Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 7
Глава 2. Методики . 21
1. Объекты исследования, аппаратура и экспериментальные методики 21
2, Методы математической обработки спектральной информации 24
3. Квантовохимические методы расчета электронной структуры и спектров молекул 29
4. Построение изопотенциальных карт распределения электростатического потенциала. 33
Глава 3. Уф-спектроскопия, кислотно-основные и таутшерные равновесия 5-замещенных производных пиримидинов 35
1. Кислотно-основные и таутомерные равновесия 35
2. Спектроскопические свойства различных ионных и таутомерных форм 43
Рисунки к Главе 3 65
Глава 4. Электронная структура 5-замещенных производных пиримидинов 103
Рисунки к Главе 4 146
Заключение . 164
Выводы . 167
Литература 169
- Методы математической обработки спектральной информации
- Квантовохимические методы расчета электронной структуры и спектров молекул
- Спектроскопические свойства различных ионных и таутомерных форм
- Электронная структура 5-замещенных производных пиримидинов
Введение к работе
Стремление к более детальному пониманию процессов жизнедеятельности поставило исследователей перед необходимостью изучать биологические процессы на молекулярном уровне, т.е. когда физиологические проявления можно объяснить химическими превращениями, межмолекулярными взаимодействиями или изменением физических характеристик отдельных молекул. Нуклеиновые кислоты, являясь носителями генетической информации организма, основой метаболических процессов в клетке, занимают исключительное место в механизмах жизнедеятельности и поэтому являются объектами пристального внимания ученых различных специальностей.
Исключительная сложность физико-химических процессов, определяющих функционирование нуклеиновых кислот в биологических системах, обязывала к тщательному экспериментально-теоретическому изучению свойств их компонентов. К настоящему времени, довольно подробно, изучены спектральные свойства и электронные структуры различных ионных и таутомерных форм пуриновых и пиримидиновых оснований как в основном, так и в нижних возбужденных электронных состояниях. Все это привело к более глубокому пониманию механизмов мутагенеза, межмолекулярного взаимодействия нуклеиновых кислот с менее сложными органическими соединениями, металлами, радикалами, а также некоторых из путей их фотопревращений.
В тоже время, многие очень важные аналоги нуклеиновых оснований выпали из поля зрения исследователей, хотя к ним относятся минорные основания, лекарственные препараты, мутагены, а также различные молекулы, участвующие в системах матричного синтеза полинуклеотидов.
Несмотря на всю эту важность, сколь-либо исчерпывающая информация по этим соединениям, их ионным и таутомерным формам практически отсутствовала, что затрудняло дальнейшее развитие исследований в этом направлении.
Среди таких аналогов, особый интерес представляют 5-за-мещенные пиримидины, которые и являются объектами изучения в данной работе. Например, 5-оксиуридин является минорным основанием РНК /I/, 5-галогенпроизводные пиримидиновых нуклео-зидов и нуклеотидов применяются при изучении ферментативных реакций или мутационных процессов /2/. 5-бромурацил обладает функциональной актинностыо и в настоящее время широко применяется в структурно-функциональных исследованиях в качестве фотореакционной метки /3/. 5-фторурацил /V» 5-фторцитозин /5/, 5-йодурацил /6/, их нуклеозиды и нуклеотиды нашли широкое применение в клинике, в частности в терапии рака /4/. Все исследованные нами соединения широко используются или испытываются как ингибиторы вирусной активности /7,8/.
Однако, для этих соединений, как правило, не были известны их физико-химические свойства, кислотно-основные и тау-томерные равновесия и практически отсутствовали данные по электронной структуре различных ионных форм.
Исходя из выше сказанного, задачи настоящего исследования могут быть сформулированы следующим образом.
I. Необходимо было провести в стандартных экспериментальных условиях систематическое и детальное изучение УФ-спек троскопических свойств 5-замещенных пиримидияов. В результате этого изучения должны были быть определены индивидуальные оптические характеристики всех возможных ионных и таутомерных форм и константы равновесия между этими формами.
2. Для всех ионных и таутомершх форы исследуемых соединений с помощью квантовохимических методов расчета надо было определить их электронную структуру и ее изменения при переходе молекул в возбужденные электронные состояния. При этом, для достижения наибольшей достоверности этих расчетов, требовалось произвести их в 77-электронном приближении и, кроме того, с учетом всех валентных электронов,
3. Наконец, необходимо было, произведя сопоставление между экспериментом и теорией для изучаемых соединений, а также сравнив эти данные с соответствующими результатами для природных пиримидиновых оснований, идентифицировать главные реак-ционноспособные центры рассматриваемых молекул и проследить зависимость их локализации на различных молекулярных фрагментах от ионного и таутомерного состояний молекул и введения разных заместителей.
Наряду с этим следует отметить, что в процессе решения указанных задач использовался экспериментально-теоретический подход, развиваемый в ИМБ АН СССР. Однако, применяя этот подход для изучения новых соединений, задачей настоящего исследования являлось и дальнейшее развитие этого экспериментально-теоретического подхода.
В настоящей работе впервые проведено детальное УФ-спект-роскопическое исследование 5-авмещенных аналогов пиримидина в единых стандартных условиях в широком диапазоне рН (I-I4).
Впервые определены индивидуальные оптические характеристики различных ионных и таутомершх форм исследуемых соединений и получены константы равновесия между этими формами.
Впервые проведены квантовохимические расчеты электронной структуры и спектров для всех ионных и таутомершх форм иссле - б дуемых соединений. Проведено сопоставление результатов теоретических расчетов с экспериментальными данными.
Анализ электронной структуры 5-замещенных пиримидинов в основном и в возбужденных электронных состояниях, позволил сделать выводы об их потенциальной функциональной специфичности в системах матричного синтеза полинуклеотидов.
Результатами выполненной работы являются данные по оптическим характеристикам различных ионных и таутомерных форм и константам равновесия между ними, которые, наряду с возможностями чисто аналитического использования их, позволяют также определить конкретные условия, когда в растворе присутствует та или иная форма изученного соединения.
Знание электронной структуры ионных и таутомерных форм 5-замещенных пиримидинов в основном и в возбужденных состояниях позволяет идентифицировать их реакционные и фотореакционные центры и тем самым прогнозировать их поведение в различных экспериментальных условиях.
Результаты проведенных исследований суммированы в настоящей диссертации, состоящей из введения, четырех глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.
В первой главе дан литературный обзор.
Вторая глава является методическим разделом, в котором рассмотрены объекты и методы исследования.
В третьей главе представлены результаты исследований абсорбционных свойств изученных соединений, а также вопросы их кислотно-основных и таутомерных равновесий.
В четвертой главе приведены результаты квантовохимических расчетов и обсуждены вопросы, связанные с реакционной способностью и возможными фотохимическими превращениями.
Методы математической обработки спектральной информации
Измеренные при различных значениях рН спектры поглощения р(являются, как правило, суперпозицией индивидуальных спектров поглощения 1 (X) (индекс і- обозначает различные ионные формы), которые входят в суммарный спектр с различными коэффициентами Сі (приведенные концентрации различных форм).
Обычно, задачей абсорбционного исследования является определение величин фі(Х)к Сі , исходя из известных ЯЇ.А)» Решение подобных задач рассмотрено достаточно подробно /23/, поэтому мы не будем детально останавливаться на этом вопросе, отметим лишь, что при ручной обработке спектральной информации из всей совокупности экспериментально измеренных FCX) субъективно отбирается лишь небольшая часть, что неизбежно сопряжено с потерей экспериментально полученной спектральной информации и может, в ряде случаев приводить к несовсем корректным результатам. Все это побудило нас использовать для обработки экспериментально полученных спектральных данных автоматические методы обработки на ЭВМ. Смысл этих методов заключается в следующем. Для расчета спектров поглощения отдельных ионных форм и констант равновесия между этими формами использовался алгоритм, разработанный А.Я.Ломакиным /85/. В этом случае задача формулируется следующим образом. В растворе имеется смесь из Л/ ионных форм s0y, 9?2,-- %/ которые находятся в динамическом равновесии между собой с константами K"s (S - Любая из этих форм # имеет неизменный спектр поглощения фїї) , где -0 = -/,-.., ті- ,п нумерует длину волны (частоту) в данном спектре. Если изменить величину одного из параметров раствора, в нашем случае концентрацию протонов Hi(j-{,...,P)i то изменятся относительные концентрации молекул Ctj , но общая концентрация всех молекул останется неизменной. Для определения / "s J; г2 необходимо, чтобы суммарный расчетный спектр поглощения минимально отличался от экспериментального Fj $ у т.е. для определения этой задачи нужно найти минимум функционала: Измеренные спектры поглощения считывались с интервалом 2 —fr 5 нм. Обычно суммарные спектры поглощения измерялись через единицу рН, а при значениях рН близких к рК, интервал изменения рН уменьшался и мы, обычно, использовали лрН примерно равное 0,3-0,5,
Определенные в результате решения рассмотренной задачи индивидуальные спектры поглощения различных ионных форм / являются, как правило, весьма сложными. Это связано, с одной-стороны, с тем, что в растворе одновременно могут присутствовать несколько одинаково заряженных таутомеров и/или изомеров и, с другой стороны, с тем, что спектр поглощения каждого отдельного компонента состоит из нескольких более или менее сильно перекрывающихся полос, соответствующих отдельным электронным переходам. Выделение таких полос позволяет в ряде случаев разобраться в таутомерных равновесиях /23/ и, кроме того, весьма принципиально и важно для возможности корректного сопоставления данных спектроскопического эксперимента с результатами кван-товохимических расчетов спектров соответствующих соединений. Обычно при решении подобных задач полосу поглощения, соответствующую отдельному электронному переходу, пытаются описать с помощью некой математической функции, например, функцией Гаусса, Лоренса и т.д. /86/. Однако здесь следует подчеркнуть одно очень важное обстоятельство, что само по себе математическое разложение без четко сформулированной модели, положенной в его основу, лишено физического смысла. Что же может служить основой для построения такой модели? Прежде всего желательно, конечно, знать общее число потенциально возможных таутомерных или изомерных форм. Далее, исходя из кван-товохимических расчетов спектров этих форм, мы можем для каждой из них определить число полос в исследованном спектральном диапазоне. При этом следует подчеркнуть, что акие характеристики этих полос, как их полуширина ( и а симметрия ("JO для родственных соединений являются, как правило, весьма близкими.
Квантовохимические методы расчета электронной структуры и спектров молекул
Квантовохимические расчеты электронной структуры и спектров различных ионных и шаутомерных форм изученных соединений проводились нами как в ft -электронном приближении (Ш1П)/91/, так и с учетом всех валентных электронов (ППДП/С) /92,93/. Выбор этих приближений определялся тем, что результаты расчетов для исследуемых соединений необходимо сопоставить не только между собой, но и с расчетными данными для природных компонентов нуклеиновых кислот, которые были получены при использовании именно этих квантово-химических приближений /23/. Электронная структура рассматриваемых молекул не может быть представлена в виде только одной резонансной структуры. При расчете электронной структуры молекулы с учетом всех валентных электронов нет необходимости выбирать в качестве исходной какую-либо одну резонансную структуру. Наоборот, исходя из расчета, можно заключить, какая из резонансных структур является преобладающей. В 7Ї-электронном приближении выбор исходной резонансной структуры имеет определенное значение, т.к. квантовохимические параметры для атомов азота и кислорода в разных предельных структурах различны.
Поэтому, при расчетах в приближении ПИП исходили из тех резонансных структур, которые наиболее близки к полученным с помощью метода ПЩШ/С. Для большинства исследованных в настоящей работе соединений эти предельные структуры совпадают с таковыми для цитозина и урацила, которые были рассмотрены в работе /23/. Кроме того, этот вопрос более детально будет обсуждаться в Главе ІУ, посвященной электронной структуре 5-земещенных производных пиримидинов. Для расчетов электронной структуры и спектров рассматриваемых соединений геометрия цитозинового и урацильного ядер заимствовалась из работы /45/. Длины связей атома С/ \ с атомами фтора, хлора, брома и иода полагались, соответствен но, равными: І.355А /94/, І.7І5А /95/, I.88QA/96/ и 2.050А /97/. Для расчета электронной структуры и спектров 5-галогено-производных пиримидинов в V -электронном приближении использовались значения потенциалов ионизации (I), средства к электрону (А) и электроотрицательности (Е), взятые из работы /98/ и приведенные в таблице П. 2. Резонансный интеграл связи для атома галогена с атомом С/5) полагался равным -2.3 эВ, за исключением атома хлора, д для которого он принимался равным -1.8 эВ. Параметры для атомов фкора и хлора в приближении ІШДЇЇ/С были взяты из работы /99/, а 5-бром- и 5-иодпроизводные пири-мидинов не рассчитывались в этом приближении из-за отсутствия параметров. Геометрия экзоциклических групп: нитро-, амино-, циано-, окси-, меркапто-, тиоциано- и пропинилокси- выбрана в соответствии с данными работы /100/ и приведена в таблице П.З, о где даются характерные длины связей (в А) и соответствующие углы. Буквой R в этой таблице обозначен атом заместителя, непосредственно связанный с С/5)» а буквой X - атом в заместителе, связанный с R. .
Спектроскопические свойства различных ионных и таутомерных форм
На рисунках Ш.5 - Ш.27 приведены индивидуальные спектры поглощения различных ионных форм рассмотренных соединений. На рисунках Ш.28 - Ш.4І представлены спектроскопические разложения этих индивидуальных спектров поглощения на полосы, соответствующие отдельным электронным переходам. Исходные спектры поглощения и теоретически рассчитанные суммарные приводятся на одном рисунке для наглядности и для возможности визуальной оценки расхождения между экспериментальными и расчетными данными. Рисунки спектров помещены в конце главы. В таблицах Ш.З-Ш.6 суммированы теоретические (квантово- s/ Для всех, соединений, помеченных5 , в столбце таблицы "диа-нион" приведены значения для анионов типа (5) с ионизованным углеводным остатком. В теоретических графах для этих соединений представлены результаты расчета для оснований в форме моноаниона (5). вохимические расчеты) и экспериментальные (машинная обработка спектроскопической информации) значения энергий электронных переходов (Е в эВ) у различных ионных и таутомерных форм рассматриваемых соединений, экспериментально определенные значения сил осцилляторов (f ) соответствующих -электронных переходов и радиационные времена ( Z0 в не) изучаемых молекул в нижнем возбужденном синглетном состоянии. Для молекул, рассчитанных в приближении ППДП/С, в последней строке даются также значения энергий для нижнего тїЯ перехода. Результаты квантовохимических расчетов как в fr-электрон- ном приближении, так и с учетом всех валентных электронов получены для соответствующих оснований. Экспериментальные же данные в таблицах приводятся как для оснований, так и для нуклео-зидов (см.примечания к таблицам).
В таблицах Ш-З-Ш.6 не приводятся расчетные значения сил осцилляторов, т.к. в использованных нами квантовохимических приближениях получаемые значения f могут быть использованы лишь как оценочные, качественные величины. В таблице Ш-б не представлены экспериментальные и расчетные данные для мояоаниона (5з). Экспериментальные значения для него: энергий (Ej = 4.95 эВ; Е2 = 5.26 эВ) и сил осцилляторов ( ft = 0.33 и fz =0.67) - были получены в результате разложения-спектра поглощения анионов 5-окси-2 -дезоксиуридина (см.рис.Ш.24 и Ш.39) на полосы, соответствующие отдельным электронным переходам.Эти значения хорошо согласуются с предсказанными теоретически: ППП (4.90 и 5.14 эВ) и ППДП/С (4.75 и 5.18 эВ). Для 5-окси-2»-дезоксиуридина в теоретических графах представ лены результаты расчета для оснований в соответствующей ионной форме. Мы не приводим в таблице Ш.6 экспериментальных значений Ej и Е2 Для дианионов (10) и (II) 5-меркаптоурацила, известных из работ /81/.
Это связано с тем, что представленные в /81/ спектроскопические данные получены без достаточно корректного учета фотохимии. Следует отметить, что для всех рассматриваемых соединений при определении значений сил осцилляторов первых полос поглощения учитывалось процентное содержание каждой из одновремен- -но существующих в растворе таутомерных форм. Однако величины fz для моноанионов типа (6) не имеют строгого физического смысла, поскольку во вторую полосу поглощения для аниона (6) может вносить вклад третья полоса поглощения аниона (5). Поэтому значения rfz Для анионов типа (6) имеют некий интегральный смысл. В настоящей работе мы экспериментально изучали 5-пропини-локси-Е -дезоксиуридин, а квантовохимически рассчитывали соответствующие ионные формы оснований. Надо отметить, что для дианионов 5-пропинилоксиурацила квантовохимические расчеты предсказывают, что 1-ая полоса поглощения связана с внутримолекулярным переносом заряда с урацильного ядра на заместитель в 5-ом положении и сила осциллятора этого перехода мала. В то же время, 2-ой электронный переход имеет природу, аналогичную природе 1-ого перехода у соответствующих дианионов других рассмотренных соединений. Поэтому в случае экспериментального измерения спектра поглощения дианиона 5-пропинилоксиурацила его первую полосу поглощения следует сопоставлять с теоретически предсказанным значением Е. Рассмотрение данных, представленных на рис. Ш.5 - Ш.4І и в таблицах ШгЗ - Ш.б позволяет сделать ряд важных выводов и заключений.
Электронная структура 5-замещенных производных пиримидинов
Данные УФ-спектроскопических исследований и определение соотношений различных ионных и таутомерных форм, представленных в предыдущей главе позволили перейти к детальному кванто-вохимическому исследованию электронной структуры 5-замещенных аналогов пиришдинов. Квантовохимические расчеты электронной структуры различных ионных и таутомерных форм рассматриваемых соединений проводились с учетом всех валентных электронов в приближении ПЩШ/С, а также в $" -электронном приближении (ППЩ. Все вопросы, связанные с выоором квантовохимических параметров для расчета, а также геометрии исследованных производных цитозина и урацила были рассмотрены ранее в главе П. Различные ионные и таутомерные формы для которых проведены квантовохимические расчеты представлены на рис.Ш.1 - ШЛ. На схемах кислотно-основных равновесий мы не изображаем локализацию двойных связей, так как этот вопрос связан со вкладом в изображаемую структуру тех или иных резонансных (предельных) структур, которые обсуждаются ниже. Квантовохимические расчеты электронной структуры рассматриваемых соединений в приближении ІЇЇІДП/С показали, что для всех 5-замещенных пиримидияов, имеющих ионные и таутомерные формы і аналогичные имеющимся у цитозина и урацила и отличающиеся от последних лишь наличием заместителя в 5-ом положении, резонансные структуры совпадают с таковыми для цитозина и урацила. Схемы резонансных структур обозначены римскими цифрами от І до ХУШ. Так нейтральные молекулы 5-замещенных производных цитозина качественно описываются структурой (I). Катионы являются промежуточными между структурами (П), (Ш) и (ІУ), причем вклады структур (П) и (Ш), по-видимому, близки, а вклад структуры (ІУ) несколько меньше.
Анионы производных цитозина описываются структурой (У). Для нейтральных молекул 5-замещенных производных урацила распределение порядков связей соответствует структуре (УІ), для анионов (5) это распределение является промежуточным между структурами (УД) и (УШ), для анионов типа (6) - средним между структурами (IX) и (X), а дианион описывается структурой (XI). Катион (8) 5-аминоурацила соответствует резонансной структуре (ХП). Анионы типа (9) 5-меркалто- и 5-оксиурацила хорошо описываются структурой (ХШ). Структура дианиояа (10) этих соединений является промежуточной между предельными структурами (ХІУ) и (ХУ), а дианиона (II) - средней между структурами (ХУІ) и (ХУП), причем вклад резонансных структур (ХІУ) и (ХУІ), видимо, более существенен. Расчеты электронной структуры рассмотренных соединений в приближении ППП быж проведены исходя из указанных резонансных структур. Введение в 5-ое положение молекулы цитозина или урацила различных заместителей, мало сказываясь на электронной структуре молекулы в целом, весьма существенно влияет на электронную структуру молекулярного фрагмента С/5ч - С/6\. Поэтому в таблицах 4.1-4,6 мн приводим данные по электронной структуре различных ионных и таутомерных форм собственно цитозина и урацила, заимствованные из работы /23/; в таблице 4.7 -данные по электронной структуре молекулярного фрагмента !(5) - с(б) различных 5-замещенных производных пиримидинов и, наконец, в таблицах 4.8 - 4.10 - данные по электронной структуре 5-меркаптоурацила. Результаты расчетов электронной структуры 5-меркаптоурацила выделены в отдельные таблицы, т.к. у этого соединения ионные и таутомерные формы отличаются от таковых для урацила и, кроме того эти данные представляют определенный интерес, т.к. получены с помощью квантов охимических параметров для атома серы, предложенных в главе П. В таблицахЛУД-, ІУ.4; ІУ.7 и ІУ.8 приведены: величины полных зарядов на атомах Q0 в основном состоянии (S0)» Qs-- в нижнем возбужденном синглетном СОСТОЯНИИ (S{)t QT -в нижнем триплетном состоянии (Тт) и Q fi- - в нижнем возбужденном состоянии nQr -типа; величины її -электронных зарядов С 0") в основном состоянии и плотность яеспаренных
