Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. Обзор литературы: Пептаиболы как мембраноактивныс антимикробные пептиды 8
1 Мембраноактивные антимикробные пептиды 8
1.1 Спектр активности и специфичность действия АП 9
1.2 Структура АП и модели их мембранной активности . , 13
1.3 Структурно-функциональные зависимости на примере а-спиральных АП 19
1.4 Перспективы использования АП 23
2 Пептаиболы: структура, механизмы биосинтеза и биологическая активность 25
2.1 Структуры пептаиболов и их классификация . 27
2.2 Биосинтез пептаиболов... 30
2.3 Биологическая активность пептаиболов 32
2.3.1 Активность против бактерий и паразитов 32
2.3.2 Активность против грибов, роль в защите растений 33
2.3.3 Активность против клеток животных и митохондрий 34
2.3.4 Факторы, определяющие активность, связь с образованием каналов в модельных мембранах 35
2.4 Пространственная структура пептаиболов 36
2.4.1 Элементы вторичной структуры, встречающиеся в пептаиболах 36
2.4.2 Роль остатка Pro и другие структурные факторы, отвечающие за активность пептаиболов 38
2.4.3 Структура и динамика длинных пептаиболов: аламетицин, хрисоспермин и трихотоксин 40
2.4.4 Структура и динамика коротких пептаиболов: зервамицин, антиамебин, цефаибол, ампуллоспорин ихарзианин 42
2.4.5 Структуры пептаиболов в рамках BS модели 45
3 Взаимодействие пептаиболов с модельными мембранами 47
3.1 Структурные исследования взаимодействия пептаиболов с мембранами ...48
3.1.1 Начальное связывание длинных пептаиболов с бислойными мембранами ,.48
3.1.2 Положение спирали длинных пептаиболов относительно мембраны 49
3.1.3 Моделирование структуры аламетицина в мембране 51
3.1.4 Механизм перехода в ТМ состояние и наблюдение пор в мембранах 52
3.1.5 Влияние состава бислойной мембраны и трансмембранного потенциала...53
3.1.6 Структурные исследования взаимодействия коротких пептаиболов с модельными мембранами 55
3.2 Свойства каналов пептаиболов и модели их устройства 57
3.2.1 Потенциал-зависимая и потенциал-независимая проводимость пептаиболов в плоских мембранах : 57
3.2.2 Система уровней проводимости пептаиболов 59
3.2.3 Селективность каналов пептаиболов 63
3.2.4 Каналы пептаиболов в везикулах и целых клетках 65
3.2.5 Модели каналов пептаиболов 66
ЧАСТЬ II. Экспериментальные исследования ...69
4 Материалы и методы 69
4.1 Исследование структуры Zrv-IIB в органических растворителях 69
4.1.1 Приготовление образцов, ЯМР-спектроскопия и отнесение сигналов 69
4.1.2 Расчет пространственной структуры и энергетическая минимизация 70
4.2 Исследование 13С-15К-меченого Zrv-IIB в метаноле 71
4.2.1 Приготовление образцов, ЯМР-спектроскопия, отнесение сигналов и определение степени включения меток .„. 71
4.2.2 Исследование взаимодействия пептида с растворителем и прямое наблюдение системы водородных связей 73
4.2.3 Уточнение пространственной структуры Zrv-IIB в метаноле 73
4.3 Исследование спин-меченых аналогов зервамицина в метаноле 74
4.3.1 Приготовление образцов и ЯМР-спектроскопия 74
4.3.2 Измерение расстояний: протон - спиновая метка 75
4.4 Исследование структуры Zrv-IIB в растворе DPC мицелл 76
4.4.1 Приготовление образцов, ЯМР-спектроскопия и отнесение сигналов 76
4.4.2 Расчет пространственной структуры и определение положения пептида относительно поверхности мицеллы 77
4.5 Подготовка рисунков, депонирование экспериментальных данных и полученных структур 77
5 Результаты и обсуждения 79
5.1 Исследование структуры Zrv-IIB в органических растворителях 79
5.2 Исследование С- N-меченого Zrv-IIB в метаноле 82
5.2.1 ЯМР-характеризация С-13г4-меченого Zrv-IIB, определение степени включения изотопных меток и отнесение метальных групп остатков Aib 82
5.2.2 Прямое наблюдение системы водородных связей в |3С-15>7-меченом Zrv-IIB в метаноле 83
5.2.3 Сила водородных связей в спирали Zrv-IIB, связь с динамическим поведением пептида 85
5.2.4 Уточнение структуры Zrv-IIB в метаноле 86
5.2.5 Взаимодействие HN- и СО-групп основной цепи Zrv-IIB с растворителем. 87
5.3 Исследование спин-меченых аналогов зервамицина в метаноле 89
5.3.1 Межмолекулярные взаимодействия в Zrv-IIB и спин-меченых аналогах 89
5.3.2 Измерение расстояний: протон — спиновая метка в спин-меченых аналогах Zrv-IIB. 91
5.4 Исследование структуры Zrv-IIB в растворе DPC мицелл 92
5.4.1 Стехиометрия комплекса Zrv-IIB/DPC мицелла 93
5.4.2 Структура Zrv-IIB в растворе DPC мицелл 93
5.4.3 Положение молекулы Zrv-IIB относительно поверхности мицеллы 94
5.5 Модель действия Zrv-IIB 95
5.5.1 Потенциал-зависимая активация каналов зервамицина 96
5.5.2 Ассиметрия вольтамперной характеристики Zrv-IIB 97
5.5.3 Потенциал-независимое поведение Zrv-IIB 97
5.5.4 Структура каналов зервамицина 98
5.5.5 Селективность каналов зервамицина 98
Заключение 99
Выводы 100
Благодарности 101
Использованная литература
- Структура АП и модели их мембранной активности
- Активность против бактерий и паразитов
- Начальное связывание длинных пептаиболов с бислойными мембранами
- Приготовление образцов, ЯМР-спектроскопия и отнесение сигналов
Введение к работе
^
Актуальность темы. Пептаиболы - уникальные антибиотические пептиды,
продуцируемые микопаразитическими грибами родов Entericellopsis, Trichoderma и
родственных им. Эти пептиды содержат большое количество нестандартных а,а-
диалкилированных аминокислот, например, Aib (U, а-аминоизомасляная кислота) и Iva
(J, D-изовалин), ацетилированный N-конец и С-концевой аминоспирт, например, РЫ
(F1, L-фенилаланинол). Пептаиболы состоят из 5-20 остатков и часто содержат
иминокислотные остатки, такие как Pro (пролин) или Hyp (О, L-4-транс-
гидроксипролин). Общая гидрофобность этих пептидов и способность образовывать
амфифильные спиральные структуры в биологических мембранах придают
пептаиболам мембранную и антибиотическую активности.
Пептаиболы очень активны против грамположительных микроорганизмов, против бактерий класса Mollicutes (включая микоплазмы и спироплазмы), а также против различных экзо- и эндопаразитов, таких как амебы, малярийный плазмодий, гельминты и нематоды. Кроме этого некоторые пептаиболы обладают цитотоксической (противоопухолевой) и нейролептической (по отношению к млекопитающим) активностями. Основная природная функция этих пептидов связана с микопаразитизмом и защитой растений от патогенов. Пептаиболы, продуцируемые грибами-симбионтами растений, вероятно, участвуют в разрушении клеточных стенок фитопатогенных грибов, в усилении вторичного метаболизма у растений, а также в защите растений от вирусов и бактерий.
Биологические свойства пептаиболов коррелируют с каналообразующей активностью в модельных мембранных системах. Каналы, образованные этими пептидами, обладают рядом интересных свойств: несколькими хорошо определенными уровнями проводимости, катион-анионной селективностью и потенциал-зависимостью. Это позволяет рассматривать пептаиболы как простые модели для потенциал-зависимых ионных каналов. Вероятно, именно способность образовывать ионные каналы в мембранах клеток-мишеней лежит в основе антибиотического действия этих пептидов.
Исследование структуры и динамики молекул пептаиболов, а также связи между структурой и активностью этих пептидов имеет чрезвычайную важность как для решения фундаментальной задачи медицины - поиска (создания) новых антибиотических агентов на основе природных антимикробных пептидов, так и для решения фундаментальной задачи биотехнологии -4 сваяящщщв^^гентор (например,
лаьяй
на основе грибов рода Trichoderma) для биоконтроля растительных патогенов. Кроме того, структурные исследования пептаиболов чрезвычайно важны для решения ряда фундаментальных задач биофизики: (1) определения механизмов действия мембраноактивных антимикробных пептидов, (2) описания структуры и механизмов работы ионных каналов на молекулярном уровне.
Цель исследования. В данной диссертационной работе исследовали зервамицин-ПВ (Zrv-IIB) - основной компонент смеси пептаиболов, продуцируемых грибом Emericellopsis salmosynnemata. Несмотря на небольшую длину (16 остатков) Zrv-IIB проявляет биологическую и каналообразующую активности, сравнимые с активностью длинных (наиболее активных) пептаиболов, например, аламетицина (Aim, 20 остатков). Целью настоящей работы являлось исследование структуры и динамики Zrv-IIB методом ЯМР-спектроскопии в различных средах, моделирующих биологическую мембрану.
Основные задачи исследования:
-
Исследовать структуру Zrv-IIB в изотропных средах, моделирующих биологическую мембрану, - органические растворители с низкой полярностью (метанол, смеси хлороформ-метанол и метанол-вода).
-
Прямыми методами ЯМР-спектроскопии исследовать систему водородных связей в спирали Zrv-IIB в метаноле и взаимодействие HN- и СО-групп основной цепи пептида с растворителем.
-
Установить наличие или отсутствие высокоамплитудных шарнирных движений в спирали Zrv-IIB, а также выявить возможный тип межмолекулярных взаимодействий между спиралями пептида в метаноле.
-
Исследовать структуру Zrv-IIB в анизотропной среде, моделирующей биологическую мембрану, - растворе мицелл DPC. Определить структуру комплекса Zrv-ПВ/мицелла DPC.
-
Используя полученные данные, разработать модель, описывающую механизм мембранной активности зервамицина, и выявить структурные детерминанты, ответственные за высокую активность этого пептаибола.
Научная новизна и практическая значимость работы. Все результаты, изложенные в настоящей диссертационной работе, получены впервые. 1. Определена структура Zrv-IIB в органических растворителях и растворе мицелл
DPC; показано, что пептид связывается с поверхностью мицеллы, при этом N-конец
молекулы заглубляется внутрь мицеллы.
-
Прямыми методами ЯМР-спектроскопии определена система водородных связей пептаибола. Впервые наблюдалась бифуркационная водородная связь, включающая в себя две СО-группы (Leu8, Aib9) и одну NH-группу (Aib12). Показано, что подвижность пептида тесно связана с изменениями в системе водородных связей.
-
Установлено отсутствие высокоамплитудных шарнирных движений в спирали Zrv-IIB в метаноле.
Полученные данные позволили предположить, что особую роль в активности зервамицина, по сравнению с другими пептаиболами, играет стабильность его спиральной структуры. Отсутствие высокоамплитудных шарнирных движений, система устойчивых водородных связей и последовательность р-изгибов (P-bend ribbon), в С-концевой части молекулы, придают пептиду длину (~ 26 А) достаточную для того, чтобы пронизывать гидрофобную часть мембраны и образовывать трансмембранные ионные каналы из связок спиралей. В отличие от длинных пептаиболов, в молекулах которых шарнирные движения эффективно уменьшают как общую длину, так и дипольный момент спирали, Zrv-IIB обладает дипольным моментом (~ 50 D) достаточным для высокоэффективного потенциал-зависимого действия. В то же время, увеличение амфифильности и полярного угла спирали зервамицина позволяет формировать, в среднем, большие связки и, соответственно, каналы с большим сечением пор, что также усиливает биологическую активность пептида.
Настоящая диссертационная работа выявляет принципы структурной организации спиральных мембраноактивных антимикробных пептидов и указывает на особую роль подвижности в их функционировании. Результаты проведенных исследований, несомненно, будут полезны при дизайне новых или модификации природных антибиотических агентов, - задаче, которая приобрела особую важность в последнее время в связи с распространением патогенных микроорганизмов, резистентных к "классическим" антибиотикам. Результаты представленного исследования открывают путь к пониманию работы ионных каналов на молекулярном уровне.
Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на следующих российских и международных конференциях: XLII Научная конференция МФТИ (Москва, 1999); Open Russian-Swedish Conference "NMR in Protein-Protein and Protein-DNA Recognition" (Moscow, Russia 2000); X International Conference on New Information Technology in Medicine and Ecology (Gurzuf, Ukraine, 2002); XI International Conference on New Information Technology in Medicine, Biology, Pharmacology and Ecology (Gurzuf, Ukraine, 2003);
Совместный симпозиум РФФИ-NWO, Ten years Dutch Russian scientific co-operation (The Hague, The Netherlands, 2003); XII International Conference on New Information Technology in Medicine and Ecology (Gurzuf, Ukraine, 2004). Апробация диссертации была проведена на заседании научного семинара Лаборатории структурной биологии Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук 5 сентября 2005 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях, в том числе 2 работы в отечественных журналах и 5 в зарубежных журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, содержит 2 таблицы и 19 рисунков. Библиографический указатель содержит 353 источника литературы.
Структура АП и модели их мембранной активности
Простая классификация АП по типам структур невозможна, хотя их условно можно разделить на несколько структурных классов [43,71,72]. Структура типичных представителей этих классов показана на рисунке 1, а сами классы перечислены ниже.
1. Линейные молекулы, принимающие конформацию амфифильной а-спирали в присутствии мембраны. Например: магаинины (magainins) и дермасептины (dermaseptins) из кожи амфибий, цекропины (cecropins) из гемолимфы насекомых и аналогичные им пептиды свиньи (цекропин-Р1) и человека (LL-37), пептаиболы (peptaibols) грибов.
2. Р-Структурные пептиды, стабилизированные дисульфидными связями, эти молекулы могут также включать в себя а-спиральные регионы. Например: дефенсины (defensins) растений, насекомых и млекопитающих (включая приматов и человека), тионины (thionins) и циклотиды (cyclotides) растений, тахиплезины (tachyplesins) ракообразных, протегрины (protegrins) из лейкоцитов свиньи.
3. Вытянутые пептиды, содержащие большое количество определенных аминокислотных остатков (пролинов, триптофанов, аргининов, гистидинов и т.д.) и не формирующие классических элементов вторичной структуры. Например, индолицидин (indolicidin) из нейтрофилов быка.
Все это многообразие пептидов имеет одну общую структурную особенность, (обусловленную выбором клеточной мембраны в качестве мишени для действия) - все эти молекулы в активной конформации амфифильны. Это означает, что в присутствии мембраны АП образуют структуру, в которой заряженные (полярные) и гидрофобные группы пространственно разделены [43,71,72].
В настоящее время существует две основных модели, объясняющие мембранное действие АП (Рис. 2). Первая модель, — образование пор из связки мономеров (barrel slave model (BS модель)), была выдвинута еще в 70-е годы для описания структур больших клеточных ионных каналов и каналов, образованных пептидами, например аламетицином [76,77]. Вторая модель, - ковровая модель (carpet model) или модель тороидальных пор (toroidal-pore model), была предложена одновременно тремя коллективами авторов в конце 90-х годов для описания действия катионных АП, таких как магашшн, дермасептин и цекропин [31,32,55]. И хотя обе модели изначально выдвинуты для описания действия а-спиральных пептидов, они могут быть обобщены и на пептиды других структурных классов [31,55].
В рамках обеих моделей действие АП состоит из несколько этапов. На первом этапе (Рис. 1.1-2) пептиды, находясь в растворе, окружающем клетку, связываются с поверхностью ее мембраны под действием электростатических и гидрофобных взаимодействий. Часто (например, в случае а-спиральных пептидов) молекулы АП не имеют фиксированной конформации в растворе, и сближение с мембраной структурирует их, приводя к замыканию водородных связей и экспонированию гидрофобных регионов [31,41], что вносит дополнительный вклад в энтальпию связывания. Р-Структурные пептиды обычно стабилизированы дисульфидными связями и имеют жесткую структуру основной цепи, которая в большинстве случаев не меняется при связывании с мембраной [43,72]. Однако, некоторые р-структурные пептиды, например тахиштезин [74], претерпевают значительные изменения конформации как основной, так и боковых цепей в ходе этого процесса.
Далее, на втором этапе, в рамках обеих моделей происходит порообразование (Рис. 1.3-6). Пептиды, связанные на поверхности бислоя, расталкивают полярные головки липидов, что вносит в наружный монослой положительную спонтанную кривизну [31] и из-за сохранения общего объема липидных молекул и роста площади поверхности ведет к утончению мембраны [55,56,78].
Для пептидов, действующих по BS-механизму, утончение мембраны и другие факторы (наличие трансмембранного потенциала и дипольного момента у молекулы пептида, общая гидрофобность пептидной молекулы) приводит к переходу части пептидов в ТМ состояние. При присоединении все большего числа пептидов к поверхности толщина мембраны продолжает уменьшаться, и все больше пептидов оказываются погруженными в мембрану (Рис. 1.3) [55,56,78]. Процесс перехода пептидов в ТМ состояние носит кооперативный характер, он начинается при достижении критической концентрации связанных пептидов (PB:L 1:400 - 1:40, для аламетицина в мембранах различного состава) и практически полностью завершается при увеличении концентрации (PB:L 1:20, в случае аламетицина) [56,78,79]. Это приводит к характерной сигмоидальной зависимости активности пептидов от концентрации. Пептиды в ТМ состоянии также оказывают влияние на толщину мембраны (эффект hydrophobic matching), подгоняя ее под гидрофобную длину пептида [62], а сам переход при PB:L начинается при совпадении энергии поверхностное вязанного пептида и ТМ пептида при достижении определенной толщины мембраны [56]. Затем трансмембранные молекулы пептидов агрегируют и формируют каналы таким образом, что полярные стороны пептидов образуют пору, а гидрофобные стороны контактируют друг с другом и с молекулами липидов (Рис. 1.4), при этом возникают пептид-пептидные и пептид-липидные взаимодействия, стабилизирующие канал [21,76,77,80], Для образования каналов достаточно небольшой доли ТМ пептидов [67], и активное порообразование начинается задолго до достижения критической концентрации PB:L Образованные каналы могут в дальнейшем увеличиваться путем присоединения дополнительных мономеров к связке пептидов [21,76,77,80].
Согласно ковровой модели (Рис. 1,5-6) пептиды также связываются па поверхности мембраны, утончают ее и вносят положительную кривизну [31,55]. Однако пептиды из-за большого заряда не могут встраиваться в гидрофобную часть мембраны и принять ТМ ориентацию (Рис. 1.5). И при достижении критической концентрации PB:L (для магаинина в мембранах из PG — 1:100 [31], в мембранах из PS или PC — 1:30 [67,81]) в мембране начинают образовываться тороидальные поры. Стенки этих пор образованы как молекулами пептида, так и полярными головками липидов, завернутыми из наружного и внутреннего монослоев мембраны (Рис. 1.6), Таким образом, пептиды практически не контактируют друг с другом и остаются всегда связанными с полярными головками липидов [31,55,67]. Такие поры имеют короткие времена жизни и позволяют липидам перетекать из одного монослоя мембраны в другой (lipid flip-flop) [31]. При распаде подобной поры часть пептидов оказывается на внутреннем монослое, что обуславливает перенос пептидов через мембрану. Эта модель получила название ковровой модели, так как для дестабилизации мембраны и начала порообразования необходима большая концентрация поверхиостносвязанных пептидов, при этом пептиды покрывают поверхность мембраны своеобразным ковром [32].
Причиной гибели клетки-мишени (в обеих моделях) может быть как само порообразование, ведущее к осмотическому лизису, так и мицеллизация бислоя при присоединении большого количества пептидов (Рис. 1.7-8) [31,32]. Причем селективность действия пептидов может проявляться на разных этапах, как при селективном присоединении к мембранам мишеням, так и при селективном порообразовании в определенных условиях. В случае некоторых пептидов описанные выше механизмы не ведут к гибели клетки, а необходимы лишь только для проникновения молекул АП через мембрану. Смерть клетки наступает в ходе атаки на внутриклеточные цели [27,37].
Активность против бактерий и паразитов
Активность против бактерий и паразитов Все длинные пептаиболы демонстрируют значительную антибактериальную активность против грамположительных организмов (MIC 0.5 мкМ), и менее активны по отношению к грам отрицательным организмам (МІС 25 мкМ), в том числе полностью неактивны по отношению к Е. coli [6,7,13,134-139]. Эти пептиды также активны против микроорганизмов класса Mollicutes (включая микоплазмы и спироплазмы) — маленьких бактерий, лишенных клеточной стенки. Аламетицин, трихорзин и их аналоги эффективно ингибируют рост бактерий семейств Mycoplasma, AcholepJasma, Spiroplasma (МІС от 1.5 мкМ до 50 мкМ), в то время как катионный АП магаинин оказывается неэффективным в концентрациях до 100 мкМ. Действие пептаиболов связано с деполяризацией клеточной мембраны. Так, при концентрации около 0.1 мкМ эти пептиды начинают деформировать клеточную мембрану, а при концентрации 1 мкМ полностью рассеивают трансмембранный потенциал (-70 мВ) [8,46,47]. Пептаиболы могут синергически усиливать действие других антимикоплазматических агентов [140]. В дополнение к этому длинные пептаиболы демонстрируют значительную активность против эндопаразитов и простейших. Трихорзианин в концентрациях около 7 мкМ ингибирует рост амеб Dictyostelium discoideum [9], а хрисоспермин (Cry) активен против нематод Caenorhabditis в концентрациях около 5 мкМ [13].
Короткие псптаиболы, содержащие 16 остатков, (зервамицин, аптиамебин, цефанбол) обладают схожими антибактериальными свойствами с незначительно меньшей активностью [6,12,22,135]. Эти пептиды также активны против микоплазм, простейших, эндо- и экзопаразитов [12,22]. Зервамицин ингибирует рост простейших с MIC 12 мкМ [22], цефаибол убивает 100% гельминтов при концентрациях 7 мкМ [11,12], а аптиамебин, как следует из названия, активен против амеб. Эти пептиды демонстрируют значительную антималярийную активность, зервамицин ингибирует рост Plasmodium falciparum с MIC 0.48 мкМ, а аптиамебин менее активен (б.ІбмкМ) [10].
Дальнейшее укорочение цепи с 15-ти до 12-ти остатков ведет к постепенному понижению антибактериальной активности. Пептиды длиной 11 остатков и менее практически пе обладают антибактериальной активностью (MIC 50 мкМ)[141-14б]. Активность против грибов, роль в защите растений. Пептаиболы не действуют на грибы семейства Candida [7,139,147], однако, эти пептиды активно ингибируют рост некоторых видов нитевидных грибов и дрожжей [13,137,139]. В основном это касается фитопатогенных грибов (например, Sclerotium cepivorum, Phoma deslructiva), которые длинные пептаиболы ингибируют с МІС в диапазоне 25 - 60 мкМ [13,136,137,143]. Короткие пептиды ( 16 остатков) ингибируют рост Sclerotium cepivorum с меньшей активностью [143], и вызывают морфологические изменения (формирование коричневого пигмента) в Phoma destructiva, не ингибируя рост этого гриба [15,144]. Длинные пептаиболы в маленьких концентрациях (— 5 мкМ) также вызывают формирование коричневого пигмента в Phoma destructiva [15,136].
Пептаиболы синергически усиливают действие ферментов (глюконазы, целлюлазы, хитиназы), синтезируемых организмом-продуцентом, для разрушения клеточной стенки фитопатогенных грибов [16,17]. Возможно, основная роль этих пептидов в природе состоит в разрушении мембран грибов, на которых гриб-продуцент паразитирует, или в разрушении мембран грибов, атакующих растение-симбионт [148]. Пептаиболы также усиливают вторичный метаболизм у растений [18], ингибируют вирус табачной мозаики и бактерии, патогенные для растений [19,20]. Эти биологические свойства делают возможным использование грибов-продуцентов пептаиболов (например, рода Trichoderma) в качестве агентов биоконтроля при культивировании хозяйственных растений [148,149].
Пептаиболы очень активны против клеток животных и млекопитающих. Длинные пептаиболы демонстрируют гемолитические свойства с ЕС50 в диапазоне от 7 мкМ до 40 мкМ, по своим свойствам занимая промежуточное положение между меллитииом (ЕС50 0.3 мкМ) и детергентом SDS (ЕС50 62 мкМ) [48,135,150-153]. Короткий зервамицин (16 остатков) обладает аналогичными свойствами. Значительный лизис эритроцитов наблюдается уже при концентрации 12.5 мкМ [10], в то время как гомологичный ему антиамебин значительно менее активен (ЕС50 125 мкМ) [152].
Пептаиболы действуют и на другие клетки млекопитающих. Длинные пептаиболы, состоящие из 20-ти остатков, (аламетицин, трихоспорин, трихоцеллин) в концентрациях 2-5 мкМ вызывают Са """-зависимое выделение катехоламинов из бычьих хромаффинных клеток надпочечников, а также втекание внешнего Са2+ в другие животные клетки. При более высокой концентрации (10-30 мкМ) вытекание не зависит от внешней концентрации Са2+, что свидетельствует о разрушении клеточной мембраны [48,154-156]. AIm-Rf30 в концентрации до 20 мкМ активирует скорость метаболизма в бычьих эндотелиальных клетках аорты, но при более высоких концентрациях обратимо подавляет метаболизм [48]. Трихокинидины (18 остатков) увеличивают проницаемость мембраны сперматозоидов свиньи, приводя к полной остановке их подвижности и видимым морфологическим изменениям (ЕС50 2 мкМ) [157]. Они также приводят к полному падению потенциала на митохопдриалыюй мембране человеческих раковых клеток, не разрушая цитоплазматическую мембрану, при концентрациях 10 мкМ [157]. Аламетицин действует на эти клетки еще активнее, он полностью рассеивает митохондриальный потенциал при концентрации 2 мкМ, а разрушает цитоплазматическую мембрану при концентрациях около 25 мкМ [157]. Аналогичное действие аламетицин оказывает и на другие культуры человеческих раковых клеток [ 140], Хрисоспермин запатентован в качестве противоопухолевого агента [13]. Короткие пептаиболы менее активны чем длинные, например, IC50 цервининов (12 остатков) против различных опухолевых клеток находится в диапазоне 30- 100 мкМ [145].
В общем длинные пептаиболы ( 16 остатков) токсичны для млекопитающих с летальной дозой от 4 до 20 мг/кг веса мыши [15,147]. Короткие пептиды имеют явно выраженное действие на нервную систему млекопитающих. При концентрации 1 мг/кг они вызывают временное понижение температуры тела и подавление моторной активности у мышей, действуя как нейролептические агенты [14,15].
Как показано на личинках москита (Culex pipiens), действие пептаиболов на клетки начинается с морфологических изменений в митохондриях и разрушении их мембран
[158]. Действительно, пептаиболы обладают значительной способностью разобщать цепь окислительного фосфорилкрования в митохондриях [159-163], однако, не действуя на тонопласты растений [164]. Зервамицин и антиамебин разобщают митохондрии при концентрациях 2 мкМ, а длинные пептаиболы (аламетицин, хипельцин, трихоспорин) еще более активны [161]. Синтетические N-концевые фрагменты эмеримицина и аламетицина с длиной цепи от 7-ти до 13-ти остатков активны в концентрациях около 50 мкМ, а более короткие пептиды-неактивны [159,165].
Начальное связывание длинных пептаиболов с бислойными мембранами
Начальное связывание длинных пептаиболов с бислойными мембранами Исследование с помощью спектроскопических методов, таких как КД [234,235], ИК [153,236,237] и СР [235] показали, что длинные пептаиболы связываются с мембраной в спиральной конформации. Детальное исследование процесса связывания Alm-Rf50 [238], Alm-Rf30 [48], Нур-А [153,234] и флуоресцентно- [239] и спин-меченых производных Alm-Rf50 [114] с везикулами, составленными из PC, при помощи КД спектроскопии, спектроскопии-флуоресценции, или ЭПР-спектроскопии показало, что связывание пептаиболов с мембраной носит кооперативный характер. Изотерма связывания, построенная в координатах PB:L (отношение концентрации связанного пептида к концентрации липида) от Рр (концентрация свободного пептида), на начальном этапе ведет себя линейно с коэффициентом связывания, соответствующим свободной энергии присоединения AGB —4 —5 кКал/Моль. Однако, при достижении критической концентрации / (0.8 - 2.5 мкМ) или соответствующего ей значения PB:L (1:400 - 1:100) изотерма связывания претерпевает излом и дальнейшее связывание пептида идет с большей активностью (AG —6 кКал/Моль). Насыщение мембраны наблюдается только при Py:L 0.3 -0,4 (1:2.5 - 1:3). Что указывает на ТМ состояние пептида в конце процесса связывания
Наблюдаемая оперативность связывания была истолкована как доказательство олигомеризации пептида в мембране [223,238]. На основании корреляции зависимости PF от состава мембраны и активности потенциал-зависимого каналообразования в плоских мембранных системах было выдвинуто предположение, что потенциал-зависимость действия аламетицина вызвана потенциал-зависмьш присоединением пептида к мембране [240].
Несмотря на то, что позднее экспериментально было обнаружено потенциал-зависимое присоединение заряженного Alm-RBO к мембране [224], основные положения этой гипотезы были опровергнуты. Исследование методом ЭПР полностью активного, спин-меченого производного Alm-Rf50 в везикулярных системах, показало, что даже при высоких значениях PQ:L пептид находится в состоянии мономера [114,241,242], и потенциал-зависимость действия наблюдается даже при полном связывании аламетицина с мембраной [243]. Это опровергало возможную роль потенциал-зависимого присоединения пептида в его активации и свидетельствовало о том, что если в отсутствии потенциала и существуют связки спиралей, то они представляют собой минорную фракцию пептида.
Методом КД-спектросконии для Alm-Rf50 и Alm-RDO в везикулах, составленных из PC, было выявлено изменение конформации при переходе концентрации связанного пептида через критическое значение Р»:Ь [244-246]. Это напрямую указывало на наличие в мембране двух форм аламетицина (и третьей формы в растворе). При концентрации связанного пептида меньше, чем PB:L , весь мембраносвязанный пептид находился в состоянии (S) со спиральностью — 50%, а при увеличении концентрации начинался кооперативный переход в состояние (I) со спиральностью 65% [244]. Видимо, этот переход и вел к усилению связывания растворенного пептида с мембраной. При дальнейшем увеличении PB:L весь мембраносвязанный пептид переходил в состояние (I), которое, соответствовало ТМ состоянию спирального пептида (в форме мономеров или агрегатов), о чем свидетельствовало предельное значение PB:L 0.3 - 0.2. Тем не менее, для доказательства этого факта были необходимы прямые структурные исследования.
Положение спирали длинных пептаиболов относительно мембраны ЭПР и ЯМР-исследования спин-меченого по С-концу производного Alm-Rf50 [114,242], а также исследование флуоресценции трихорзианинов (Tz-AIIIc, Tz-BIIIc, остатков), содержащих С-концевой Trl [9,247], показало, что в мембраносвязанном состоянии С-конец длинных пептаиболов находится па мембранном интерфейсе и не погружен значительно в глубь углеводородного региона мембраны. Однако, многочисленные исследования ориентации спирали пептаиболов относительно нормали к плоскости мембраны и, соответственно, положения в мембране N-конца пептида привели к противоречивым результатам.
Раннее исследование влияния Alm-Rf30 на структуру липидов с помощью Р и Н ЯМР и СР показало, что связанный пептид (PR:L — 1:15) возмущает в основном сигналы полярных головок липида и не изменяет структуру жирных цепей [248], таким образом, указывая на расположение пептида параллельно поверхности мембраны. Более позднее исследование аламетицина при помощи КД и PC выявило зависимость положения пептида в мембране от ее состояния [235]. Так, в жидкокристаллической мембране из DTPC Alm-Rf50 находился в ТМ состоянии (Рц:Ь 1:100), а при переводе мембраны в гелевое состояние охлаждением пептид располагался параллельно поверхности. При дегидратации мембраны независимо от ее состояния, аламетицин переходил в ТМ форму [235]. ИК исследование положения спирали Нур-А относительно ориентированных мембран DPPC (PB:L 1:20) при полной гидратации показало отсутствие преимущественной ориентации пептида, наблюдалось случайное распределение углов наклона спирали по отношению к нормали плоскости бислоя [153].
Частично ТМ состояние спирали A!m-Ri30 было продемонстрировано с использованием липидов, аналогов PC, содержащих фотоактивируемую метку на конце жирной цепи [249]. Продукты фотолиза содержали мономеры аламетицина с присоединенными к N-концевой части молекулами липидов. Это указывало на то, что в отсутствии внешнего потенциала N-концевая часть аламетицина погружена в гидрофобную часть мембраны [249].
ЯМР-исследование скорости обмена HN протонов мембраносвязанного аламетицина (DOPS, Рц:Ь 1:20, частичная гидратация) на дейтерий растворителя показало, что пептид имеет стабильную спиральную коиформацию. Полярная сторона мембраносвязанной спирали, видимо, контактирует с водной фазой, что указывает либо на поверхностное связывание пептида, либо на включение его ТМ мономеров в состав BS пор [250].
Исследование ориентации селективно или однородно 15Ы-меченых аналогов Alm RI50 и Alm-RDO в ориентированных мембранах, составленных из PC (DMPC Рц:Ь 1:8, или POPS PR:L 1:15 - 1:250), методом твердотельного ЯМР показало, что спираль аламетицина имеет ТМ ориентацию в этих условиях [86,251,252]. Глубина залегания ТМ спирали аламетицина в мембране была определена методом ЭПР с использованием спин меченых производных Alm-Rf50 [253]. Пептид в отсутствии потенциала был погружен в мембрану везикул еРС так, что С-конец молекулы выступал на Ъ—4 А из мембраны в водную фазу, а N-конец молекулы не доставал 16 А до фосфатных групп противоположного монослоя мембраны [253]. Аналог аламетинина с заменами Aib/Leu (L1) был погружен в мембрану на 3—4 А глубже [253].
Приготовление образцов, ЯМР-спектроскопия и отнесение сигналов
Приготовление образцов, ЯМР-спектроскопия и отнесение сигналов. Для экспериментов в органических растворителях 12 мг Zrv-IIB (молекулярный вес 1838 Да) растворялось в 0.6 мл или CD3OH, или в смесях CDCI3/CD3OH с объемной концентрацией CDCI3 от 10% до 90%, или в смесях CD3OH/H2O с объемной концентрацией НгО от 5% до 50%. В работе использовались дейтерированный метанол (99.5% дейтерия, Stohler Isotope Chemicals, USA) и дейтерированный хлороформ (100% дейтерия, Stohler Isotope Chemicals, USA). Результирующая концентрация зервамицина была 10.8 мМ. Эксперименты с 15№-мечеиым зервамицином ИВ проводились при концентрации 3 мМ.
Спектры ЯМР были получены на спектрометре UNITY 600 (Varian) с рабочей частотой на протонах 600 МГц. 2D спектры DQF-COSY [309], TOCSY [310] со временем смешивания (тт) 50, 70 мс, NOESY [311] с тт 200, 300 мс регистрировались по фазочувствительному методу StatesPPI [312], при температуре 30С. рН раствора был равен 5.8 (не корректированные показания рН-метра). Для подавления остаточных сигналов растворителя использовались методы WATERGATE [313] и FLIP-BACK [314]. Во всех экспериментах использовалась задержка на релаксацию 3.2 с. Химические сдвиги измерялись относительно остаточного CD2H сигнала метанола, чей химический сдвиг относительно тетраметилсилана был выбран 3.3 мд.
Скорость обмена амидных протонов на дейтерий растворителя в метаноле оценивалась по ID спектрам, первый из которых был накоплен через пять минут после растворения лиофилизоваиного образца в CD3OD при температуре 15С. Времена полуобмена вычислялись путем вписывания экспоненты в зависимость интенсивности ЯМР-сигнала HN-протона от времени. Температурные коэффициенты амидных протонов измерялись по ID спектрам, снятым в диапазоне температур от 5С до 40С.
Гомоядерпые константы спип-спинового взаимодействия (КССВ) 3JnNHa и "ІІрАг1 измерялись по ID спектрам, накопленным с разрешением 0.25 Гц наточку. Гетероядерные константы NH 1 измерялись с точностью ±1 Гц по относительному сдвигу HN-H11 кросс-пиков в NOESY спектре 15Ы-мечепого Zrv-IIB, снятом без развязки от 15N [315].
Данные ЯМР обрабатывались с помощью VNMR, стандартного программного обеспечения Varian, и анализировались в программе XEASY [316]. Отнесение сигналов было произведено по стандартной методике [317]. Отнесение спиновых систем нестандартных аминокислот Aib и Iva было проведено по NOESY спектрам.
4.1.2 Расчет пространственной структуры и энергетическая минимизация. Расчет пространственной структуры по данным ЯМР был осуществлен в программе DYANA [318], используя метод молекулярной динамики в пространстве торсионных углов и алгоритм "моделируемого отжига" (simulated annealing). Для уменьшения эффекта спиновой диффузии интенсивности кросс-пиков ЯЭО измерялись в спектре NOESY с тт 200 мс с помощью программы XEASY посредством интегрирования по эллиптической области. Ограничения на межпротонные расстояния были вычислены из объемов кросс-пиков ЯЭО по калибровке " 1/г ", используя модуль CALIBА программы DYANA [319]. Стереоспецифическое отнесение для прохиральных протонов и ограничения на торсионные углы р и %\ были получены из КССВ 3JHNII \ JiiaiiP и 3JNH И интенсивности кросс-пиков ЯЭО с помощью модулей GLOMSA и HABAS программы DYANA [319]. В случае неизвестного стереоспецифического отнесения использовались ограничения на псевдоатомы. После предварительного расчета структуры, для пар протонов, находящихся друг от друга на расстоянии меньшем 3.0 А и, в то же время, не дающим кросс-пика в спектре NOESY, было введены дополнительные нижние ограничения на расстояния величиной 3.0 А.
Доноры водородных связей были определены по скорости обмена HN протонов на дейтерий растворителя. Образующими водородные связи считались те протоны, чье время полуобмена в метаноле было больше или равно 5 минутам. Акцепторы водородных связей были найдены при анализе предварительно рассчитанных структур. На водородные связи были наложены дополнительные (верхние и нижние) ограничения па расстояния (1.8 А dHN0 2.3 А и 2.8 А dNO 3.3 А).
Стереоспецифическое отнесение метильных групп остатков Aib было проведено на промежуточном этапе расчета структуры, в результате нескольких последовательных итераций. На каждом этапе ограничения на расстояния для различно отнесенных метильных групп проверялись на согласование с другими ограничениями и при наличии нарушений метильные группы одного остатка АІЬ переотносились.
На последнем этапе в программе DYANA было рассчитано 100 структур и 20 лучших из них были энергетически минимизированы в программе DISCOVER [320], используя силовое поле CVFF [321]. Диэлектрическая проницаемость с была равна 33, эффекты растворителя не учитывались, на молекулы были наложены все те ограничения, которые использовались в программе DYANA.
Приготовление образцов, ЯМР-спектроскопия, отнесение сигналов и определение степени включения меток. Образец 13С-15Г\Г-меченого Zrv-IIB был растворен в 0.6 мл CD3OH до концентрации 4 мМ. рН раствора бьш равен 6.2 (не корректированные показания рН-метра). Спектры ЯМР были получены на спектрометре Bruker DRX-500 с рабочей частотой на протонах 500 МГц при температуре 32С. Отнесение ядер Си N, ковалентно связанных с протонами, было выполнено 14 1 используя 2D С- или N-HSQC спектры [322], на основании известного отнесения для протонов (см. пункт 4.1.1). 2D 15N-HSQC спектр был накоплен со спектральной шириной 2 кГц 5 кГц (128 1024 комплексных точек). Два 2D ,3C-HSQC спектра были накоплены с
С несущей находящейся либо в центре алифатического (40 мд), либо в центре ароматического (ПО мд) региона со спектральной шириной 12.5 кГц 5 кГц (256 1024 комплексных точек). Отнесение сигналов ядер СО было выполнено с использованием 2D вариантов 3D экспериментов HNCO [323] и HN(CA)CO [324], спектры были накоплены со спектральной шириной 1.25 кГц 5 кГц (128 1024 комплексных точек). Химические сдвиги ядер Си N измерялись из известных Н химических сдвигов, используя непрямые отношения [325].
Определение степени включения метки 15N было проведено по ID- Н ЯМР-спектрам, накопленным без развязки от N. Каждая линия в амидной области ID- Н ЯМР-спектра, в случае 15М-мечеиого Zrv-IIB, представляла собой дублет с КССВ JHN 90 Гц. Так же в спектре наблюдались синглетные сигналы от н тЧ-групп. Отношение объема двух сигналов от- Н N-группы к объему сигнала от Н N и дало степень включения изотопа 15N в пептид, для нескольких HN-груші.
