачах молекулярного замещения
Молекулярное замещение может рассматриваться как задача тестирования гипотез, в которой различные гипотезы об ориентации, позиции и, возможно, качестве поисковой модели тестируются по отношению к экспериментальным данным. Бриконь первый предложил применить правдоподобие в задачах молекулярного замещения [34,35], отметив, что в этом и других кристаллографических контекстах правдоподобие является идеальным критерием для тестирования гипотез.
Принцип метода максимального правдоподобия довольно прост: лучшая модель наилучшим образом соответствует наблюдаемыми экспериментальными данными. Соответствие определяется правдоподобием - вероятностью получения имеющихся экспериментальных данных при предположении, что тестируемая модель отражает реальную картину в кристалле. Если модель изменяется таким образом, что наблюдаемые данные становятся более вероятными, то правдоподобие возрастает, указывая, что эта модель лучше.
Несмотря на простоту принципа максимального правдоподобия, возникают некоторые сложности при выводе подходящего вероятностного распределения, на котором основываются целевые вероятностные функции. Трудности возникают из-за неопределенности: неизвестны фазовые углы или относительные фазовые углы между вкладами от молекул, расположенных в разных асимметричных частях ячейки.
Как и в традиционных методах, при использовании максимального правдоподобия в молекулярном замещении задача может быть разделена на два этапа: поиск функции вращения RF и последующий поиск функции трансляции ТТ. Целевой функцией при этом является статистическое правдоподобие. Правдоподобие для модели рассчитывается на сетке углов (RF), а потом на сетке позиций (TF), и угол или позиция модели, которая имеет наивысшее правдоподобие, выбирается решением задачи молекулярного замещения.
Правдоподобие для отдельного отражения г дифракционной картины (Р-Х rayr) - это вероятность того, что тестируемая модель даст наблюдаемую амплитуду структурного фактора F0 (или интенсивность отражения). Так как модель - в "реальном" пространстве, а наблюдаемые дифракционные данные - в "обратном", то для того чтобы рассчитать правдоподобие, необходимо по модели с использованием формулы (2) рассчитать структурные факторы. Тогда P-X-rayr=F(data; modd)=P(F0;Fc) (4)
Рефлексы предполагаются независимыми (хотя очень слабые корреляции есть, это предположение выполняется очень хорошо) [28], так что правдоподобие для функции вращения P-RF, как и правдоподобие для функции трансляции РF, является произведением правдоподобий отдельных рефлексов. Если число рефлексов R, то R P-RF = Y[P-RFr (5) R PF = Y\PFr г=1 На практике удобнее работагь с суммами, чем с произведениями, поэтому в качестве целевой поисковой функции в молекулярном замещении используется логарифм правдоподобия (log-likelihood) [28,30]. Кроме того, задача максимизации вероятности легко превращается в задачу минимизации при помощи умножения логарифма на "-1": R R -log/ -RF = -log/ -RFr и -logPF - logPF, г=1 г=\
Для анализа результатов используется так же разность логарифмов правдоподобия (log-likelihood-gain или LLG) [31,32]. .Чаще всего, ортогональное преобразование -(х.У.2)-»(х ,y ,z ) f которое ориентирует модель в соответствии с ориентацией реальной структуры в кристаллической ячейке, выражается через углы Эйлера или сферические углы [36, 37]. При тестировании каждой ориентации модель представляет собой структуру с определенной ориентацией, но неопределенной позицией. Неопределешгая позиция в реальном пространстве соответствует неопределенным относительным фазам вкладов от каждой из симметрично связанных молекул в суммарный структурный фактор. Таким образом, Fc (суммарный структурный фактор для всей ячейки), амплитуда которого рассчитывается по формуле (2) и используется в выражении (4) для расчета правдоподобия, не может быть получено из суммы вкладов фазированных структурных факторов. Было предложено использовать в качестве тестируемой гипотезы набор {Fm}sym модулей структурных факторов Fm рассчитанных отдельно для каждой модели, составляющих разные асимметричные части ячейки [30]. Так как относительное положение атомов в модели известно, для расчета Fm можно сложить вклады атомных структурных факторов (Falom) с известными относительными фазами. Этот расчет выполняется в группе Р1 по отдельности для всех моделей, связанных операторами симметрии (т.е. для всех моделей, находящихся в разных асимметричных частях ячейки), для того чтобы получить набор амплитуд {Fm}sym. Тогда правдоподобие функции вращения для отдельного отражения P-RFr=?(data; model)=P(F0; {Fm}s J; (6)
Для генерации функции для этой вероятности было предложено ввести фазу а между наблюдаемым структурным фактором 0 и одним из Fm [30]. Модели, связанные операторами симметрии, имеют различные амплитуды, потому что при вращении модели (а ориентация модели при переходе от одной независимой части ячейки к другой изменяется по отношению к элементарной ячейке) сила рассеяния в любом выбранном направлении изменяется. Было решено для каждого отражения выбрать из набора {Fm}sym тот структурный фактор, который имеет наибольшую амплитуду (). Оператор симметрии, который производит максимальный Fm, будет разным для каждого отражения, так что ./ соответствует различным операторам симметрии для разных отражений. Набор симметрично связанных Fm таким образом разделяется на набор не включающий FbiB, { mbym ig который остается нефазированным, и набор состоящий из Fbig, который дает фазу а соотношения с F0.
Достоверность кристаллографического уточнения
Чтобы иметь возможность сделать предположения и выводы о механизме функционирования исследуемой молекулы, необходима надежная структурная информация об ее пространственном строении. Рентгеновский структурный анализ является на сегодняшний день единственным экспериментальным методом, позволяющим определять атомную структуру как низкомолекулярных соединений, так и больших макромолекулярных комплексов. Но рентгеновский эксперимент часто бывает настолько сложным и требующим больших затрат времени и сил, что его трудно повторить независимым образом другим исследователям. Это накладывает большую ответственность на кристаллографов, работающих в области расшифровки структур макромолекул. В работе [54] Е. Додсон дает подробный обзор и анализ проблем, связанных в первую очередь с необходимостью адекватной оценки правильности и надежности расшифрованных структур, а также выборе эффективных критериев для этой оценки. Если коротко дать определение хорошей модели, то это модель, имеющая разумные во всех смыслах характеристики: - химические: валентные связи и углы имеют приемлемые значения; хиральность имеет правильный знак; ароматические кольца и пептидные звенья плоские; атомы, связанные водородными связями, действительно могут их образовывать. - физические: в модели нет слишком близких контактов; связанные каким-либо образом атомы (н/к симметрией, коваленгаыми или водородными связями) имеют близкие температурные факторы, заряженные группы спрятаны в гидрофобном окружении. - закономерности строения белковых молекул: белок имеет определенную вторичную структуру; распределение торсионных углов qi и f ш карте Рамачандрана [55] не содержит запрещенных конформаций; большинство боковых цепей имеют разрешенные поворотные конформаций; молекулы воды и ионы правильно размещены; большинство (или все) пептидные группы находятся в транс-конфигурации. - статистические: модель наилучшим образом соответствует экспериментальным данным.
На каждом этапе построения, корректировки и уточнения в модель могут быть внесены ошибки. В работах [56,57] проведена классификация возможных ошибок кристаллографических моделей: полностью неправильная модель или субъединица, в которой вся или существенная часть главной цепи проведена неверно; частично неверный ход главной цепи, обычно из-за ошибок при соединении элементов вторичной структуры; локальные ошибки из-за неаккуратного построения модели либо из-за недостаточности данных; неверная конформация боковой цепи; неправильная ориентация пептида.
В статье Г.Клейвета и Т.Джонса [57] приводится целый список примеров структур с перечисленными ошибками, взятых из PDB-банка. Одной из наиболее частых ошибок является переизбыток параметров модели. Если при уточнении используется гораздо больше параметров, чем это оправдано имеющимся набором экспериментальных данных и другой дополнительной информацией, то кристаллографический R-фактор можно снизить почти до произвольной величины, не улучшив при этом качества модели. Например, этого можно достичь, проводя уточнение молекул, связанных н/к симметрией, без ограничений; уточняя индивидуальные температурные факторы на низком разрешении; уточняя коэффициенты заполнения и альтернативные конформации на среднем и низком разрешении.
Критерии оценки качества атомной модели. В работах [54, 57, 58, 59] проанализированы наиболее широко используемые подходы и дается сравнение эффективности разнообразных критериев, применяемых в настоящее время для обнаружения ошибок и оценки качества моделей макромолекул. 1.3.4.1. Стандартный кристаллографический R-фактор
При оценке общего качества структуры общеупотребимыми показателями являются кристаллографический й-фактор и разрешение, й-фактор определяется как Y}F0{h)-Fc{h)\ Л-Л І 0(Л) (із) h где R - стандартный кристаллографический ії-фактор, F0 - экспериментальные значения амплитуд структурных факторов, Fc - рассчитанные но модели амплитуды структурных факторов, h - здесь, обозначение индексов Миллера.
Чем выше разрешение набора экспериментальных данных, тем выше считается точность определения структуры. Но для R нет однозначной зависимости между его величиной и надежностью структуры: низкое значение R само по себе является необходимым, но не достаточным условием точности модели. Карта распределения электронной плотности позволяет визуально оценить, насколько хорошо атомная модель согласуется с экспериментом. На основе этого можно получить и количественные характеристики отдельных частей. Например, критерий, предложенный Т.Джонсом и др. [53], измеряет соответствие между картой распределения электронной плотности и атомной моделью. Для каждого остатка все атомы или их некоторое подмножество преобразуются в карту путем задания каждого атома в виде гауссовой функции распределения электронной плотности с заданным температурным фактором. Затем модельная карта сравнивается с экспериментальной по совокупности точек сетки в окрестности исследуемых атомов. Величина рассчитанного таким образом й-фактора изменяется от 0.0 (при идеальном совпадении) до 1.0 и обычно бывает около 0.25 для правильной структуры, но может достигать и 0.5 для подвижных боковых цепей, контактирующих с растворителем. Структура с ошибочной укладкой характеризуется высоким значением й-фактора для большинства остатков.
Сбор и анализ дифракционных данных
Рибосомный белок L1 - один из самых больших рибосомных белков. Его молекулярный вес - около 25 кДа. Независимо и специфически взаимодействуя со спиралями 76-78 23S рибосомной РНК [91, 92], он составляет часть бокового выступа большой субчастицы рибосомы - так называемого L1-протуберанца. Этот подвижный выступ рибосомы [93], предположительно, является частью механизма, который высвобождает деацелированную транспортную РНК из рибосомы в процессе трансляции [94, 95].
Известно, что в бактериях и археях белок L1 выступает также в роли белка-регулятора [1, 2]. Так, в Е. coli этот белок регулирует собственный синтез и синтез белка L11, а в археях, кроме того, синтез белков L10 и L12. Гены этих белков находятся в одном опероне с геном белка L1. Если количество белка L1 в клетке превышает количество свободной рибосомной 23 S рРНК, белок связывается со специфическим участком в молекуле своей полицистроннои мРНК, препятствует ее связыванию с малой субчастицей рибосомы и таким образом ограничивает синтез белков своего оперона. При этом белок имеет примерно на порядок большее сродство к рРНК по сравнению с мРНК, хотя участки обеих РНК, ответственные за связывание, очень близки по нуклеотидной последовательности. Поэтому, как только в клетке появляется свободная 23S рРНК, белок покидает мРНК, связывается с рРНК, и синтез возобновляется. Так с использованием механизма конкуренции осуществляется обратная связь между количеством белка L1 в клетке и скоростью его синтеза рибосомой.
Гомологи белка L1 существуют в организмах из бактерий, архей и эукариот. Причем, было ранее показано, что бактериальные и архейные белки L1 функционально взаимозаменяемы как в рибосоме, так и при репрессии трансляции [96, 97]. Это указывает на то, что РНК-связывающий участок на белке и белок-связывающий участок на РНК структурно консервативны. Более того, возможно структурное исследование гибридных комплексов (компоненты комплекса взяты из разных организмов), так как иногда они обладают большей способностью кристаллизоваться [9,16], чем гомологичные комплексы (компоненты комплекса - из одного организма). В данной работе представлена структура гибридного комплекса рибосомного белка L1 из экстремально термофильной бактерии Thermits (hemophilus с 38-нуклеотидным специфичным фрагментом мРНК из археи Methanococcus vannielii.
Все работы по выделению и очистке компонентов комплекса TthLl-мРНК, а также по кристаллизации были выполнены СВ. Тищенко и Е.Ю. Никоновой -сотрудниками лаборатории структурных исследований аппарата трансляции Института белка РАН. Для получения кристаллов комплекса Ll-мРНК, пригодных для рентгеноструктурного анализа, был сконструирован фрагмент мРНК представленный на рисунке 2. Этот фрагмент содержит часть регуляторного L1-связывающего сайта на мРНКп из М, vannielii, которая включает область, строго консервативную в 23S рРНК и мРНК, и две спирали, участвующие в образовании контакта в рибосомном РНК-белковом комплексе. В комплексе использовались белки L1 из термофильной бактерии Т. thermophilus (TthLl) с заменами метиошшов на селенометионины. Необходимость этих замен была вызвана высокой междоменной подвижностью белка TthLl, что является значительньш препятствием для использования метода молекулярного замещения. Поэтому в случае невозможности решения структуры этим методом планировалось определить фазы методом многоволнового аномального рассеяния.
Оптимальная концентрация мРНК для кристаллизации была 5-7 мг/мл. Ренатурация мРНК проводилась при 60С в течении 10 минут в 1мМ Na-цитратном буфере с последующим охлаждением до 0С. Фрагмент мРНК и белок смешивались в эквимолярньгх количествах. Концентрация MgCb. в комплексе в среднем составляла 1.5 мМ. Образование комплексов оценивали методом гель-электрофореза нуклеиновых кислот в полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях. Кристаллизация велась методом диффузии паров в висячей капле при 4С. Кристаллизационная капля была приготовлена смешиванием 5мкл комплекса TthLl-мРНК с 1мкл трехпроцентного осадителя полиэтиленгликоля Ют в 50 мМ какодилата Na (рН 6.0), 200 мМ КС1, ЮмМ MgCl2, после чего были добавлены 1мкл 1мМ HgCb. (или 0.5 мМ мерсалила Na) и 1мкл пятипроцентного глицерина. Кристаллы появлялись через три дня.
Предварительное тестирование кристаллов проводилось на лабораторной рентгеновской установке в группе структурных исследований рибосомных белков Института Белка РАН. Набор дифракционных данных, использовавшийся для определения кристаллической структуры, был собран А.Д. Никулиным методом вращения на синхротроне в Гамбурге (линия BW6 станции DESY, Гамбург, Германия) с одного кристалла, замороженного в криорастворе при температуре 100К. Обработка экспериментальных данных и все дальнейшие операции по определению, уточнению и анализу структуры комплекса были выполнены автором настоящей диссертации. Данные были обработаны программой XDS [98]. Использование этой программы диктовалось характером полученного дифракционного набора, поскольку комплекс XDS обладает рядом преимуществ перед другими программными комплексами при обработке дифракционных пятен низкой интенсивности. В таблице 1 приведена статистика полученного набора данных.
РНК-белковые взаимодействия в составе комплекса TthLl-MPHK.
Анализ кристаллической структуры изолированного белка TthLl показал, что в свободном состоянии белок L1 находится в закрытой конформации, при которой домены белка сближены настолько, что кластеры консервативных аминокислотных остатков (потенциальные области связывания с РНК [5,6,7]) оказались недоступными для взаимодействия с РНК. В мутантном белке TthLl с заменой Serl79Cys произошло смещение доменов, в результате чего структура белка приоткрылась подобно раковине моллюска примерно на 7 [8]. Однако, торсионные углы остатков, располагающихся на междоменной перетяжке, в результате этого поворота почти не изменились, а кластеры консервативных остатков по-прежнему остались недоступными для взаимодействия с РНК. Поэтому эту структуру можно рассматривать как вариант закрытой конформации. Следует отметить, что область междоменного контакта у TthLl необычно мала и занимает лишь примерно 4% от общей поверхности каждого из доменов; В других белках аналогичного размера во взаимодействия между доменами вовлекается от 18 до 29% их поверхности [103]. Поскольку контакты между доменами слабы, а их количество мало, принципиально они не мешают междоменной подвижности и раскрыванию молекулы белка, что и было показано на структуре мутантного белка TthLl. На основе этих наблюдений было сделано предположение, что связывание белка TthLl с РНК может происходить только в том случае, когда белок находится в открытой конформации, при которой кластеры консервативных остатков доступны для молекул РНК [6]. Полученная структура комплекса TthLl-мРНК показала, что, действительно, белок TthLl принимает открытую конформацию при образовании комплекса с мРНК. Более того, четыре копии белка TthLl в кристалле комплекса TthLl-мРНК демонстрируют существование немного отличающихся версий открытой конформации.
В отличие от TthLl кристаллические структуры изолированных архейных белков MjaLl и MthLl, демонстрируют открытую конформацию [6,7]. Эта конформация подобна той, которую белок имеет в комплексе MjaLl-мРНК [12]. В этом случае контакт между доменами отсутствует, и потенциальные области связывания на поверхности белка оказываются доступными для молекул РНК. Это означает, что несвязанные архейные белки уже готовы к взаимодействию с РНК, а изолированный белок TthLI должен сначала сделать переход из неактивной закрытой конформации в активную, прежде чем он сможет связаться с РНК. Скорее всего, конформация белков L1 в несвязанном состоянии флуктуирует между открытой и закрытой формами, которые находятся в статистическом равновесии. Разница между архейными белками и белком TthLI - в вероятности быть в той или другой конформации. Для MjaLl и MthLl наиболее вероятна открытая конформация, для TthLI - закрытая. Эти предположения хорошо согласуются с данньши по кинетике связывания РНК архейными и бактериальными белками L1 [13]. Эти данные были получены методом поверхностного резонанса плазмонов [104]. По этим данным, скорость ассоциации бежа TthLI с РНК больше чем на порядок меньше скорости ассоциации архейного белка MthLl.
Ранее была определена структура архейного регуляторного комплекса MjaLI-мРНК с разрешением 3.4А [12]. Разрешение модели не позволило провести удовлетворительный анализ РНК-белковых взаимодействий в этом комплексе, но общие черты взаимодействия были все-таки выявлены. В обоих известных на данный момент регуляторных комплексах Ll-мРНК контакт белка с мРНК осуществляется, в основном, посредством аминокислотных остатков первого домена. В рибосомном же комплексе SacLl-pPHK во взаимодействии с рРНК участвуют оба домена белка [9]. В комплексе MjaLI-мРНК второй домен также вовлечен во взаимодействие с мРНК, но число контактов существенно меньше, чем в рибосомном комплексе. В комплексе TthLl-мРНК только один остаток второго домена, Argl34, контактирует с мРНК, причем это имеет место только в двух копиях комплекса, в которых раскрытие междоменной области меньше чем в других двух копиях. Различие в количестве контактов между мРНК и вторым доменом белка в регуляторных комплексах TthLl-мРНК и MjaLI-мРНК связано с тем, что во втором домене архейного белка MjaLl есть дополнительная спираль (а4) которая отсутствует в бактериальном белке TthLl. Остатки именно этой спирали участвуют во взаимодействии с мРНК.
Существенная разница в количестве контактов второго домена белка L1 с РНК в регуляторных и рибосомном комплексах связана с отсутствием структурного участка из двух петель в молекуле мРНК (рисунки. 15(a) и 15(b)). В рибосомной РНК два нерегулярных участка рРНК (петли А и В) взаимодействуют друг с другом, и контакт второго домена с рРНК в рибосомном комплексе осуществляется как раз с этим сложным структурным участком. В мРНК же один из этих участков отсутствует, а второй сильно укорочен. Следует отметить, что взаимодействие второго домена с рРНК осуществляется остатками кластера строго консервативных остатков. Несмотря на указанные отличия в обеих РНК имеются длинная и короткая спирали, которые практически перпендикулярны друг другу и содержат инвариантный уникальный участок в месте сочленения этих спиралей. Нуклеотиды, образующие этот структурно инвариантный участок, выделены красным цветом на рисунке 15(a), желтым - на рисунке 15(b), а на рисунке!5(с) представлено наложение этого участка из структур рРНК и мРНК.
