Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1. Исследование структуры мембранных белков. Мембрано-моделирующие среды 10
1.1. Общие сведения о мембранных белках 10
1.2. Метод ЯМР и его применение к мембранным белкам 12
1.3. Свойства различных типов мембранных миметиков . 19
2. Липид-белковые нанодиски 28
2.1. Липопротеины плазмы крови млекопитающих . 28
2.2. Структура и свойства ЛБН 31
2.3. Использование ЛБН для солюбилизации мембранных белков и пептидов 33
2.4. ЛБН в ЯМР-спектроскопии высокого разрешения . 35
3. Потенциал-зависимые ионные каналы 37
3.1. Общая схема строения катионных каналов 38
3.2. Классификация каналов 41
3.3. Принципы потенциал-зависимой активации 49
Глава 2. Материалы и методы 59
1. Получение объектов исследования и реактивы 59
1.1. Получение Антиамебина I 59
1.2. Наработка и выделение ВСД-KvAP 59
1.3. Реактивы 60
1.4. Получение ЛБН в комплексе с ВСД-KvAP и ААМ I . 60 2. Экспериментальные методики 61
2.1. Подбор условий для структурных ЯМР-исследований ВСД-KvAP .' 61
2.2. Исследование ААМ I и ВСД-KvAP в комплексе с ЛБН 62
2.3. Анализ размера частиц 63
2.4. Структурные исследования ВСД-KvAP 66
2.5. Определение динамических характеристик ВСД-KvAP 67
2.6. Расчет химических сдвигов 69
Глава 3. Результаты и обсуждение 70
1. Подбор мембраномоделирующей среды 70
2. ЛБН в качестве мембраномоделирующей среды 75
2.1. Исследование AAM-I в комплексе с ЛБН методом ЯМР 76
2.2. ЯМР-исследование ВСД-KvAP в комплексе с ЛБН . 79
3. Структура ВСД-KVAPB мицеллах 81
3.1. Отнесение сигналов 81
3.2. Вторичная структура ВСД-KvAP в мицеллах 83
3.3. Данные о пространственной структуре ВСД-KvAP . 86
3.4. Расчет химических сдвигов 89
3.5. Выводы о структуре ВСД-KvAP в мицеллах ДФХ/ЛДАО 90
4. Внутримолекулярная динамика ВСД-KvAP в мицеллах ДФХ/ЛДАО 91
Заключение 95
Выводы 97
Благодарности 98
Список сокращений 99
Литература
- Метод ЯМР и его применение к мембранным белкам
- Использование ЛБН для солюбилизации мембранных белков и пептидов
- Наработка и выделение ВСД-KvAP
- Исследование AAM-I в комплексе с ЛБН методом ЯМР
Введение к работе
Актуальность темы. Исследование строения и функций мембранных белков — одна из наиболее актуальных задач современной биофизики. Важным классом мембранных белков являются потенциал-зависимые ка-тионные (К+, Na+, Са2+) каналы. Они участвуют во многих жизненно-важных клеточных процессах, включая регуляцию осмотического баланса, возбудимость мембран, передачу нервного импульса [1], и присутствуют в клетках практически всех организмов — от бактерий и архей до человека [2]. Ключевым структурным элементом в механизме действия потенциал-зависимых каналов являются их вольт-сенсорные домены (ВСД), которые отвечают за потенциал-зависимую активацию, реагируя на изменения трансмембранного потенциала конформационными перестройками [3,4].
Изучение структуры катионных каналов и их ВСД интересно по ряду причин. Во-первых, это может помочь в понимании общих принципов протекания потенциал-чувствительных процессов в клетке [4]. Так, структуры, гомологичные ВСД катионных каналов, были обнаружены в белках с принципиально отличной функцией и строением. В частности, потенциал-зависимые протонные каналы млекопитающих функционируют в виде димера субъединиц, имеющих строение, схожее с ВСД [5]. Потенциал-зависимая фосфатаза, обнаруженная у асцидий, имеет ВСД, ковалентно связанный с цитоплазматическим ферментативным доменом [6]. Во-вторых, знание структуры ВСД необходимо для исследований, направленных на создание новых лекарственных препаратов. Известно, что мутации в генах К+, Na+, Са2+ каналов являются причиной некоторых наследственных заболеваний человека [7]. ВСД ионных каналов являются мишенью для различных токсинов животного и растительного происхождения, блокирующих потенциал-зависимую активацию [8]. Это открывает перспективы создания новых лекарственных средств, действие которых направлено на модуляцию процесса потенциал-зависимой активации [9].
Объектом исследования в данной диссертационной работе являлся вольт-сенсорный домен потенциал-зависимого К+-канала KvAP (ВСД-
KvAP) из термофильной архебактерии Aeropyrum pernix. Имеющиеся на сегодняшний день структурные данные о ВСД-KvAP достаточно противоречивы. Три известные кристаллические структуры, полученные прп разных условиях кристаллизации, сильно отличаются друг от друга [10,11]. Было высказано предположение, что важную роль в стабилизации структуры ВСД-KvAP играет мембранное окружение — только плоская бислойная мембрана может обеспечивать нативную конформацию домена [11]. Полученные методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) данные свидетельствуют, что структура изолированного ВСД-KvAP в бислойной мембране близка к структуре ВСД в составе полноразмерного канала в открытом состоянии [12,13].
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) — один из наиболее мощных методов структурного анализа. Он позволяет определять не только пространственную структуру изучаемых белков, но и их внутримолекулярную динамику [14]. Для изучения мембранных белков этим методом требуется прріменение сред, моделирующих биологическую мембрану [15]. Используемые в настоящее время мембраномоделирующие среды (в основном, мицеллы детергентов) не во всех случаях обеспечивают сохранение нативной структуры исследуемого белка. Таким образом, выбор мембраномоделирующей среды является актуальной проблемой для современных ЯМР-исследований [16].
В литературе имеются данные о свойствах принципиально новой среды для солюбилизации мембранных белков — так называемых липид-белковых нанодисков (ЛБН) [17]. Нанодиски представляют собой фрагмент плоского липидного бислоя (~160 фосфолипидов), гидрофобные края которого экранированы от растворителя двумя молекулами амфифильного белка MSP (фрагмента аполипопротеина А-І из липопротеинов высокой плотности плазмы крови человека). Ранее ЛБН успешно применялись в исследованиях мембранных белков различными методами. Было показано, что ЛБН по своим свойствам наилучшим образом соответствуют биологической мембране и способны сохранять многие мембранные белки в нативном функциональном состоянии [18]. Однако, примеров использования ЛБН для структурных ЯМР-исследований мембранных белков на сегодняшний день нет.
Цели и задачи исследования. Целью работы являлось определение структурных и динамических характеристик изолированного ВСД-KvAP методами ЯМР высокого разрешения. Данная цель подразумевает решение следующих задач:
Подбор мембраномоделирующей среды для ЯМР-исследований ВСД-KvAP, обеспечивающей наилучшее качество ЯМР-спектров и сохраняющей структуру белка, наиболее близкую к нативной.
Получение отнесения сигналов ВСД-KvAP в гетероядерных ЯМР-спектрах.
Идентификация элементов вторичной структуры ВСД-KvAP по данным ЯМР.
Получение данных о пространственной структуре белка.
Определение характеристик внутримолекулярной динамики ВСД-KvAP.
Научная новизна и практическая значимость работы. Все результаты, изложенные в данной диссертационной работе, получены впервые:
Показана применимость ЛБН, созданных на основе липопротеинов высокой плотности человека, в качестве мембраномоделирующей среды для ЯМР-исследований мембранных белков и пептидов.
Предложен новый метод подбора мембраномоделирующей среды на основании сравнения спектров ЯМР изучаемого белка в различных средах со спектрами в ЛБН.
Показана и исследована зависимость структуры ВСД-KvAP от состава мембраномоделирующей среды.
Получено практически полное отнесение сигналов ЯМР атомов основной цепи и большей части -атомов ВСД-KvAP в комплексе с мицеллами ДФХ/ЛДАО (2:1).
Определена вторичная структура ВСД-KvAP в комплексе с мицеллами ДФХ/ЛДАО (2:1). Получены данные о его пространственной структуре.
Определены характеристики внутримолекулярной подвижности ВСД-KvAP в комплексе с мицеллами ДФХ/ЛДАО (2:1). Проведено сравнение существующих моделей потенциал-зависимой активации канала с полученными данными.
В данной работе разработан и успешно применен новый подход к определению пригодности мембраномоделирующих сред для ЯМР-спектроскопии мембранных белков, который предполагает сопоставление спектров белка в тестируемых детергентах и в ЛБН. Доказательство сохранения солюбилизированным белком нативной структуры является одной из основных проблем в современных исследованиях. Таким образом, данный подход может найти широкое применение в ЯМР-исследованиях мембранных белков.
Полученные в работе значения химических сдвигов сигналов ядер ХН, 13С, 15N в спектрах ЯМР ВСД-KvAP могут служить отправной точкой при его дальнейших структурно-динамических исследованиях, например, для получения структуры с высоким разрешением. Кроме того, отнесение сигналов основной цепи необходимо для исследования механизмов взаимодействия KvAP с токсинами или для скрининга прототипов лекарственных средств, модулирующих потенциал-зависимую активацию.
Полученные данные о внутримолекулярной динамике ВСД-KvAP позволяют снять некоторые противоречия между разными моделями потенциал-зависимой активации канала KvAP.
Метод ЯМР и его применение к мембранным белкам
Современные методы ЯМР-спектроскопии позволяют исследовать структуру белковых молекул с молекулярной массой вплоть до 100 кДа. Ограничения в применении методов ЯМР-спектроскопии для исследования больших белковых молекул вызваны двумя ОСНОВНЬІМРІ факторами. Во-первых, при увеличении молекулы скорость ее броуновского вращательного движения в растворе замедляется, что в свою очередь приводит к ускорению процесса поперечной (или спин-спиновой) релаксации ядерной намагниченности. В ходе процесса поперечной релаксации возбужденная намагниченность ядерных сшшов быстро спадает до нуля. Ускорение процессов релаксации уменьшает время жизни возбужденных ЯМР-состояний, ведет к уширению резонансных линий PI значительно понижает чувстви тельность ЯМР-экспериментов. Вторым важным фактором, ограничивающим применение ЯМР для исследования больших белковых молекул, является перекрывание сигналов в ЯМР-спектрах. Степень перекрывания резонансных линий напрямую зависит от типа изучаемой белковой молекулы. Эта проблема наиболее остро стоит при рісследовании ск-спиральных и неструктурированных белковых молекул, демонстррірующих небольшую дисперсию химических сдвигов ЯМР-сигналов [14].
Для ЯМР-исследованрш больших белковых молекул используются стабршьные изотопы углерода и азота, имеющие спин 1/2 (13С и 15N). Естественное содержание этих изотопов не велико: 1.1% и 0.37% соответственно, что обуславлрівает необходимость искусственного обогащения, например, в результате гетерогенной продукцирі белков в бактериальных клетках, на средах содержащих 13С-меченую глюкозу РІ 15КЕЦС1 как единственные источникрі углерода PI азота. Использованріе изотопно-меченых препаратов белков позволяет добавлять в спектры ЯМР дополшггельные изменения, таким образом решая проблему перекрывающихся сигналов. Так, методы ЯМР-спектроскопин, основанные на протон-протонных корреляциях (2D lE NOESY, COSY, TOCSY), не требуют искусственного обо-гащенрш изотопами и позволяют рісследовать пространственную структуру пептидов и небольших белков с молекулярной массой до 9 кДа для (3-структурных белков и до 6 кДа для а-спиральных белков [31]. В случае белков большего размера (до 15-20 кДа) введение різотопа 15N позволяет строить эксперименты, в которых взарімодействия между ядрами протона PI азота позволяют ВВЄСТРІ дополнительное измерение в спектры (3D 1H/15N NOESY и TOCSY). Дальнейшее увеличение массы рісследуемого белка требует ВВЄДЄНРІЯ изотопной МЄТКРІ дополнительно по 13С. В этом случае возможно применение методик тройного резонанса, которые позволяют не только снизить перекрывание сигналов, но и ріспользовать для передачи возбужденрія от ядра к ядру более сильные взаимодействия соседних ядер. Это снргжает влияние релаксащюнных процессов РІ увелрічивает чувствительность экспериментов [32]. Однако, в белках еще большего размера, даже такая передача оказывается неэффективной. Для решения этой проблемы в молекулу белка дополнительно вводят РІЗОТОП дейтерия (2Н). Это ядро со спином, равным 1, очень слабо взаимодействует с внешним маг-НРІТНЬІМ полем и другими ядрами, что при полной ИЛРІ частичной замене протонов боковых цепей на дейтерий приводит к значительному замедлению скорости поперечной релаксации других ядер ( 13С и 15N) [33,34]. Стандартный протокол исследования пространственной структуры белковой молекулы методами ЯМР-спектроскопии можно условно разделить на несколько этапов. На первом этапе проводится отнесение сигналов белка. Суть этого этапа состоит в определении частоты резонанса (химического сдвига) для максимально возможного набора ядер белковой молекулы и идентификации конкретных ядер, участвующих в образовании каждого из кросс-пиков в многомерных ЯМР спектрах. В зависимости от типа введения изотопных меток, для отнесения можно использовать различные стратегии. В любом случае сначала идентифицируют спиновые системы, содержащие сигналы атомов одного остатка. Затем с использованием информации о первичной последовательности белка и характерных химических сдвигов атомов различных остатков проводится последовательное соединение спиновых систем во фрагменты. Это позволяет сопоставить спиновую систему с конкретным остатком. В случае гомоядерных экспериментов спиновые системы идентифицируют с помощью наблюдения взаимодействия между ядрами, передающегося через химические связи [31]. Количественно это взаимодействие описывается константой спин-спинового взаимодействия (КССВ, J). Величины КССВ в белковой позволяют наблюдать в спектрах TOCSY и COSY взаимодействия между ядрами, отстоящими друг от друга обычно на 1-3 связи, что проявляется в наличии кросс-пика на пересечении частот соответствующих атомов. Соединение спиновых систем осуществляется с помощью спектра NOESY. Суть данного эксперимента заключается в использовании так называемого ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО, NOE), заключающегося в передачи намагниченности от одного ядра к другому напрямую через пространство. Интенсивность взаимодействия известным образом зависит от расстояния между ядрами (пропорциональна 1/R6)- Это позволяет выявить пространственно сближенные (менее б А) пары протонов, в том числе протоны соседних остатков. При использовании меченых по 13С и 15N образцов появляется возможность использовать так называемые методики тройного резонанса для идентификации спиновых систем и их последовательного соединения. В этом случае используемые эксперименты (HNCA, HN(CO)CA, HNCO и др.) позволяют наблюдать корреляции между ядрами, основанные на взаимодействиях, передающихся через валентные связи [14].
Полученные в результате отнесения сигналов химические сдвиги сами по себе уже являются достаточно точными индикатором вторичной структуры белковой молекулы [35]. Дело в том, что химические сдвиги атомов основной цепи белка зависят от разных факторов, в том числе от торсионных углов ф и тр. Для каждого типа аминокислотных остатков к известны химические сдвиги атомов этого остатка, характерные для случая, когда полипептидная цепь находится в конформации случайного клубка. Отклонение наблюдаемого химического сдвига от этого значения в ту или иную сторону говорит о вовлечении данного остатка в а-спираль или (5-слой. Такое отклонение называется вторичным химическим сдвигом.
На следующих этапах ЯМР-исследования белковой молекулы используют эксперименты, позволяющие получить структурною информацию. Величины вицинальных КССВ позволяют определить значения торсионных углов (ф, ф, xi)- Интенсивности ЯЭО, оцениваемые по величине кросс-пиков в спектрах NOESY, дают информацию о межпротонных расстояниях в белковой молекуле. Также возможно определение системы водородных связей в белке. Полученные данные используют для расчета структуры молекулы с применением специальных алгоритмов молекулярной динамики и энергетической минимизации [36]. В результате расчетов получают набор структур, наиболее соответствующих экспериментальным данным.
Использование ЛБН для солюбилизации мембранных белков и пептидов
Потенциал-зависимые (наряду с Са2+- и цАМФ-активируемыми) ка-тионные (Na+, Са2+, К+) каналы формируют большое семейство белков со схожим строением и функциями. В геноме человека закодировано 143 белка из этого семейства [99]. Все ЗТРІ каналы состоят из четырех субъединиц (или из четырех ковалентно связанных доменов как в Са2+ и Na+ каналах) симметрично окружающих центральную ионопроводящую пору. Иногда для выполнения каналом его физиологической функции необходимы вспомогательные субъединицы (так называемые /?-субъединицы), которые связываются с основным ионопроводящим комплексом (ог-субъединпца) и модифицируют электрофизиологические свойства канала. Уже на ранних этапах исследований ионных каналов в результате анализа аминокислотных последовательностей было определено, что каждая из субъединиц (или доменов в Са2+ и Na+ каналах) а-комплекса состоит из шести трансмембранных спиральных сегментов, которые были названы SI—S6. Эти сегменты можно разделить на два модуля — норовый домен (S5, S6) и вольт сенсорный домен (ВСД, S1-S4). Иногда внутриклеточные N- и С-концы субъединиц выполняют важную функцию. Например, они могут отвечать за быструю инактивацию канала, играть вспомогательную роль при тетра-меризации субъединиц и стабилизации канала, выполнять регуляторную функцию в Са2+- и цАМФ-зависимых каналах (Рис. 7 А).
Поровая субъединица была идентифицирована, когда впервые был клонирован ген К+ канала с аномальной проводимостью (Kir) [100]. Строение этого канала соответствует изолированной поре (без ВСД) потенциал-зависимых каналов. Интенсивное изучение структуры и функций ионо-проводящей поры катионных каналов на протяжении последних десяти лет позволило получить обширную информацию о механизмах транспорта ионов и селективности. Первым каналом, для которого была определена кристаллическая структура с высоким разрешением, был бактериальный рН-зависимый К+-канал KcsA из Streptomyces lividans [98], который также не имеет ВСД. Структурные особенности, характерные для KcsA, являются общими в строении поры всех катионных каналов. Пору формируют сегменты S5-S6 при тетрамеризации субъединиц (Рис. 7 Б). Петля между спиралями S5-S6 (так называемая Р-петля) каждого порового домена отвечает за селективную проницаемость для ионов. Р-петли каждой из 4-х субъединиц формируют узкий селективный фильтр. На внутриклеточной стороне поры четыре спирали S6 образуют преддверие с узким входом, в закрытом состоянии канала предотвращающее доступ ионов. Из 143 представителей суперсемейства потенциал-зависимых каналов, закодированных в геноме человека, более двух третей имеют в своем составе кроме модуля, формирующего пору, еще и вольт-сенсорный до мен [99]. ВСД состоит из четырех консервативных трансмембранных сегментов (S1-S4) и связан с поровым доменом через спираль-связку, находящуюся между S4 и S5 (S45) (Рис. 7 А). Взаимодействие ВСД и порового домена позволяет воротам, сформированным спиралями S6, открываться и закрываться при изменениях трансмембранного потенциала. Большинство каналов переходят в открытое состояние при положительных трансмембранных потенциалах, но существуют каналы, активируемые при гиперполяризации мембраны. Такие различия в способе активации, по всей видимости, связаны с различным характером взаимодействия ВСД и порового домена [101].
Важность сегмента S4 в ВСД была определена уже на ранних стадия изучения каналов, поскольку он включал в себя ряд положительно заряженных остатков (Arg, Lys), критически значимых для активации [96,97,102-104]. Также стало ясно, что ВСД представляет собой функционально независимый домен, слабо связанный с порой. Об это говорил ряд фактов, например существование К+ каналов, не содержащих ВСД [98, 100]. Также, при соединении ВСД потенциал-зависимого канала и порового домена канала KcsA, который слабо зависит от потенциала, формировался канал с хорошо выраженными потенциал-зависимыми свойствами [105,106]. Бактериальные клетки способны синтезировать и встраивать в мембрану изолированные от поры ВСД, которые имеют нативную конформацию [10,13]. Важное дополнение к данным о независимом функ ционировании ВСД было сделано с открытием белков, не являющихся ка-тионными каналам, но имеющих домены, гомологичные ВСД. Так, ВСД был обнаружен в ферменте Ci-VSP из организма Ciona interstinalis (ас-цидия) [6]. Это белок является потенциал-зависимой фосфатазой, которая гидролизует мембранные фосфоинозитиды. Активация фермента происходит при деполяризации мембраны. Ci-VSP содержит цитоплазматріческий фосфатазный домен, который заякорен в мембране с помощью мембранного домена. Мембранный домен Ci-VSP по своей структуре гомологичен ВСД катионных каналов (Рис. 8 Б) [6,107]. Другие белки со структурой, схожей с ВСД — это протонные каналы, обнаруженные у млекопитающих (Hvl) [5]. В этом случае мембранный домен, гомологичный ВСД, без каких-либо дополнительных структурных элементов сам по себе является проводником протонов (Рис. 8 В). Предполагается, что эти каналы функционируют в виде димера субъедпниц, гомологичных ВСД [108,109].
Описанные выше структурные особенности потенциал-зависимых каналов характерны для всех катионных каналов [1]. Однако, существуют различные вариации в их строении, связанные с различными функциональными задачами. Во-первых, это селективность к различным типам ионов. Она достигается за счет различного строения селективного фильтра различных каналов. Также, для К+ каналов наблюдается гораздо более широкое разнообразие, по сравнению с Na+ и Са2+ каналами. Ниже приведены основные типы катионных каналов с указанием некоторых особенностей строения.
Наработка и выделение ВСД-KvAP
В работе использовались аналоги ВСД-KvAP, неспецифически изотопно-меченные по 15N, 13C/15N, 2H/13C/15N, 2H/15N, а также селективно 15]Ч-меченный по остаткам лейцина аналог. Аминокислотная последовательность ВСД-KvAP: 10 20 30 40 50 MARFRRGLSD LGGRVRNIGD VMEHPLVELG VSYAALLSVI VVWEYTMQL 60 70 80 90 100 SGEYLVRLYL VDLILVIILW ADYAYRAYKS GDPAGYVKKT LYEIPALVPA 110 120 130 140 150 GLLALIEGHL AGLGLFRLVR LLRFLRILLI ISRGSKFLSA IADAADKRSH6 Все работы по получению и очистке как природного так и изотопно-меченого ВСД-KvAP были проведены совместно со с.н.с. Лаборатории инженерии белка ИБХ РАН к.х.н. Л.Н. Шингаровой. Использовалась методика, описанная в [129] с некоторыми дополнениями. Ген, кодирующий ВСД-KvAP (от Metl до Lysl47, бНлэ-меченый на С-конце), был получен из олигонуклеотидов с помощью полпмеразной цепной реакции. Ген был клонирован в вектор экспрессии рЕТ28а между Ncol и Hindlll сайтами.
Белок был экспрессирован в Е. coli, штамм BL21(DE3) (Novagen). Культура была выращена на минимальной среде М9 с добавлением 15NH4C1 . Для получения 13С/15]М-меченого белка в среду дополнительно добавляли 13Сб-глюкозу. Для получения дейтерированного белка использовались те же условия, но вся вода была заменена на D2O (99%). Для выделения белка культуру клеток осаждали, лизировали ультразвуком. Белок выделяли в 15 мМ ДДМ и очищали на колонке с Ni-NTA (Qiagen) с элюцией градиентом концентрации имидазола. Затем белок осаждали в 10% три-хлорацетате, промывали ацетоном и лиофилизировали.
Фосфолипиды (ДГФХ, ДМФХ, ДМФГ, ПОФХ) и лизофосфолипиды (ЛМФХ, ЛПФХ, ЛМФГ, ЛПФГ) использованные в настоящей работе, являются продукцией Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Недейтерированные детергенты (ДСН, Л ДАО, ДФХ, ДДМ) являются продукцией Anatrace Inc. (Машпее, ОН). Все дейтерированные растворители и детергенты (D2O, CF3CD9OH, CDC13, CD3OH, а38-ДФХ, СІ25-ДСН) произведены CIL (Andover, MA).
Комплексы ЛБН с ВСД-KvAP и AAM-I были получены совместно с н.с. лаборатории инженерии белка ИБХ РАН к.б.н. Е.Н. Люкмановой. Наработка мембраносвязывающего домена аполипопротеина A-I человека (белок MSP) осуществлялась по опубликованной методике [17] в E.coli, штамм BL21(DE3).
Комплекс ВСД-KvAP с ЛБН был получен добавлением раствора ВСД-KvAP в мицеллах ДФХ к смеси MSP, липидов (ДМФХ либо ДМФГ) и холата натрия (1:40:80). Соотношение ВСД-КУАР:МЭР составляло 1:20. Самопроизвольную сборку нанодисков инициировали путем сорбции детергента в присутствии химического реагента Bio-Beads (Bio-Rad, USA). Полученные нанодиски очищали на металл-афинной колонке Ni2+ Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, USA). Конечная концентрация частиц ЛБН составляла приблизительно 60 мкМ.
Для получения комплекса Антиамебина I с ЛБН, к раствору, содержащему сформированные и очищенные ЛБН добавляли AAM-I , растворенный в малом объеме метанола из расчета 1 молекула пептида на частицу ЛБН (60 мкМ).
Для подбора наилучшей солюбилизирующей среды для исследований ВСД-KvAP был протестирован широкий ряд сред. Для контроля пригодности среды использовались методики спектроскопии кругового дихроизма (КД) и ЯМР, а также наблюдения за стабильностью образца.
Приготовление образцов Комплекс ВСД-KvAP с мицеллами детергента получали, добавляя к лифилизированному образцу белка раствор мицелл соответствующего детергента (смеси детергентов, бицелл). Растворы мицелл детергентов получали растворением соответствующей навески детергента в смеси ЩО и D2O (5%). Для формирования бицелл ДГФХ/ДМФХ к сухой навеске ДГФХ добавляли ДМФХ, растворенный в хлороформе. Затем полученный раствор лиофилизировали из замороженного состояния и растворяли в 20мМ Трис-Ацстатном буфере (рН 7.0, 5% D2O) и подвергали нескольким циклам замораживания-оттаивания.
Для корректировки рН к образцам добавляли растворы HCl/NaOH либо СНзСООН/Tris. При необходимости титрования образца дополнительным детергентом его добавляли в виде концентрированного водного раствора.
Во всех случаях концентрация детергента поддерживалась выше ККМ, но не более 7% массы образца. При этом молярное отношение детер-гентгбелок всегда, кроме специально оговоренных случаев, составляло 100-150:1. В случае бицелл ДГФХ/ДМФХ применялись две концентрации ли-пидов — 2.5% и 5% от общей массы образца. Для некоторых экспериментов сухую навеску белка растворяли в органическом растворителе ТФЭ.
Спектроскопия кругового дихроизма (КД) Спектры КД были сняты на спектрометре Jasco J-810 (Jasco, Tokyo, Japan) совместно с сотрудником отдела структурной биологии ИБХ РАН Самсоновой О. В. Для получения КД-спектров использовался природный (не содержащий изотопных меток) ВСД-KvAP. Спектры были получены при комнатной температуре.
Спектры ЯМР
Для ЯМР-скрининга использовался 15№-меченый аналог ВСД-KvAP. Спектры получены на спектрометре DRX-500 (Bruker) с рабочей частотой по протонам 500 МГц, оснащенном датчиком тройного резонанса (1Н-13С-15N) с возможностью генерации градиентных импульсов постоянного магнитного поля. Все эксперименты проводились при температуре 45С.
Для каждого варианта условий был получен одномерный 1Н-спектр и двумерный 1H/15N корреляционный спектр HSQC с улучшением по чувствительности [14]. Фазочувствительность по 15]М-направлению обеспечивалась применением метода Echo-AntiechoPPI. Для подавления сигнала растворителя в одномерном спектре использовалась схема WATERGATE, в двумерном — FLIP-BACK [14]. Развязка от ядер 15N во время детекции осуществлялась с помощью циклически повторяемой последовательности импульсов GARP по 15гТ-каналу. Химические сдвиги определялись относительно положения сигнала воды, чей химических сдвиг относительно DSS был принят 4.60 м.д. Спектральная ширина по 1Н составляла 7500 Гц, по 15N в двумерных спектрах — 1500 Гц. По протонному направлению в обоих случаях было накоплено 1024 комплексные точки, по 15]М-направлению в спектрах HSQC — 100 комплексных точек. Спектры преобразовывали в частотное представление в программе TOPSPIN (Bruker) с разрешением 2048 комплексных точек по ХН и 256 по 15N. Для этого данные во временном представлении были дополнены нулями, по непрямому направлению использовалось линейное предсказание [14].
Исследование AAM-I в комплексе с ЛБН методом ЯМР
Подводя итог по всем качественным и количественным данным о структуре ВСД-KvAP в комплексе с мицеллами ДФХ/ЛДАО, можно заключить, что вторичная структура, а также пространственная упаковка спиралей ВСД-KvAP в мицеллах и кристалле в общих чертах совпадают. Так, например, были определены все основные трансмембранные спирали (S1-S4). В то же время, были обнаружены структурные особенности, которые не наблюдались в кристалле изолированного ВСД-KvAP, однако, были ранее показаны на полноразмерном канале — доступность растворителю региона S23-S3a, независимая спираль S45. Аномальные значения вторичных химических сдвигов для некоторых амидных протонов позволили предположить, что трехмерная структура ВСД-KvAP в мицеллах соответствует структуре в кристалле и характеризуется наличием межспиральных контактов. Следует отметить, что опубликованные результаты ЭПР-исследований полноразмерного канала и изолированного ВСД указывают на то, что эта структура соответствует нативной структуре ВСД-KvAP в открытом канале [12,13].
Примечательно, что сигналы 1Н -атомов с высокими вторичными сдвигами (Leu26, Тгр70, AlalOO, GlylOl) находятся в левой части спектра (Рис. 21) и присутствуют только в спектрах, полученных в цвиттерион-ных детергентах и ЛБН. Возможно, это является дополнительным подтверждением сохранения пространственной структуры цвиттерионных средах и разрушения третичной структуры ВСД-KvAP мицеллами анионных детергентов.
Неоднородность ширины линий, наблюдаемая в спектрах ВСД-KvAP, служит индикатором значительной внутримолекулярной подвижности белка в мицеллярпом окружении. Как правило, узкие сигналы наблюдаются в участках молекулы, совершающих "быстрые" (пс-нс) движения, а уши-рение сигналов свидетельствует о медленных (мкс-мс) конформационных флуктуациях или о химическом обмене. Степень уширения сигналов ВСД-KvAP была оценена по интенсивностям кросс-пиков в спектре 3D HNCO (Рис. 22). Согласно полученным данным, быстрые движения были отмечены на N- и С-концах молекулы, в районе петли, соединяющей спирали S1 и S2, а также в спиралях S23 и S3a. Медленные движения отмечаются в районах, близких к центрам спиралей S1 и S2, а также в спиралях S3a-S3b, S4-S45 (Рис. 26 Б,В).
Для более точного описания динамики ВСД-KvAP в мицеллах мы провели измерение параметров релаксации ядер 15N белка. Для повышения чувствительности экспериментов и разрешения мы использовали 2H/15N-меченный аналог ВСД-KvAP. Были измерены величины скоростей продольной и поперечной релаксации (Ri, R2) и интенсивности гетероядерного ЯЭО 151Ч-ХН при напряженности постоянного магнитного поля 14.1 Тл (60.8 МГц по 15N). Были получены значения для 99 15]М-атомов основной цепи из 142 имеющих отнесение, что связано с перекрытием сигналов в двумерных 1H/15N корреляционных спектрах и недостаточной чувствительностью, обусловленной уширением некоторых сигналов.
Наличие быстрых движений на концах молекулы и в районе петли S1-S2 подтверждалось понижением величины ЯЭО в этих областях. Повышенные значения Ri-R2 по сравнению уровнем 20 с-2 свидетельствовали о наличии обменных флуктуации (мкс-мс) в центре спиралей Sin S2, а так определенные методом ЯМР участки, совершающие "быстрые" и "медленные" движения. же в районе спиралей S3a-S3b и S4-S45 [171] (Рис. 26 А). Можно заметить, что наличием обменных флуктуации характеризуются области молекулы, находящиеся в районе межспиральных контактов.
Количественный анализ данных с использованием модель-независимого подхода [172] показал вклад медленных обменных движений в релаксацию ядер 15N практически для всех остатков белка (Рис. 27 Rex), что подтвердило наличие медленных движений. Однако, точные значения вкладов Кех могли быть завышены из-за наличия систематических ошибок, вызванных выходом за пределы диапазона применимости упрощенного модель-независимого подхода. В частности, причиной этого могла быть значительная анизотропия вращения комплекса ВСД-КуАР/мицелла или наличие корреляции между внутренними движениями и общим вращением комплекса. Для более точного количественного анализа необходимо измерение параметров ЯМР релаксации при нескольких различных значениях напряженности постоянного магнитного поля. Однако, измерение релаксации при других значениях магнитного поля (70.9 и 81.0 МГц по 15N) было затруднено из-за низкой чувствительности спектров и больших экспериментальных ошибок.
Из отношения R2/R1 для каждого остатка было рассчитано эффективное время корреляции вращательных движений (Рис. 26 А, тд) [170]. Полученные значения тд были неодинаковы для различных остатков, что может быть следствием внутримолекулярной подвижности. Среднее тд было рассчитано для "стабильных" участков (1Н-15К-ЯЭО 0.6 и Ri-R2 20 с 2) и составило 18 не (при 45С). Данное значение соответствует вращению частицы с гидродинамическим радиусом R#=32 А и эффективной массой 50 кДа. Эти результаты согласуются с полученными по данным трансляционной диффузии (Dt (0.90 ± 0.03) 10 10 о при 30С, R# 31 А). Сопоставляя полученные данные с поперечным размером глобулы ВСД-KvAP (радиус 10 А) и длиной молекул детергентов ( 20 А для ДФХ и ЛДАО), можно сделать вывод о том, что комплекс ВСД-КуАР/мицелла представляет собой молекулу белка с гидрофобным интерфейсом, покрытым слоем молекул детергента, что согласуется с на блюдаемыми ЯЭО контактами между амидными протонами белка и СНз-группами жирнокислотных цепей ЛДАО (Рис. 28).
