Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Каталитические А-субъединицы белков, инактивирующих рибосому. 7
Структура и ферментативная активность А-субъединицы рицина 7
Моделирование ингибирования каталитической активности А-субъединицы 14
Структура и ферментативная активность А-субъединицы абрина 20
Структура и ферментативная активность А-субъединицы эбулина 21
Рибосом-инактивирующие белки первого типа 22
Антивирусный белок лаконоса (PAP). 23
Трихосантин 27
Бриодин 33
Сапорин 33
1.2. Траспортная В-субъединица рибосом-инактивирующиех белков второго типа 37
Структура и углевод-связывающая активность В-субъединицы рицина 3 8
Структура и углевод-связывающая активность В-субъединицы абрина 41 1.2.3 Структура и углевод-связывающая активность В-субъединицы эбулина 41
1.3. Особенности внутриклеточного транспорта рибосом- инактивирующих
белков второго типа. Роль структурных особенностей данных белков при транспорте
внутри клетки 43
1.3.1 Интернетизация токсина 43
Транспорт в эндосомальном компартменте 43
Транспорт в аппарат Гольджи 44
Ретроградный транспорт в эндоплазматический ретикулум. 44
Транслокация токсина 45 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 47
Выделение и очистка агглютинина 47
Кристаллизация агглютинина в комплексе с jS-D-галактозой 47
2.3. Сбор дифракционных данных с кристаллов агглютинина
Выделение вискумина из Viscum album
Кристаллизация вискумина и его комплексов
Сбор дифракционных данных с кристаллов вискумина и его комплексов ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Решение проблемы фаз для агглютинина
Определение и уточнение структуры агглютинина
Укладка полипептидной цепи агглютинина
Структура А-субъединицы агглютинина
3.5 Активный центр А-субъединицы агглютинина 3.6. Структура В-субъединицы агглютинина
Первый галактозо-связывающий центр агглютинина
Второй галактозо-связывающий центр агглютинина 3.9. Межсубъединичные контакты агглютинина
Решение проблемы фаз для вискумина
Определение и уточнение структуры вискумина и его комплексов
Структура А-субъединицы вискумина
Активный центр А-субъединицы вискумина
Структура В-субъединицы вискумина
Первый галактозо - связывающий центр вискумина
Второй галактозо - связывающий центр вискумина
Взаимодействие рибосом-инактивирующих белков с сарцин-рициновой рибосомы
Четвертичная структура агглютинина и вискумина. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
*
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
АО. - аминокислотный остаток
АГ - аппарат Гольджи
ЛД50 - молярная концентрация ферментативной субъединицы в
составе цитотоксического агента, при которой наблюдается
гибель 50% клеток
КИ50 - молярная концентрация цитотоксического агента, при которой
-у
наблюдается 50% ингибирование включения в клетки [ Н]
тимидина или [' С]лейцина
< РИБ - рибосом-инактивирующие белки
РИБ-І - рибосом-инактивирующие-белки первого типа, содержащие
одну субъединицу
РИБ-П - рибосом-инактивирующие белки второго типа, содержащие две
субъединицы
ЭПР - эндоплазматический ретикулум
МЫ - вискумин - mistletoe lectin I токсин из омелы I
MLII - mistletoe lectin II, токсин из омелы II
MLIII - mistletoe lectin III, токсин из омелы III
MLA - А-субъединица вискумина
MLB - В-субъединица вискумина
Ф RTA - А-субъединица рицина
RTB - В-субъединица рицина
S06 -сапорин
,>
Введение к работе
Одним из наиболее важных направлений развития новых биотехнологий является создание фармакологических препаратов, обладающих высокой специфичностью действия на клетки или молекулы-мишени в организме. В настоящее время именно белки или их конъюгаты привлекают особый интерес исследователей при конструировании высокоселективных лекарств. Активно изучаются с этой точки зрения растительные токсины, которые полностью останавливают синтез белка в клетке, переводя рибосомы в неактивное состояние. Эти токсины носят общее название рибосом-инактивирующих белков (РИБ).
Рибосом-инактивирующие белки разделяются на два типа: РИБ-І, которые состоят только из одной каталитической (active, А), субъединицы и РИБ-П, которые содержат как каталитическую (А), так и связывающую (binding, В) субъединицы [Barbieri et al., 1993]. А-субъединица обеспечивает инактивацию рибосомы, связываясь со специфическим участком (сарцин-рициновой петлей) 28S рРНК рибосомы эукариот и выщепляя аденин. Поскольку модифицированная таким образом рибосома теряет сродство к фактору элонгации транскрипции, это приводит к остановке синтеза белка клеткой и в результате к гибели клетки [Lord et al., 1991]. В-субъединица, являясь лектином, связывается с гликозилированными рецепторами на поверхности клетки и обеспечивает проникновение токсина в клетку. Высокая цитотоксическая активность РИБ-П является основной причиной использования их для создания иммуннотоксинов - лекарств нового поколения, главным образом противоопухолевого действия.
Помимо цитотоксических свойств белки этой группы проявляют в различной степени способность агглютинировать клетки за счет своей лектиновой активности. Кроме того, некоторые из них обладают и иммуномодулирующими свойствами.
Аминокислотные остатки, входящие в каталитический центр А-субъединиц, являются консервативными среди данного семейства; во многом сходно и
строение углевод-связывающих центров В-субъединиц. Однако, эффективность цитотоксического действия различных белков этого класса существенно различается. Сравнительный анализ структурных и функциональных свойств родственных рибосом-инактивирующих белков - один из эффективных подходов к выяснению механизмов, определяющих различия в их биологической активности. Понимание структурных особенностей, влияющих на цитотоксическую активность данных белков, необходимо также для получения эффективных препаратов иммунотоксинов на их основе.
Целью данной работы является определение пространственных структур тетрамерных рибосом-инактивирующих белков второго типа - вискумина (ML-I) из Viscum Album и агглютинина из Ricinus communis - и выявление структурных особенностей, влияющих на биологическую активность данных белков.
