Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. Роль митохондрий в апоптозе 7
1.2. БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА BCL-2 11
Антиапоптозные белки 14
Проапотозные белки 15
1.3.BNIP3 17
Смерть клеток при ишемии сердца 18
Современное представление о структуре BNIP3 20
Функция BNIP3 22
1.4. Исследование мембранных белков методом спектроскопии ЯМР. 23
Выделение мембранных белков 24
Выбор окружения моделирующего мембрану 25
Заключение 28
ЧАСТЬ II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 30
2.1. Выделение BNIP3 30
2.2. Приготовление образца 30
2.3. Спектроскопия ЯМР... 31
2.4. Расчет пространственной структуры 35
2.5. МД-релаксация 37
ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 42
3.1. Экспериментальные данные для расчета структуры ТМ BNIP3 42
3.2. Отнесение сигналов в спектрах ЯМР 43
3.3. Элементы вторичной структуры 50
3.4. Расчет пространственной структуры 53
3.5. Минимизация конформационнои энергии экспериментальной структуры 58
3.6. Димеризационный интерфейс BNIP3 ТМ 61
3.7. Взаимодействие BNIP3 ТМ с водой 66
3.8. Связь структурно-динамических свойств BNIP3 ТМ и проапоптозной функции БЕЛКА 68
3.9. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 70
ВЫВОДЫ 72
БЛАГОДАРНОСТИ 73
ПРИЛОЖЕНИЕ 74
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ 79
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Введение к работе
Актуальность темы
Генетически запрограммированная смерть клеток необходима для нормального развития и жизнедеятельности любого многоклеточного организма. Физиологические механизмы клеточной смерти, запускающиеся в ответ на внеклеточный сигнал, предназначены для удаления зараженных, мутировавших, поврежденных или ненужных клеток [1], а также реконструирования тканей в организме. Нарушение механизма программируемой клеточной смерти (ПКС) может стать причиной серьезных заболеваний. Например, неспособность организма избавиться от поврежденных клеток приводит к раку [2] или аутоиммунным заболеваниям [3], тогда как смерть обычно долгоживущих клеток может стать причиной нейродегенеративного заболевания [4]. Таким образом, исследование механизмов ПКС имеет большое значение, как для молекулярной биологии, так и для клинической медицины.
Наиболее часто встречающийся механизм запрограммированной клеточной смерти - апоптоз. Этот процесс сопровождается рядом специфических морфологических и биохимических изменений в клетке, таких как конденсация и маргинация ядерного хроматина, фрагментация ядра, конденсация и образование выпячиваний цитоплазмы. В результате образуются апоптозные тельца, небольшие клеточные фрагменты, окруженные мембраной. Уничтожение клетки завершается фагоцитозом апоптозных телец макрофагами или их аутолизом.
Медиатором сигнала смерти служит обособленная группа цистеиновых протеаз, часто называемых каспазами. В живых клетках каспазы находятся в цитозоли в неактивной форме предшественника - прокаспазы. Можно выделить два типа каспаз - индукторы и эффекторы. В процессе апоптоза индукторы (например, каспаза-9), принимают апоптатический сигнал и передают его на эффекторные каспазы (например, каспаза-3), которые непосредственно гидролизуют структурные белки клетки. Среди мишеней каспаз: цитоплазматические и ядерные белки, ферменты репарации и репликации, регуляторные белки, ингибиторы эндонуклеаз. Каспазы присутствуют во всех живых клетках, что позволяет быстро индуцировать апоптоз. Хотя надо заметить, что возможен и каспазо-независимый путь апоптоза. В этом случае смерть клетки происходит в результате нарушения функционирования клеточных органелл, чаще всего митохондрий, и сопровождается высвобождением активных форм кислорода (ROS) и возрастанием мембранного потенциала в митохондриях.
Важную роль в процессе программируемой клеточной смерти играют белки семейства BCL-2 - регуляторы активации каспаз и апоптоза. Несмотря на принадлежность к одному семейству, основанную на определенной гомологичности, представители этого семейства мембранных белков обладают широким спектром свойств. Они могут, как вызывать клеточную смерть в ответ на определенный сигнал или стрессовые условия, так и препятствовать ей.
Цель исследования
Объектом исследования данной диссертационной работы является трансмембранный домен человеческого белка BNIP3. Этот белок относится к группе проапоптозных белков "ВНЗ-only" семейства BCL-2 на основании анализа его первичной структуры. Однако, BNIP3 и его ближайшие гомологи обладают рядом уникальных особенностей. Хотя, как и другие "ВНЗ-only" белки они обладают узкой специфичностью к условиям, вызывающим их экспрессию и активацию, механизм их действия отличается от других представителей BCL-2. Клеточная смерть, вызванная BNIP3, происходит без участия каспаз и имеет несколько признаков некроза. Как и многие другие проапоптозные белки BNIP3 может образовывать гетеродимер с антиапоптозными представителями семейства BCL-2. Однако, в отличие от других "ВНЗ-only" белков ассоциация происходит без участия ВНЗ домена, а за счет взаимодействия трансмембранных сегментов. В работе [5] было показано, что посредством трансмембранного домена BNIP3 может образовывать стабильный гомодимер как в мицеллах SDS, так и в мембранах Е. Coli. Поэтому BNIP3 ТМ представляет особый интерес с точки зрения исследования механизма взаимодействия трансмембранных а-спиралей.
Научная новизна и практическая значимость работы
Все результаты, изложенные в данной диссертационной работе, получены впервые.
На сегодняшний день опубликована только одна пространственная структура высокого разрешения димера трансмембранных а-спиралей (трансмембранный домен белка гликофорин А, 1998, [6]). В представленной диссертационной работе методом гетероядерной спектроскопии ЯМР исследован трансмембранный домен белка BNIP3 в комплексе с липидной бицеллой. Показано, трансмембранные а-спирали BNIP3 пересекаются под углом -40 (правая закрутка) и образуют параллельный симметричный димер.
Разработана методика МД-релаксации полученных методом спектроскопии ЯМР пространственных структур трансмембранных сегментов. Она позволяет обойти ряд экспериментальных ограничений, накладываемых мембранной природой объекта исследования. Методом МД рассчитывается молекулярно-динамическая траектория для полученной экспериментально ЯМР-структуры трансмембранного домена, которая помещается в явно заданный липидный бислой, при этом на протяжении всего расчета на протоны белка накладываются экспериментальные пространственные ограничения. Такой комплексный подход позволяет достоверно описать пространственную структуру и внутреннюю динамику трансмембранных белков в липидном окружении.
Полученные в данной работе результаты ЯМР-экспериментов и молекулярного моделирования позволяют сделать предположение о роли BNIP3 ТМ в качестве ионного (протонного) канала в механизме проапоптозной активности белка.
Работа выполнена в группе ЯМР лаборатории структурной биологии института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.
Роль митохондрий в апоптозе
Митохондрии - одни из важнейших органелл, они отвечают за энергетический метаболизм клетки и гомеостазис Са2+ [7], поэтому неудивительно, что нарушение функционирования митохондрий приводит к клеточной смерти, из-за недостатка АТФ и дисбаланса Са2+ [8]. Однако, даже нормально функционирующая митохондрия может стать причиной гибели клетки, так как является одной из ключевых фигур в процессе апоптоза. В многоклеточных организмах митохондрии получают апоптотический сигнал и запускают ряд процессов, которые могут, как вызывать, так и ингибировать смерь клетки. Под действием некоторых факторов (например, радиации) возможно прекращение транспорта электронов через мембрану митохондрии, что в свою очередь приводит к снижению производства АТФ. Апоптоз является энергоемким процессом, и энергетический коллапс наблюдается в основном на поздних его стадиях. Другим последствием нарушения транспорта электронов является возрастание производства активных форм кислорода (АФК).
Основная же роль митохондрии в процессе апоптоза связана с высвобождением из межмембрашюго матрикса растворимых белков, активаторов каспаз (например, цитохром С, AIF (apoptosis inducing factor), прокоспазы 2, 3, 9 и Smac/DIABLO). Регуляторами этого процесса являются белки семейства BCL-2 [9], например белок Вс1-2 находится во внешней мембране митохондрии и препятствует выходу цитохрома С.
Цитохром С - белок, участвующий в цепи переноса электронов через мембрану митохондрии, он также является наиболее изученным активатором каспаз. Растворенный в цитозоли цитохром
Приготовление образца
Все спектры ЯМР были получены на спектрометре UNITY 600 (Varian) с рабочей частотой на протонах 600 МГц. Исследования ТМ BNIP3 методом спектроскопии ЯМР было осложнено наличием интенсивных сигналов в алифатической области от не дейтерированых липидов. Поэтому эксперименты проводили на изотопно меченых образцах, чтобы селективно выделить сигналы ЯМР пептида с помощью гетероядерных фильтров. В работе использовались стандартные импульсные последовательности гетероядерных ЯМР-экспериментов [78,79]. Фурье преобразование спектров ЯМР проводилось с помощью программы VNMR (стандартное программное обеспечение Varian) с использованием линейного предсказания по непрямым направлениям для увеличения разрешения и SS-фильтра для вычитания остаточного сигнала растворителя.
Для отнесения ,5N ядер и амидных протонов был накоплен двухмерный 15N-HSQC спектр со спектральной шириной 8 кГц 1.5 кГц (2048 256 комплексных точек)1. Из-за небольшого времени накопления ( 20-40 минут)
Здесь и далее указывается конечное число точек в преобразованном спектре. эта импульсная последовательность использовалась для контроля стабильности образца, наблюдения рН-зависимостей и подбора условий. Так перед началом работы был поставлен ряд двухмерных l5N-HSQC экспериментов при разных значениях рН и температуры. При окончательном выборе условий учитывалось не только качество получаемых спектров, но и то, насколько они соответствуют физиологическим для данного объекта.
Элементы вторичной структуры
Без предварительных расчетов вторичную структуру белка можно определить исходя из анализа системы контактов ЯЭО (рис. Ш.5.), полученных из экспериментов NOESY-HSQC, констант спин-спинового взаимодействия JHNCOIII И скоростей обмена амидных протонов с растворителем. Так, участки полипептидной цепи с малыми значениями КССВ {JHNCOH 6 Гц), для которых наблюдаются интенсивные кросс-пики ЯЭО NH(/)/NH(/+7) и менее интенсивные время полуобмена амидного протона на дейтерий растворителя. обозначены остатки с Тід 2 часов, - с 1 Т\п 2, для остальных остатков время полуобмена амидного протона на дейтерий было меньше часа. (2) Гомоядерные константы спин-спинового взаимодействия 3JHNCUH: - КССВ 5 Гц, Y- 5-6 Гц, А -КССВ 6 Гц. (3) Последовательные и среднего диапазона контакты ЯЭО, характеризующие вторичную структуру BNIP3 ТМ. Контакты обозначены как сілв(і j) и соответствуют интенсивностям кросс-пиков ЯЭО между протонами А и В остатков і и j. N, а и р обозначают протоны NH, СаН и СрН соответственно. Более толстые линии соответствуют более интенсивным кросс-пикам в спектрах 15N-NOESY-HSQC или 13С-NOESY-HSQC с тт =50 мс. Из карты d-связей (рис. III.5) видно, что помимо трансмембранного сегмента, а-спиральная структура возможна и в концевых участках..
Сравнение химических сдвигов СаН-протонов BNIP3 ТМ с табличными значениями для соответствующих аминокислотных остатков в конформации "клубок".
Отличия химических сдвигов каждого аминокислотного остатка от табличного значения для данного остатка в конформации «неупорядоченный клубок» также характеризует тип вторичной структуры полипептидной цепи [98]. Так называемый вторичный химический сдвиг, Д8=ббЄЛОК-8-кл .б0к"ї для протонов СаН как правило имеет положительно значение для аминокислотного остатка в развернутом участке полипептидной цепи (Р-тяж) и отрицательное - в спиральной конформации. На рисунке III. 6. представлены значения вторичного химического сдвига для трансмембранного домена BNIP3. Из рисунка следует, что пептид, за исключением N-концевой части, имеет конформацию спирали. Положительные значения вторичного химического сдвига остатков трансмембранного региона можно объяснить особенностями их пространственного окружения. Так Vail 64 находится на N-конце трансмембранного домена, где очень вероятен изгиб спирали. Химический сдвиг сигнала СаН Leu 169 сильно сдвинут в слабое поле, это возможно если учесть, что он пространственно сближен с ароматическими остатками -Phel65 и His 173, находящимися через виток (4 аминокислотных остатка) а-спирали. Glyl 80 тоже имеет нетипичные химические сдвиги сигналов а-протонов, вероятно, из-за того, что он входит в димеризационный мотив.
Изложенные выше предположения о вторичной структуре пептида полностью совпадают с данными, полученными из экспериментов по измерению скорости обмена амидных протонов на дейтерий растворителя и оценки констант спин-спинового взаимодействия 3JHNCaii (рис. III.5, приложение: табл. IV.2).
Данные l5N релаксации также позволяют сделать предположения о вторичной структуре BNIP3 ТМ. Значения l5N{ H} NOE, l5N Ть Т2 и TR довольно сильно зависят от расположения остатка в аминокислотной последовательности (рис. III.7). Так участку Leul66-Glyl84 соответствуют наибольшие положительные значения 15N{ H} NOE, что говорит о его ограниченной подвижности. Таким образом, можно предположить, что именно этот участок является стабильной трансмембранной а-спиралью. К концам этой а-спирали примыкают более подвижные участки (остатки 159 165 и 185-187), которые судя по всему находятся на границе бицелла-вода. С другой стороны низкие значения l5N{lH} NOE и малые TR для участков Argl46-Serl58 и Thrl88-Serl90 говорят о свободной подвижности, а следовательно, их экспонировании в раствор. По полученным данным для димера BNIP3 ТМ было рассчитано обобщенное время вращательной корреляции т0, которое составило примерно 18 не. Исходя из эмпирической зависимости [99] для этого значения т0 эффективная масса комплекса белок-бицелла составила 50 кДа, что соответствует сумме масс димера белка ( 10кДа) и бицеллы DMPC/DHPC, состоящей из 80 молекул липидов ( 40 кДа).
Высокое значение I5N{ H} NOE говорит о практически отсутствующей подвижности BNIP3 ТМ относительно бицеллы, что, как уже не раз упоминалось, является одной из причин значительного уширения сигналов от остатков трансмембранного региона.
