Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы
1. Применения ЯМР-спектроскопии для исследования клеточного метаболизма 6
1.1. Энергетический метаболизм 8
1.2. Гликолиз и метаболизм углеводов 11
1.3. Цикл трикарбоновых кислот 14
1.4. Внутриклеточный редокс-потенциал 15
1.5. Метаболизм аминокислот 16
1.6. Метаболизм жирных кислот и липидов 17
1.7. Вода : 18
1.8. Одновалентные ионы 19
1.9. Двухвалентные катионы 20
1.10. Ферментативные кинетики 22
1.11. Измерение внутриклеточного рН 22
2. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса. Протонный магнитный резонанс ( Н-ЯМР) 24
3. Особенности адаптации и культивирования микроорганизмов в D2O 32
3.1. Микроводоросли 32
3.2. Бактерии 35
3.3. Дрожжи 37
3.4. Грибы 38
4. Общие положения о клеточных культурах и их культивировании 39
4.1. Пролиферация 41
4.2. Условия, необходимые для культивирования 42
4.3. Кривая роста и ее связь с метаболизмом 46
5. Медузомицет (чайный гриб) 48
5.1. Физические свойства и условия культивирования 51
5.2. Состав чайного гриба 55
5.3. Метаболизм чайного гриба 60
5.4. Антибактериальные свойства чайного гриба 63
Глава II. Экспериментальная часть
1. Объекты и методы исследований 68
1.1. Культивирование культур клеток фибробластов 68
1.2. Культивирование медузомицета 69
2. Техника ЯМР эксперимента 71
Глава III. Результаты и их обсуждение
1. Поиск корреляции между кривыми накопления метаболитов и кривой роста клеток 75
1.1. Культивирование клеток на стеклянной поверхности 79
1.2. Культивирование клеток на поверхности пластмассы 86
1.3. Культивирование клеток в коллагеновом геле 93
2. Исследование методом Н-ЯМР спектроскопии процессов роста и утилизации глюкозы медузомицетом 99
2.1. Культивирование медузомицета в средах на НгО 99
2.2. Культивирование медузомицета в средах на ОгО 107
3. Идентификация частично дейтерированных экзометаболитов при культивировании медузомицета в тяжелой воде 114
3.1. Отнесение спектральных линий изотопомеров ацетата и этанола 115
3.2. Определение степени дейтеризации экзаметаболитов 122
4. Анализ путей включения изотопов Ни С в экзометаболиты в ходе утилизации глюкозы медузомицетом 129
4.1. Состав метильной группы 133
4.2. Состав метиленовой группы 138
5. Идентификация минорных компонент экзаметаболитов медузомицета. Особенности ХН-ЯМР спектров при некоторых замещениях С и дейтерия 142
6. Влияние тяжелой воды на метаболизм симбиотического организма 158
6.1. Общая характеристика симбиотических отношений в медузомицете 159
6.2. Влияние включения дейтерия на ход обмена веществ 164
6.3. Особенности метаболизма симбиоза при адаптации 168
Заключение 181
Выводы 186
Список литературы 188
- Гликолиз и метаболизм углеводов
- Антибактериальные свойства чайного гриба
- Культивирование медузомицета в средах на ОгО
- Особенности метаболизма симбиоза при адаптации
Введение к работе
Актуальность работы. Стремительное развитие биофизики значительно расширило наши знания о физико-химических процессах и структуре биологических систем на всех уровнях организации живой материи - от молекулярного уровня до уровня целого организма. Прогресс в этой области знаний тесно связан с интенсивным взаимопроникновением идей, теоретических подходов и методов современной биологии, физики, химии и математики. Важное значение имеет разработка и совершенствование физических методов исследования биологических систем. Одним из таких методов является открытый полвека назад метод спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), постоянное совершенствование которого позволяет применять его для решения многочисленных проблем биологии.
В настоящее время для исследования образцов биологического происхождения в основном используют ЯМР на ядрах ,3С и J,P. Неинвазнвный характер ЯМР спектроскопии дает возможность соотносить полученные данные с физиологической и морфологической информацией об объекте, не разрушая его. Имеющиеся на данный момент методики позволяют исследовать метаболизм углеводов и фосфорилированных соединений, внутриклеточный окислительно-восстановительный потенциал, метаболизм аминокислот, лнпидов и жирных кислот, ферментативные кинетики, следить за мембранными градиентами ионов. Дополнительную информацию о ходе обмена вешеств, можно получить, используя селективное обогащение продуктов метаболизма стабильными изотопами, например углеродом-13 и дейтерием.
Однако ядерный магнитный резонанс на ядрах углерода, фосфора и дейтерия обладает рядом недостатков. В их числе низкая чувствительность J,P-ЯМР, длительные времена накопления ''С-ЯМР (не только из-за низкой чувствительности, но и из-за релаксационных характеристик) и неудовлетворительное разрешение гН спектров. Мы предположили, что часть этих недостатков можно преодолеть, используя для исследования метаболизма протонный резонанс. 'Н-ЯМР-спектроскопия является наиболее удобным методом с точки зрения регистрации спектров. Присутствие водорода во всех органических соединениях и высокая магнитная восприимчивость протонов делает метод универсальным для исследования всех аспектов клеточного метаболизма.
Отработка предложенных нами методик проходила на чистых линиях культур клеток - фибробластов. Они были выбраны из-за своей доступности, хорошей воспроизводимости и достаточной стандартности ростовых характеристик. На поверхности двумерного субстрати" в праЦйЯ^гюстаг^енн
Мое*. C-jj.b.- .,-; .
' ИМ, }{. Д. у
образуют монослой, легко открепляются, что позволяет подсчитывать их количество. Однако для дальнейшего их совершенствования понадобился менее требовательный к условиям культивирования объект исследований. На наш взгляд, таким объектом, позволяющим проводить более оперативные эксперименты в рамках ЯМР-лаборатории, является симбиотический организм - медузомидет. Этот малоизученный, ко интересный объект исследования, предоставляет уникальную возможность изучать не только особенности метаболизма в симбиозе, но и влияние внешних условий на связи и целостность симбнотической ассоциации. Таким образом, исследование медузомицета позволило не только полностью раскрыть потенциал разработанных нами методик 'Н-ЯМР-спекгроскопии, но также представляет практический интерес с точки зрения изучения благоприятных для человеческого организма и стимулирующих здоровье свойств этого организма.
Цель данной работы состояла в разработке новых методик исследования клеточного метаболизма методом 1Н-ЯМР-спектроскопни высокого разрешения и установлении зависимости параметров, определяемых из протонных спектров с параметрами цикла роста клеток.
Для выполнения данной цели решались следующие задачи:
-
Изучение методом Н-ЯМР утилизации глюкозы и производства экэометаболитов в чистых культурах клеток фибробластов. Установление связи между кинетикой накопления экзометаболитов и численностью клеток.
-
Изучение методом 'Н-ЯМР утилизации глюкозы и производства зкзометаболитов в медузомицете в Н^О н DjO.
-
Анализ путей образования дейтероизотопомеров этанола и ацетата в медузомицете по протонным спектрам.
-
Изучение по протонным спектрам перераспределения в экзометаболитах метки углерода-13 в случае использования изотопно-меченой глюкозы.
-
Изучение адаптации медузомицета к D:0 и низким температурам.
Научная новизна исследований состоит в том, что протонный резонанс известный, в основном, как метод структурного исследования молекул, был впервые применен для количественного определения концентрации как обычных, так и обогащенных изотопами углерода-13 и дейтерия экзометабол итов.
Практическая значимость работы заключается в том, что данные о физиологических и биохимических особенностях роста медузомицета могут
быть использованы В биотехнологии для получения биологически активных веществ и использования организма в медицине, а так же для получения дейтерированных соединений.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на 2-х конференциях молодых ученых, проходивших в Пушино в 1996 и 1997.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ в ведущих отечественных журналах и 2 тезисов.
Структура работы. Диссертация изложена на 201 стр. текста компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы (198 источников, из которых 158 зарубежных авторов). Работа содержит 13 таблиц и 45 рисунков.
Гликолиз и метаболизм углеводов
Хотя большинство путей метаболизма глюкозы и гликогена хорошо изучены, остаются некоторые неясности относительно их регулирования in vivo в различных органах. Для их изучения можно воспользоваться 1Н, 31Р, и 13С ЯМР. Как уже говорилось, !Н ЯМР наиболее чувствительный метод, но он обладает недостаточной селективностью. Хотя, в настоящее время, эта проблема решилась с появлением новых семейств сверпроводящих магнитов и увеличением разрешающей способности спектрометров. 31Р ЯМР может использоваться для определения промежуточных фосфорилированных продуктов гликолиза. Однако in vivo их концентрации обычно малы, а широкие и накладывающиеся друг на друга пики препятствуют разрешению сигналов. 1 С ЯМР обладает превосходной селективностью. Однако, из-за недостаточной естественной распространённости изотопа, чувствительность метода будет низкой, если не производить изотопного обогащения образца.
Гликоген. Концентрация гликогена довольно велика в скелетных мускулах, печени, и сердце нормально питающихся животных (до 400 мМ). Хотя гликоген - большая молекула (средняя Мг 270 х 10 ), она даёт относительно узкие пики в С ЯМР спектрах (Sillerud, Shulman, 1983). Сигнал аномерного Сі-углерода явно отличается от других пиков его типа в глюкозе, белках, и жирах и может использоваться для определения концентрации гликогена по ЯМР спектрам. Чувствительность метода может быть значительно улучшена введением 13С изотопно-меченой глюкозы. Хотя может использоваться глюкоза, изотопно помеченная в различных позициях, для исследований обычно выбирают [1-13С] глюкозу, потому что легче всего идентифицируется резонанс при Сі гликогена. Интересным эффектом такого подхода является возможность проследить за метаболизмом глюкозы. Поскольку глюкоза в растворе существует в равновесии её а и (3 аномеров, может быть изучена предпочтительность потребления одного аномера (Lohmeier-Vogel et al, 1986). Хотя считается, что в 13С ЯМР спектрах виден весь гликоген (Stevens et al., 1982), недавние эксперименты по двойному мечению показали, что приблизительно 30 % гликогена невозможно обнаружить (Brainard et al., 1989). Это может быть связано с существованием его различных пулов.
Сахарные фосфаты. В Р ЯМР спектрах большинства клеток обнаружено значительное количество фосфорилированного сахара. Клетки растений, например, содержат в большом количестве глюкозо-6-фосфат и фруктозо-6-фосфат. В клетках сердечной мышцы концентрации фосфорилированных метаболитов гликолиза слишком низки для идентификации с хорошей разрешающей способностью в 31Р ЯМР спектрах. В случае стресса, вызванного ишемией или подавлением гликолиза, в спектре появляются несколько пиков. К сожалению, обычно они слишком широки и плохо разрешены, чтобы можно было различить индивидуальные сахара.
Более узкая ширина линии может быть получена в экстракте клеток, что позволяет идентифицировать большой ряд фосфорилированных Сахаров и других промежуточных продуктов гликолиза (Lohmeier-Vogel et al, 1986). Анализ экстракта клеток посредством
Р ЯМР, показал, что дрожжи Candida tropicalis, использующие в качестве источника углерода ксилозу вместо глюкозы, производят относительно большой пул метаболитов, имеющих отношение к пентозофосфатному пути (Lundberg et al, 1990). Быстрое приготовление экстракта клеток после добавления глюкозы к голодающим Streptococcus lactis, позволяет наблюдать за превращением фосфоенолпирувата в фруктозо-1,6-дифосфат, происходящим за несколько секунд (Lohmeier-Vogel et al, 1986). Наблюдается эффект возмущения гликолитической активности. Например, добавление йодацетата приводит к подавлению глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы, и в конечном итоге, к накоплению в бактериальных клетках фруктозо-1,6-дифосфата, дигидроксиацетонфосфата, и глицеральдегидфосфата (Lohmeier-Vogel et al, 1986). Наоборот, когда к тем же самым бактериям добавляется игибитор енолазы, накапливался 3-фосфоглицерат (Lohmeier-Vogel et al, 1986). Подобные исследования проводились в широком диапазоне клеток и тканей (Navon et at, 1979; Brindle et at, 1988; Reibstein et at, 1986).
Большое внимание уделялось изучению методом 13С ЯМР утилизации в гликолизе изотопно-меченой глюкозы. Одна из наиболее интересных методик - наблюдение распределения метки между Сі и Сб позициями фруктозо- 1,6-дифосфата. В Saccharomyces cerevisiae по отношению метки в двух этих позициях были определены потоки через ферменты альдолазу и триозофосфатизомеразу и показано, что in vivo баланс ферментов близк к равновесию (den Hollander et at, 1979). Этим методом может быть получена информация относительно скорости потребления глюкозы и скорости образовани метаболитов. В то время как использование [1- С] глюкозы обеспечивает информацию относительно гликолиза, питание 13С помеченными субстратами типа аланина, пирувата и лактата, может обеспечивать информацию относительно глюконеогенеза.
Лактат. В то время как этанол - основной продукт анаэробного метаболизма дрожжей, лактат чаще встречается в животных клетках и тканях в результе анаэробиоза. При достаточной концентрации он может быть маркером ишемии. Н ЯМР позволяет измерять концентрации лактата в пределах 0.1 до 30 мМ. Однако трудность заключается в том, что резонансы жиров обычно перекрываются с резонансом лактата. Если исходить из предположения, что сигнал жиров останется постоянным, то изменения в интенсивности сигнала можно приписать лактату. Однако содержание жира может изменяться, поэтому необходимы более сложные подходы, например сочетание методов двойного резонанса и вычитания спектров, чтобы однозначно идентифицировать сигнал лактата. Такой подход повышения селективности обнаружения возможен и для других метаболитов.
Поскольку производство лактата происходит в условиях, при которых в клетке также накапливаются и Н+, существует связь между внутриклеточным рН и концентрацией лактата (Chang et at, 1990). Обычная методика предполагает для получения этой информации одновременную регистрацию Р и Н ЯМР спектров. Так была показана прямая зависимость между уровнями лактата и внутриклеточным рН (Chang et at, 1990), однако замечено, что они не всегда регулируются согласованно. Это довольно интересно, поскольку концентрации лактата и Н - слишком различаются ( 10 и 10" М, соответственно). Разница, в свою очередь, может объясняться эффектом внутриклеточных буферов, которые могут поглощать большинство протонного заряда. К таким буферам относится ряд соединений типа гистициновых остатков в белках, карнозина, неорганический фосфат и АМФ. В некоторых случаях, например в скелетных мышцах, методику можно значительно упростить, поскольку имеется возможность одновременно из спектров 1Н ЯМР определять рН из сдвига карнозина и концентрацию лактата.
Антибактериальные свойства чайного гриба
В советской литературе встречалось довольно много работ, посвященных антибиотическим свойствам чайного гриба которые исследовались in vitro и in vivo как в ветеринарии, так и медицине (Hesseltine, 1965). Продукты ферментирования медузомицета, накапливающиеся в культуральной жидкости уже давно используются в народной медицине. В 1957 году сотрудниками Ереванского зооветеринарного института было доказано, что настой чайного гриба характеризуется специфическими антибиотическими свойствами. Выделенные ими из настоя антибиотики получили название бактериоцидина и препарата «ММ» (Коновалов и др., 1959). Препараты обладают бактериостатическим и бактерицидными свойствами и широким антимикробным спектром действия. Особенностью этих препаратов является их способность оказывать действие как на грамположительные, так и на грамотрицательные бактерии. Авторами отмечается, что терапевтическое значение настоя не ограничивается этими свойствами, он оказывает благоприятное действие и при лечении болезней не инфекционного характера (Барбанчик, 1957; Даниелова, 1959).
Атибиотическая активность настоя чайного гриба исследовалась в результате его воздействия на Escherichia coli (Сукиасян, 1954; Даниелова, 1959) и «золотистый стафилококк» (Staphylococcus aureus) (Коновалов и др., 1959). Показано, что в первые 15 суток культивирования гриба, выращиваемого на 5% и 10% водных растворах сахарозы, в культуральной жидкости накапливается одинаковое количество антибактериальных веществ. То же наблюдается и к концу третьей недели культивирования. Настой полностью задерживает развитие золотистого стафилококка при разведении 1:50 и частично при 1:70н-80. При дальнейшем культивировании в 10% растворе сахарозы активность настоя увеличивается по разным данным от 1.4-НІ.5 раз (Коновалов и др., 1959) до 2 раз (Даниелова, 1959). В 5% растворе сахарозы активность не поднималась выше титра 1:50. Наиболее активная культуральная жидкость получается на питательной среде с добавлением глюкозы, несколько слабее - с сахарозой (Даниелова, 1959). Авторами было установлено активное участие уксуснокислых бактерий в выработке антибактериального вещества. Добавление в настой гриба этилового спирта на ранних стадиях развития организма, когда утилизация Сахаров еще не происходит в должном объеме и содержание собственного этанола в среде низкое, приводит к активизации бактерий и интенсификации выхода антибиотика.
В западной литературе медицинскому аспекту применения чайного гриба уделялось значительно меньше внимания. Тем не менее, за период с 1852 по 1961 года имеется около 264 ссылок, относящихся к медузомицету, часть из которых касается антибиотических свойств и применения в медицине (Stadelmann, 1961). Всплеск интереса к этому организму во всем мире произошел в наше время благодаря сочетанию его освежающих и стимулирующих здоровье свойств и тому, что его можно выращивать дома (Frank, 1990). Широкую известность чайному грибу придал тот факт, что его лечебный эффект описан не только в научных, но и в научно-популярных журналах и периодической прессе (O Nell М., 1994; Jacobs, 1995). Сообщается, что настой улучшает пищеварение, является легким слабительным (Mayser et al., 1995), может снижать кровяное давление, излечивать артриты (Steinkraus et al, 1996), отмечается его иммуностимулирующее действие (Steinkraus et al, 1996; Mayser et al, 1995; Kozaki, et al, 1972; Harisch, 1991). Имеются даже сообщения об использовании его для лечения раковых опухолей, но лечебный эффект чайного гриба в данном случае не доказан (Steinkraus et al., 1996; Mayser et al, 1995). На Тайване медузомицет тоже давно известен своими лечебными свойствами, но прямых научных доказательств тому нет (Lui et al, 1996).
Несмотря на то, что в западной прессе не нашел подтверждения факт наличия в культуральной среде чайного гриба особых субстанций, подобных найденным советскими учеными, признаются антимикробные и антибиотические свойства самого настоя. Подтверждается подавляющее действие настоя на развитие патогенных микроорганизмов и его лечебный эффект. В отношении причин такого действия оценки расходятся. Последний, например, связывают с высоким содержанием глюкороновой кислоты, витаминов В1, В2 и В6 и некоторых других кислот (Blanc, 1996; Steiger, Steinegger, 1957; Stadelmann, 1961; Hauser, 1990). Глюкороновая кислота обладает детоксикационными свойствами, связывая в печени вредные вещества и выбрасывая их посредством экскреторной системы (Blanc, 1996). Другие авторы приписывают антимикробную активность уксусной и глюконовой кислотам и этанолу (Lui et al., 1996, Steinkraus et al., 1996; Adams, Hall, 1982; Kurita, Koike, 1983; Matsuda et al, 1994). По их данным, присутствие в настое этих веществ подавляет развитие Salmonella typhi, Shigella sonnei, Escherichia colt, Staphylococcus aureus (Hitokoto et al., 1978).
Уксусная кислота используется в рационе человека уже более 10000 лет, с тех пор, как было изобретено вино. Известно, что она использовалась для лечения многих болезней. 0.5% раствор ацетата является бактериостатическим для многих бактерий, 1% раствор использовался как дезинфецирующий при хирургических операциях, а 5% -является бактерицидным для многих организмов (Hesseltine, 1965). Использование настоя чайного гриба, содержащего уксусную кислоту, имеет смысл для лечения желудочно-кишечных заболеваний. В этом случае констатируется его антибиотическая активность в отношении Helicocobacter pylori, грамотрицательных бактерий, представителя микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека, который образует колонии на слизистой оболочке желудка и, как полагают, ответственен за возникновение гастрита, язвы желудка и двенадцатиперстной кишки и карциномы (Steinkraus et а/., 1996).
Еще одной биологически активной субстанцией, присутствующей в настое чайного гриба, является чай. Известно, что он содержит фенолы, которые в той или иной степени являются бактерицидными. Антимикробная активность может быть связана с высокой концентрацией танина, одного из основных компонентов черного чая. Было показано, что он подавляет развитие Agrobacterium timefacient (Hesseltine, 1965). Экстракт неферментированного черного чая (200 г. чая на 1 л. воды) подавляет развитие колоний Н. pylori. Экстракт убивает Н. pylori (106 клеток/мл) за 5 часов, Campylobacter jejuni за 4 часа (Diker, Hascelik, 1994). Нагрев не оказывает влияния на бактерицидную активность чая. Экстракт неферментированного чая такой же концентрации обладает бактерицидной активностью в отношении Staphylococcus aureus , Vibrio parahaemolyticus (Toda et al., 1989) и Vibrio cholerae (Toda et al, 1991). Однако концентрация чая, используемого для приготовления питательной среды для медузомицета значительно меньше (от 0.5 до 1.5 %). В этом случае активность танина в отношении бактерий значительно меньше и по эффекту сравнима с действием 1 % уксусной кислоты в ферментированном настое. Нейтрализованный настой не обладает антибиотической активностью. Учитывая вышесказанное, можно сделать вывод, что с точки зрения антимикробной активности ацетат является доминирующей субстанцией.
Однако общий целебный эффект чайного гриба, вероятнее всего, формируется в результате комплексного воздействия на организм целого ряда веществ: органических кислот, ферментов, содержащихся в чае кофеина и танина, витаминов В, С, Р, иммуностимуляторов. Этот эффект был подтвержден работами бразильских ученых, ссылающихся на более чем 400 случаев применения «искусственной кожи», приготовленной на основе пленки медузомицета в дерматологии и пластической хирургии (Fontana, et al, 1990, 1991). Были показаны неоспоримые преимущества использования этого препарата в качестве временной замены кожного покрова и даже в таких тяжелых случаях как ожоги второй и третьей степени, пересадка кожи. Гистологические исследования процессов восстановления кожи, проводимые на крысах, показали, что в заживающей ране увеличивается пропорция фибробластов, коллагена, кровеносных сосудов, если используется природная целлюлозная пленка. Восстановление эпителия завершается за 21 день.
Однако, несмотря на все положительные качества, в медицине и биотехнологии чайный гриб применяется довольно слабо. Основная причина заключается в том, что содержание в ферментированном настое активных веществ, обеспечивающих лечебное действие, очень невелико. В связи с этим приобретает значительную актуальность изучение физиологических функций чайного гриба, обуславливающих накопление в среде антибактериальных и полезных для организма веществ, поиск блокираторов и интенсификаторов производства того или иного компонента. Поскольку организм обладает высоким адаптационным потенциалом, представляется возможным варьировать внешние параметры в очень широких пределах и даже подвергать его стрессовым воздействиям. Необходимо выяснить закономерности поведения биосинтеза этих субстанций в зависимости от изменения условий среды обитания комплекса микроорганизмов, составляющих изучаемый симбиоз. В результате ожидается получение заранее прогнозируемого выхода требуемых веществ, что позволит использовать объект в биотехнологии. В этом плане, важной задачей является изучениесамого феномена симбиоза дрожжей и уксуснокислых бактерий, являющихся членами этой ассоциации. Между ее компонентами возникают плотные клеточные контакты, и через них осуществляется передача промежуточных продуктов метаболизма. Вероятно, именно эта особенность медузомицета и определяет отличительные свойства его метаболизма и может служить наиболее эффективной мишенью для корректирующих воздействий. И, наконец, для выявления закономерностей метаболизма необходимо дальнейшее изучение и стандартизация состава медузомицета, поскольку спектр организмов, полученных из разных источников, а следовательно и его свойства, заметно отличаются.
Культивирование медузомицета в средах на ОгО
Тяжелая вода и ее действие на организмы привлекли внимание исследователей вскоре после открытия дейтерия в 1932 г. В большой степени это связано со способностью 100%-го замещения водорода на свой изотоп и особой ролью воды в организме. К середине нашего столетия появилось много работ, посвященных антиденатурирующему и стабилизирующему действию тяжелой воды на белки, животные и растительные клетки и микроорганизмы. На основании полученных данных об аномально высокой чувствительности живых организмов к замещению в среде Н на D был сделан вывод о торможении клеточного деления, роста и других процессов жизнедеятельности клеток в D2O (Денько, 1970; Лобышев, Каличенко, 1978; Рогинский, Шноль, 1963). Доказано, что тяжелая вода, в зависимости от ее концентрации вызывает более или менее значительные сдвиги в метаболизме клеток. Однако изучение биохимических и физиологических особенностей роста микроорганизмов в тяжелой воде продолжает быть актуальной задачей, как в плане изучения роли воды в биологических процессах и влияния D2O на рост клеток, так и для получения путем биосинтеза различных биологически важных дейтерированных соединений.
Предметом данного исследования был медузомицет, выращенный в питательной среде, приготовленной на протонированной глюкозе и D2O. Изучалась адаптация данного организма к тяжелой воде и ее влияние на скорость утилизации глюкозы и синтез промежуточных метаболитов. Спектры были получены на ЯМР спектрометре «Bruker» WM-400.
Медузомицет выращивался на среде, содержащей !Н-глюкозу разной концентрации и настой черного чая на 98% D2O. В целом, качественно картина роста организма не отличалась от культивирования на обычной воде. В спектрах !Н-ЯМР настоя чайного гриба так же наблюдались 3 группы сигналов, появляющихся на различных стадиях культивирования: глюкозы (3+4 ррт), этилового спирта (1.2 и 3.6 ррт) и уксусной кислоты (2 ррт)(рис. 15). В проведенных экспериментах исследовалась динамика изменения концентраций данных веществ по спектрам ЯМР высокого разрешения (Юркевич и др., 1996).
Опыты показали, что при культивировании медузомицета в среде на D2O с 0.03 М глюкозой наблюдается более длительная лаг-фаза (25+30 час), чем в случае полностью протонированной среды (лаг-фаза порядка нескольких часов). После нее в среде для культивирования начинает уменьшаться концентрация глюкозы и увеличиваться -этилового спирта (рис. 16, и рис 25). Кроме того, именно к концу первых суток культивирования спектральные линии этанола приобретают уширенный мультиплетный характер (рис. 17 и рис. 21), что говорит о включении дейтерия в необмениваемые позиции этого метаболита (Ben Li Shang, Yunianta, et al, 1995; Crespi, 1977).
Сравнительное изучение роста медузомицета в средах, приготовленных на Н О и D2O, показывает, что кинетики накопления промежуточных метаболитов в кондиционированной среде имеют сходный характер. Для культуры в D20 можно выделить участок активного потребления глюкозы и роста концентрации этилового спирта (0+270 час), участок уменьшения концентрации этанола и роста - ацетата (270+360 час.) и участок потребления ацетата ( 360 час). Потребление глюкозы в среде на DaO идет медленнее, чем в легкой воде, спадая до минимального значения к 270 часам, а не к 120, как в Н2О. Кривая изменения концентрации этанола имеет вид нарастающей экспоненты с плато в районе 200+250 часов и явным максимумом на 270 час Для культивирования на НгО этот пик наблюдался в районе 120 часов. Период удвоения концентрации этанола на экспоненциальном участке составляет: td=30 час. Аналогичный показатель для падения кривой утилизации глюкозы: td=26 час. Скорости этих двух процессов практически одинаковы.
Эксперимент показал, что, как и для культивирования в простой, так и в тяжелой воде, процессы утилизации глюкозы и производства этанола находятся в противофазе. Временной интервал между минимумами концентрации сахара и максимумами ацетата для простой и дейтерированной воды одинаковые и составляют около 150 часов. Однако появление максимума концентрации спирта в дейтерированной среде для культивирования значительно запаздывает как по времени, так и по абсолютной величине относительно контроля в НгО. Данные результаты, на наш взгляд, говорят о торможении роста медузомицета и метаболизма глюкозы, отмечаемых для множества организмов в D2O (Денько, 1970; Лобышев, Каличенко, 1978; Рогинский, Шноль, 1963). Значительная разница (в 2.5+3 раза) в объемах производства этилового спирта может также объясняться образованием изотопомеров этанола в результате вовлечения D2O в процессы гликолиза (Ben Li Shang, Yunianta, et al, 1995). Наблюдается частичное дейтерирование уксусной кислоты, максимум концентрации которой наблюдается через 360 часов после начала культивирования. Однако, период удвоения ее концентрации составляет 20+25 часов, как и в среде на НгО. То есть запаздывания, аналогичного глюкозе не наблюдается.
Увеличение начальной концентрации глюкозы в среде для культивирования до 0.09 М не приводит к изменению скорости потребления глюкозы, однако, ее концентрация избыточна и к 400 часам после начала культивирования в спектрах наблюдается остаточный сигнал этого сахара, соответствующий концентрации 0.04 М/л (см. рис. 18а). Положение максимума концентрации этанола и ее значение остаются почти такими же, как и для низкой начальной концентрации глюкозы. Это может объясняться тем фактом, что к этому моменту (270+280 часов) была утилизирована лишь 1/3 общего количества сахара. Однако в этом эксперименте увеличивается лаг-фаза и скорость производства этанола, а концентрация уксусной кислоты достигает максимального значения на 50 часов позже (см. рис. 18б,в). Видимо, большая начальная концентрация сахара угнетающе действует на дрожжи, что подтверждается литературными данными (Kotitschke et al., 1995).
Не менее важным результатом проведенных нами опытов по выращиванию чайного гриба на дейтерированной воде стал следующий эффект. При начальной концентрации глюкозы 0.03+0.09 М/л, конечные значения концентраций промежуточных продуктов метаболизма не превышают 0.025+0.03 М/л. Принимая во внимание, что из каждой молекулы глюкозы должны образовываться 2 молекулы этанола, налицо «потеря» около 50% измеренных интенсивностей сигналов экзометаболитов в Н-ЯМР спектрах. Единственное логичное объяснение, что «невидимой» для ЯМР становиться часть дейтерированных метаболитов. Таким образом, разница между реальным и измеренным значением концентраций промежуточных продуктов обмена веществ коррелированна со степенью их дейтеризации.
Приведенные выше результаты позволяют рассмотреть эффект влияния тяжелой воды на рост чайного гриба. Предположение о частичном дейтерировании экзаметаболитов в необмениваемых положениях подтверждается анализом спектров Н-ЯМР спектров высокого разрешения, где сигналы этанола и ацетата приобретают уширенный и более сложный мультиплетный характер из-за электрического квадрупольного момента дейтрона и протон-дейтронного взаимодействия (Wutrich, 1976; Коксон, 1975). Нарис. 17 видно, что изменение метильной спектральной линии этанола происходит в течение первых суток культивирования, то есть в течение лаг-фазы. Было показано, что при культивировании данного организма на среде с Н-глюкозой и D2O наблюдается более продолжительная лаг-фаза (25-ьЗО час.) по сравнению с контролем в НгО. Эти данные позволяют предположить, что именно в течение лаг-фазы и логарифмической фазы роста происходит адаптация медузомицета к D20. Из результатов ЯМР-спектроскопии следует, что в этот период происходит частичное дейтерирование промежуточных продуктов метаболизма. Поскольку наблюдается лишь замедление утилизации глюкозы и производства этанола, а скорость производства ацетата остается примерно той же, логично предположить, что наиболее драматические изменения, связанные с заменой протонов на дейтроны, происходят во время гликолиза. Таким образом, динамика переработки глюкозы в этиловый спирт на этой стадии может служить маркером процесса адаптации.
Наши результаты показывают торможение процессов метаболизма в культуре чайного гриба, аналогичное для любого организма в D2O (Денько, 1970). Однако в чайном грибе обнаружена способность к быстрой адаптации (в течение суток) к новой среде, не свойственная большинству микроорганизмов. Так, среди микроводорослей, используемых для получения дейтерированных соединений путем биосинтеза, наиболее быстрая адаптация наблюдается для Chlorella vulgaris. На среде, содержащей обычную глюкозу и 90% D20 рост данного организма начинался только после лаг-фазы в течение 6 суток (Walker, Syrett, 1959). Адаптация других штаммов протекает от 10 суток до двух месяцев. Быстрая адаптация выделяет медузомицет из ряда других микроорганизмов, и позволяет использовать его в дальнейшем как для получения дейтерированных соединений, образуемых в процессе его роста, так и для изучения биологически важного феномена адаптации.
Особенности метаболизма симбиоза при адаптации
Нами была исследована динамика изменения а-доли НгО в среде (рис. 43). Она имеет тенденцию к росту со временем развития культуры. Рост связан как с увеличением концентрации протонов в среде вследствие обмена с ней протонов ОН групп глюкозы, так и с обменом водными парами с атмосферой. Несмотря на то, что верхняя граница жидкости покрыта телом медузомицета - плотной «вуалью», газовый обмен оказывается близким к контрольной среде - простой смеси тяжелой и легкой воды - аналогичной, применяемой для развития организма. Коэффициент наклона прямой в кондиционированной среде составляет 3.97 10"4 при г2=0.998, а в контроле - 4.7 10"4 при г2Ю.998. По-видимому, тело медузомицета немного ограничивает обмен парами воды со средой, как это следует из сравнения коэффициентов. Вернемся к упомянутой тенденции меняться со временем относительной интегральной интенсивности Н-компоненты ацетата (рис. 41). Наблюдается явный рост исследуемого параметра. Линейная регрессия дает близкие величины коэффициентов наклона: 2.9 10"4 для основного (Но) и 3.1 10"4 для сателлитного (Hs) сигналов. Рост этих компонент, вероятно, происходит за счет увеличения доли НгО. Сопоставление коэффициентов наклона для зависимостей, упомянутых выше, показывает, что протонирование Н-компоненты ацетата происходит медленнее, чем растет доля Н2О в среде.
Поскольку газовый обмен среды ограничен, а баланс протонов и дейтронов в среде и метаболитах должен соблюдаться, следует предположить способность медузомицета накапливать некоторый «резерв» среды в своих внутренних областях и пытаться сохранить его более или менее постоянным. Это может относиться, конечно, и к продуктам, необходимым для метаболизма. Видимо, именно этим надо объяснить поведение кривых роста концентраций субстрата и экзометаболитов (Кутышенко, Юркевич, 2001), когда достаточно быстро (около 120 часов) потребляется вся глюкоза, а потом ее трансформация продолжает идти еще такое же время.
Заслуживает внимания факт наличия в настое чайного гриба янтарной кислоты. Концентрация данного вещества невелика и составляет всего 2.5% от общего количества ацетата (Кутышенко, Юркевич, 2001). Как известно, это соединение образуется в цикле трикарбоновых кислот, ферменты которого локализованы в митохондриях. Поскольку дрожжи являются факультативными анаэробами, то метаболизм дыхательного типа может быть реализован ими только в момент пересева, когда питательная среда насыщена кислородом и тело гриба не ограничивает ее обмен с воздухом. Однако период этот очень короткий (всего несколько часов). Большую же часть жизненного цикла анаэробный гликолиз не требует работы митохондрий, поэтому в дрожжах они могут терять свои функции и дедифференцироваться (Маргелис, 1983). Как бы то ни было, концентрация сукцината слабо растет со временем. Ее плавный характер говорит об отсутствии корреляции с этапами роста медузомицета.
Строго аэробными микроорганизмами в симбиозе являются уксуснокислые бактерии. Однако цикл трикарбоновых кислот в них или отсутствует или реализован частично (De Ley et al, 1984; "The Prokariotes ", 1981; Gossele et al, 1983a, 1983b; De Ley, 1961; Le et al, 1964; Greenfield, Claus, 1972). Косвенным доказательством этого стал эксперимент с 13С-меченной глюкозой. Никаких возмущений Н-спектра, связанных с включением этого изотопа в молекулу сукцината обнаружено не было (Кутышенко, Юркевич, 2001). Это говорит о том, что либо продукты меченой глюкозы не включаются в цикл Кребса. Либо в каждом случае (когда применяется [1- С]-, [2- С]-, [6- С]-глюкоза) метка попадает в центральную позицию, равноудаленную от всех протоносодержащих групп. Это маловероятно само по себе. Кроме того, в ходе цикла происходит «движение» углеродов по молекуле. То есть, каждый раз два углеродных атома покидают цикл в форме СОг, а два других углерода включаются в цикл при конденсации ацетильного компонента (из ацетил-СоА) с оксалоацетатом. Атомы углерода, покидающие цикл отличны от тех, которые в него включились. Поэтому, должно наблюдаться «движение» метки и ее присутствие в разных позициях.
Перечисленное выше доказывает, что в медузомицете цикл трикарбоновых кислот отсутствует или реализуется не полностью. Поскольку сукцинат не является типичным экзометаболитом, его присутствие во внеклеточном пространстве дает основание рассматривать его не просто как промежуточный продукт этого цикла. Вероятнее всего он выполняет регуляторные функции или функции переносчика. Его свойство проникать через мембраны позволяет ему, например, переносить метаболиты между членами ассоциации, находящимися в состоянии ДЭС. Само его присутствие в настое чайного гриба может быть результатом образования и распада таких ассоциаций, когда межклеточный контакт становится разомкнутым и открытым для выхода подобного рода молекул.
Одним из таких соединений является глицерин. При пересеве тела медузомицета на дейтерированную среду, происходит очень быстрая адаптация симбиоза к новым условиям (Юркевич, Кутышенко, 1999). В ходе этого процесса появляется вещество, идентифицированное нами как глицерин (Кутышенко, Юркевич, 2001). Концентрация его увеличивается по мере роста организма. При повторном посеве на свежую дейтерированную среду, поступление этого вещества замедляется, а затем, прекращается. Однако точно такую же картину можно наблюдать в обычной воде, если ввести полностью дейтерированную глюкозу. Хотя глицерин считается обычным экстрацеллюлярным продуктом метаболизма дрожжей (Залашко М.В., Пидопличко, 1979), однако в нашем случае, его появление связано с экстремальными условиями роста медузомицета. Глицерин выходит из клеток в среду только в адаптационный период. Известно, что глицерин образуется по схеме Эмбдена-Мейергофа-Парнаса. При этом один из промежуточных продуктов - дигидроксиацетонфосфат, восстанавливается в глицерол-3-фосфат, который гидролизуется фосфатазой с образованием глицерина. Поскольку используется D2O, то адаптация к ней приводит к замещению протонов на дейтроны в производных глюкозы в ее биохимических превращениях. Эти места замещения определены и соответствуют 1, 2, 5, 6 положениям при углеродных атомах глюкозы. После ряда превращений образуются изотопомеры дигидроксиацетонфосфата и, соответственно, глицерина, что и подтверждается в наших экспериментах (Кутышенко, Юркевич, 2001). Аналогичные преобразования происходят в случае дейтерированной глюкозы и обычной воды. Из-за обмена со средой происходит замена некоторых дейтронов на протоны, но в итоге получаются те же самые изотопомеры, попадающие в цикл, как и в первом случае. Таким образом, весь глицерин, а он действительно содержит дейтерий хотя бы в одном из трех возможных положений (Кутышенко, Юркевич, 2001), исключается из цикла дальнейших преобразований и выходит из клетки.
Особенность этого процесса заключается еще и в том, что в экстрацеллюлярное пространство не выходит фосфорсодержащих производных ни глицерина, ни каких-либо других метаболитов. При этом производство этанола и ацетата продолжается, то есть в клетках продолжается обмен веществ. Появление же глицерина следует считать результатом воздействия на нормальное течение метаболических процессов изменения изотопного состава окружающей среды. Значит, симбионты продолжают функционировать и нарушения клеточной целостности не происходит. Однако, вероятнее всего, происходит нарушение целостности всей симбиотической ассоциации как единого целого. Распад симбиоза является вполне вероятным событием. Его стабильность зависит от множества факторов, в числе которых как время, так и интенсивность воздействия окружающей среды. Скорее всего, в организме постоянно происходят процессы возникновения и распада ассоциаций отдельных клеток, но основная их масса находится в стабильном состоянии с точки зрения установившихся симбиотических отношений. Логично предположить, что в экстремальных условиях эти процессы принимают драматический характер. При распаде симбиотической ассоциации утрачиваются и все метаболические функции, характерные для нее. Если какой-либо метаболический путь реализуется частично одним, а частично другим партнером, то утрата или повреждение одного из партнеров может привести к накоплению характерных промежуточных продуктов (Маргелис, 1983). Одним из них, вероятнее всего, и является глицерин. После окончания адаптации к новым условиям единство организма восстанавливается. При этом возвращаются его функции и выработка глицерина прекращается. Оценивая отношение максимальной концентрации этого вещества к максимальным концентрациям основных метаболитов, следует опять таки отметить, что в такой особо тесной форме симбиотических отношений участвуют не более 10% всех микроорганизмов медузомицета.
Полученные нами экспериментальные данные позволяют сделать следующие выводы. 1) Как следует из одинаковых результатов прямого и «зеркального» экспериментов, эффекты влияния дейтерия происходят в результате воздействия на конкретный участок (или участки) гликолитического пути. Не исключено, что дейтерированная среда обладает более широким спектром действия на микроорганизмы (Рогинский, Шноль, 1963; Денько, 1970). Но торможение роста и особенности утилизации субстрата, наблюдаемые нами при адаптации, возникают из-за атаки на наиболее уязвимое место гликолиза - своеобразную «мишень». 2) Место атаки дейтронов, приводящей к заметному сбою в метаболизме - уровень образования триозофосфатов. Ко второму заключению мы пришли так же и из анализа аномального включения метки 13С из глюкозы в этанол и ацетат. Кроме того, нами было показано, что шаг окисления глицеральдегид-3-фосфата в 1,3-дифосфоглицерат значительно замедляется, если в среде присутствует D2O (Юркевич, Кутышенко, 2001). Таким образом, наиболее важным и определяющим шагом гликолиза для членов ДЭС-ассоциации медузомицета является шаг превращения двух фрагментов глюкозы в треозы. Особенности их дальнейшей трансформации определяют особенности метаболизма динамического экстрацеллюлярного эндосимбиоза.
Дополнительные данные, необходимые для понимания интеграции функций партнеров этого симбиоза были получены в ходе так называемого «холодового эксперимента». Для него был выбран медузомицет, адаптированный для роста в среде с максимально высокой концентрацией тяжелой воды. В качестве источника углерода применялась [6-3С]-глюкоза. Сразу после засева культиватор был перенесен в холодную комнату (t=2C). Через 72 часа появился очень небольшой сигнал ацетата, а через 96 часов он немного увеличился и появился сигнал этанола. Эти сигналы не содержали С-сателлитов, что означает отсутствие метаболизма, связанного с потреблением глюкозы из среды. В это же время культиватор был помещен в обычные для наших экспериментов температурные условия (t=23 - 25С). На рис. 44 представлена зависимость от времени относительной интегральной интенсивности Н-компоненты основного и сателлитных сигналов ацетата. А на рис. 45 зависимость от времени отношения интегральных интенсивностей сателлитных сигналов к основному для D- и Н-изотопомеров ацетата для проводимого эксперимента.
