Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 9
1.1 Историческая справка 9
1.2 Общая характеристика актиномицинов 10
1.3 Структура комплекса АМД - ДНК 13
1.4 Специфика взаимодействия АМД с ДНК 16
1.5 Энергетика взаимодействия АМД с ДНК 17
1.6 Кинетика взаимодействия АМД и ДНК 21
1.7 Выражение Камлета-Тафта: Линейное соотношение энергии сольватации 22
1.8 Время жизни и поляризация флуоресценции. Уравнение Левшина -Перрена 41
1.9 Флуориметрия в остановленном потоке (stopped flow) 43
1.10 Флуоресцентная корреляционная спектроскопия 45
1.11 Уравнение Фредгольма первого рода 52
1.12 Уравнение гетерогенной адсорбции Фрейндлиха 57
2 Материалы и методы 59
2.1 Используемые реактивы 59
2.2 Регистрация спектров флуоресценции 7аАМД и его комплексов с ДНК, измерение поляризации и времени жизни флуоресценции 59
2.3 Корреляционный анализ 60
2.4 Флуориметрия в остановленном потоке 61
2.5 Поиск оптимального алгоритма обработки КФ и их последующий анализ 61
2.6 Поиск оптимальной по энергии структуры 7аАМД при помощи молекулярной динамики 62
2.7 Измерения на установке ConfoCor 63
2.8 Уравнение гетерогенной абсорбции Фрейндлиха 64
2.9 Устранение влияния сорбции/десорбции 7аАМД на ход эксперимента. 64
3 Результаты и обсуждение 65
3.1 Характеристика актиномицина и его комплексов с ДНК в тяжелой и обычной воде на основе спектральных данных 65
3.2 Молекулярная динамика комплекса 7аАМД сНР1 66
3.3 Анализ сольватохромного эффекта 7аАМД 69
3.4 Исследование кинетики взаимодействия 7аАМДи ДНК 84
3.5 Анализ корреляционных функций 90
3.6 Измерение поляризации флуоресценции и ФКС на установке ConfoCor 96
Заключение 109
- Общая характеристика актиномицинов
- Флуоресцентная корреляционная спектроскопия
- Поиск оптимального алгоритма обработки КФ и их последующий анализ
- Исследование кинетики взаимодействия 7аАМДи ДНК
Введение к работе
Актуальность
Актиномицины - группа антибиотиков, образуемых различными актиномицетами, обладающих антибиотическим действием против грамположительных бактерий и некоторых грибов. Антимикробные свойства актиномицина нашли применение в биохимических и микробиологических исследованиях. В медицинской практике из актиномицинов широкое применение получил только актиномицин Д, реже используется актиномицин Ц и прочие актиномицины. Поэтому главным объектом исследования данной работы является именно актиномицин Д. Актиномицин Д (АМД) успешно применяется в противоопухолевой терапии с сороковых годов прошлого столетия и по сей день. Применяют АМД самостоятельно или, чаще, в сочетании с другими лекарственными средствами (адриамицин, циклофосфан и др.) и лучевой терапией при трофобластической болезни {например, хориокарцинома матки), опухоли Вильмса и саркоме Эвинга, рабдомиосаркоме у детей, ретикулосаркоме, опухоли Юинга, злокачественных опухолях яичка, лимфогранулематозе, при комбинированной химиотерапии диссеминированной меланомы и других опухолях [J. Verweij, 1996]. Действие АМД основано на том, что он прочно связывается с ДНК, блокируя, тем самым, полимеразную активность. АМД и его производные способны блокировать обратную транскриптазу (например, вируса иммунодефицита человека), специфически связываясь с одноцепочечной ДНК, ДНК/РНК гибридами [М. Shinomiya, 1995]. Недавно обнаруженная способность актиномицина специфически связываться с ТТ7ЦАГ повторами [М.-Н. Нои, 2002] позволяет надеяться, что актиномицин найдет свое применение и при лечении ряда наследственных неврологических заболеваний: хорее Гентингтона, миотонической дистрофии, спиноцеребральной атаксии, миотонической атрофии спинного и продолговатого мозга. Вместе с тем, при применении препарата возможны множественные побочные эффекты: тошнота, рвота, повышение температуры тела, стоматит, кожные высыпания, алопения, лейкопения, тромбоцитопения, панцитопения. При попадании АМД под кожу развивается некроз кожи.
В настоящее время ведётся активный поиск более эффективных в терапевтических целях и менее токсичных производных актиномицинов [Е.Б, Морошкина, 2000]. Вышесказанное, в контексте роста числа онкологических заболеваний [A. Jemal, 2004], объясняет повышенный интерес к изучению физико-химических свойств и деталей механизмов действия противоопухолевых агентов.
Наиболее вероятный механизм действия АМД состоит в том, что он связывается с высокой специфичностью с уже существующими или возникающими в результате тепловых флуктуации одноцепочечными участками ДНК, содержащими гуанин и способными образовывать шпилечные структуры, стабилизирует их в конформации шпильки. Низкая константа диссоциации АМД из комплекса с ДНК (порядка 100 нМ) и низкая скорость диссоциации комплекса (с характерным временем порядка 100 с) объясняют эффективность блокирования ДНК-матрицы для считывания полимеразами. Этот механизм объясняет также способность АМД блокировать обратную транскриптазу [R.L. Rill, 1996].
Методы исследования
Большинство современных моделей межмолекулярного взаимодействия базируются на данных рентгеноструктурного анализа и ядерного магнитного резонанса (ЯМР), С помощью ЯМР исследуются достаточно концентрированные растворы. Для проведения рентгеноструктурного анализа, как известно, исследуемое вещество должно находиться в кристаллическом состоянии. Для клинического использования производных АМД важно знать механизм их действия в физиологических (микро- и субмикромолярных) концентрациях. Изучение механизма межмолекулярных взаимодействий при низких концентрациях позволяет исключить влияние кооперативных и неспецифических эффектов. Результаты ЯМР и рентгеноструктурного анализа, тем не менее, могут быть взяты за основу для построения модели взаимодействия ДНК - противоопухолевое вещество в растворе. Необходимо отметить, что исследования в области низких концентраций могут быть сопряжены с рядом технических трудностей, таких как неспецифическая адсорбция, уменьшение соотношения сигнал/шум,
Флуоресцентные методы обладают гораздо большей чувствительностью и позволяют проводить исследования в диапазоне микро- и даже наномолярных концентраций исследуемого вещества. У АМД имеется флуоресцирующее аминопроизводное — 7-аминоактиномицин Д (7аАМД) с идентичным биологическим действием [Y.-C. СЫао, 1979]. Оно и являлось основным объектом настоящего исследования. Для изучения взаимодействия 7аАМД с ДНК нами использовались стационарная флуорометрия и флуорометрия в остановленном потоке, флуоресцентная корреляционная спектроскопия; производились измерения времени жизни и поляризации флуоресценции; исследовался сольватохромный эффект.
Как относительно малоизвестный необходимо в нескольких словах представить метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии (ФКС), позволяющий характеризовать очень малые количества флуорофора. Метод ФКС позволяет в объёме порядка 10~15 литра одновременно измерять: абсолютную концентрацию флуоресцирующих частиц (в наномолярном диапазоне), степень их связанности (например, с ДНК) и характеризовать микроокружение флуоресцирующих частиц (по изменению эффективности флуоресценции). Область применимости данного метода, кроме возможности непосредственного изучения флуоресцирующих веществ, включает в себя возможность исследовать флуоресцирующие аналоги исследуемых соединений, вещества, способные связывать флуоресцирующие вещества, исследовать конкурентные взаимоотношения исследуемых и флуоресцирующих веществ. С помощью корреляционной спектроскопии имеется возможность зарегистрировать лишь существенные изменения объёма флуоресцирующих частиц - на порядок, что далеко не всегда бывает достаточно для изучения процессов комплексообразования.
Цель и объекты исследования
Несмотря на огромное количество публикаций, многие вопросы относительно АМД до сих пор остаются без ответа, существуют в литературе и некоторые противоречия. Так до сих пор не была выполнена оценка роли воды и водородных связей при образовании комплекса между АМД и ДНК, несмотря на попытки использования АМД в фотодинамической терапии не были охарактеризованы его электронно-возбужденное состояние и его фотохимическая активность. До сих пор не известна конфигурация комплекса АМД*ДНК в растворе, существуют противоречивые объяснения механизмов образования и диссоциации комплексов, не были исследованы процессы конкурентного замещения АМД в комплексе АМД*ДНК, не оценивалась неспецифическая адсорбция, являющаяся причиной цитотоксичности, не были должным образом охарактеризованы системы адресной доставки АМД к ДНК клетки, не ясно чем объясняется красный сдвиг спектра поглощения 7аАМД при взаимодействии с ДНК.
В связи с вышеизложенным, цель настоящего исследования - дальнейшее изучение физико-химических свойств взаимодействия 7аАМД и АМД с ДНК при низких концентрациях флуоресцентными методами.
В опытах использовались АМД, флуоресцирующий 7аАМД, различные виды природной ДНК, фрагментированная ультразвуком ДНК тимуса телёнка, одноцепочечный шпилечный олигонуклеотид - НР1.
Задачи исследования
Для достижения сформулированной выше цели предполагалось решить следующие задачи:
Охарактеризовать энергетику взаимодействия 7аАМД с ДНК при низких концентрациях, оценить вклады водородного связывания в энергию взаимодействия феноксазинового цикла 7аАМД с ДНК и определить степень участия воды в формировании комплекса.
Определить энергетически наиболее выгодную конфигурацию 7аАМД и НР1 в образуемом ими комплексе.
Попытаться установить механизмы, определяющие кинетику ассоциации/диссоциации 7аАМД с ДНК.
Исследовать электронно-возбужденное состояние 7аАМД в комплексе с ДНК, его фотохимическую активность, ввиду важности этой информации для фотодинамической терапии.
Найти молекулярные причины "красного" сдвига максимума спектра поглощения 7аАМД при его взаимодействии с ДНК.
Охарактеризовать шпилечный олигонуклеотид и мицеллу как модели средств адресной доставки АМД, представляющие интерес в терапевтических целях.
Кроме того, необходимо было решить ряд методических задач:
Совместить ФКС измерения с измерениями поляризации флуоресценции для обеспечения на порядок более высокой чувствительности ФКС к размеру флуоресцирующих частиц.
Выполнить поиск и адаптацию алгоритма, позволяющего оценивать молекулярные параметры в эксперименте ФКС в присутствии фоновой флуоресценции для флуорофоров с низким квантовым выходом.
Исследовать свойства неспецифической адсорбции 7аАМД, найти условия, позволяющие устранить влияние этой адсорбции в ходе эксперимента.
Полученные экспериментальные данные определяют выбор адекватных молекулярных моделей взаимодействия ДНК — противоопухолевое вещество в растворе, представляют ценную информацию для разработки лекарственных препаратов нового поколения.
Общая характеристика актиномицинов
Впервые актиномицин был выделен из культуральной жидкости Streptomyces antibioticus. Из культуральной жидкости актиномицины могут быть выделены экстракцией бутиловым спиртом, ацетоном и другими растворителями. Актиномицины обладают антибиотическим действием против грамположительных бактерий и некоторых грибов. Известно более 100 актиномицинов, обозначаемых А, В, С, Д F, X и так далее. Молекулярная масса актиномицинов около 1200 дальтон. Актиномицин Д - продукт жизнедеятельности Streptomyces parvullis, других актиномицетов. АМД относится к хромопептидам, то есть состоит из двух олиго-пептидных колец (акриноцинил-ди-(Ь-треонил-Б-валинил-Ь-пролинилсаркозил-К-метил-Ь-валинил)-лактоном) и феноксазинового цикла (хромофорной группы, придающей ему оранжево-красную окрашенность). АМД трудно растворим в воде при температуре от + 8 С до +10 С и практически нерастворим при температуре + 37 С, имеет следующую формулу: Значительный интерес к актиномицину Д в биологии и медицине обусловлен использованием этого вещества в качестве противоопухолевого агента, антибиотика, средства для лечения СПИДа, препарата замедляющего старение. Это соединение ингибирует транскрипцию во многих системах, блокирует активность топоизомераз. АМД in vitro связывается с одноцепочечными, гуанин содержащими участками ДНК, способными формировать шпилечные (крестообразные) структуры [R,M. Wadkins, 1996]. При этом образуется стабильный комплекс, препятствующий продвижению полимераз по ДНК-матрице и, в конечном итоге, вызывающий их диссоциацию с ДНК. Высокая специфичность связывания АМД с ДНК и малая скорость диссоциации АМД из мест связывания объясняют эффективность блокирования актиномицином Д считывания полимеразами полинуклеиновых кислот. Связываясь с ДНК, АМД стабилизирует ее вторичную структуру - повышает температуру ее плавления [J, Basu, 1990], Лекарственная форма АМД называется Дактиномицин или Космеген. АМД, не действуя на наиболее распространённые формы рака у человека, тем не менее, обладает высокой противоопухолевой активностью.
Несмотря на то, что АМД был открыт в 1940-ых годах, он до сих пор применяется самостоятельно или, чаще, совместно с лучевой терапией, в сочетании с другими лекарственными средствами (адриамицин, циклофосфан и другими) для лечения злокачественной опухоли яичка, трофобластической болезни, различных сарком, в том числе у детей, лимфогранулематоза, множества других опухолей [J. Verweij, 1996]. Применяют препарат также при комбинированной химиотерапии меланобластомы и саркомы Капоши, часто являющейся причиной смерти ВИЧ инфицированных. АМД и его производные способны блокировать обратную транскриптазу (например, вируса иммунодефицита человека), по вышеизложенному механизму или специфически связываясь с ДНК/РНК гибридами [М Shinomiya, 1995]. В комплексе с ДНК актиномицин обладает фотодинамической активностью - акцептирует с ДНК электрон в электронно-возбужденном состоянии, что приводит к генерации свободных радикалов [J.X. Pan, 2001]. В опытах на крысах было показано [В.В.Фролкис, 1988], что актиномицин способен продлевать продолжительность жизни, связываясь с теломерными областями и замедляя тем самым клеточный цикл. Недавно обнаруженная способность актиномицина специфически связываться с ЦТТУЦАГ повторами [М.-Н. Нои, 2002] позволяет надеяться, что актиномицин найдет свое применение и при лечении таких наследственных заболеваний как хорея Гентингтона, миотоническая дистрофия, спиноцеребральная атаксия, миотоническая атрофия спинного и продолговатого мозга. Предполагается, что это связывание будет подавлять синтез мутантних аутотоксичных белков в нейронах. Разовая клиническая доза АМД для взрослых составляет 5 мкг/кг, что соответствует, ориентировочно, 5 нМ концентрации в организме. Но, даже при столь низкой концентрации, АМД обладает широким спектром побочных эффектов, отражающих его цитотоксические свойства. Подавление синтеза рибосомальной РНК и подавление переноса уже сформированных структурных компонентов рибосом из ядра в цитоплазму клетки [М.М. Khan, 1980] - наиболее сильное проявление цитотоксического эффекта на клеточном уровне. Кроме того, являясь крайне гидрофобным соединением, АМД адсорбируется на клеточных мембранах и взаимодействует с окислительно-восстановительными белками. Акцептируя электрон, АМД превращается в свободнорадикальное производное, которое вызывает изменение конформации транспортных мембранных белков при взаимодействии с ними, ведущее к подавлению транспортной функции мембраны. На организменном уровне при применении АМД относительно часто наблюдаются множественные побочные эффекты. Возможны также нарушения функций печени и почек. Ведётся активный поиск менее токсичных и более эффективных в терапевтических целях производных актиномицинов. С целью создания более эффективных противоопухолевых, противовирусных препаратов и антибиотиков необходимо тщательное дальнейшее исследование физико-химических свойств актиномицинов, механизмов и особенностей их взаимодействия с ДНК. Повышенный интерес к изучению механизмов действия различных противоопухолевых агентов определяется также ростом числа онкологических заболеваний за последние десять лет [A. Jemal, 2004]. Далее следует описание известных к настоящему времени физико-химических свойств самого АМД, комплекса АМД с ДНК и процесса комплексообразования. Оптические свойства Положение максимумов спектров поглощения и возбуждения 7аАМД совпадает и находится при 503 нм. Максимум эмиссии 7аАМД в водном растворе расположен при 675 нм, квантовый выход составляет примерно 0,016. При взаимодействии 7аАМД с ДНК длина волны максимума спектра возбуждения увеличивается до 543 нм, а максимума спектра эмиссии уменьшается до 655 нм [J.E. Gill, 1975]. В [G. Smulevich, 1980] спектр поглощения АМД в интервале 400 - 500 нм интерпретировался как колебательное уширение единичного электронного перехода при 450 нм. 1.3 Структура комплекса АМД - ДНК Хорошей основой для построения модели взаимодействия АМД с ДНК в растворе при низких концентрациях, несомненно, служат данные рентгеноструктурного анализа. Рентгеноструктурный анализ подтвердил, что АМД встраивается между парами оснований двухцепочечной ДНК, как предполагалось еще в [J.S. Sobel, 1971]. С помощью рентгеноструктурного анализа удалось обнаружить три различных по геометрии комплекса (А, В и С) между АМД и олигонуклеотидом д(ГААГЦТЩ)2 [S. Kamitory, 1994], Все они похожи друг на друга. Во всех комплексах АМД встраивается в малую бороздку ДНК между центральными нуклеотидами ГиЦ, что было впервые обнаружено для комплекса с довольно длинным олигонуклеотидом [S, Kamitori, 1992]. Регистрируемое с помощью резонансной Рамановской спектроскопии уменьшение интенсивности Рамановской линии 1492 см"1 при взаимодействии АМД с ДНК в растворе [L. Chinsky, 1978] аналогично указывает, что 2-аминогруппа гуанина (ДНК) взаимодействует с азотом гетероцикла либо карбонильной группой хромофора АМД.
Метильные группы феноксазинового цикла выходят в большую бороздку ДНК и "заякоривают" АМД в ДНК. Два комплекса (А и В) симметричны относительно оси, проведенной через центральные атомы азота и кислорода феноксазина, если не принимать во внимание асимметричность феноксазинового цикла. Оба остатка треонина двух циклических олигопептидов образуют, а кислороды при атомах Сп и СІТ могут образовывать симметричные водородные связи с остатками гуанина в области встраивания АМД в ДНК, определяя специфичность связывания с 5 -ГЦ-3" последовательностью [Н.М. Sobell, 1971], как было подтверждено [J. Meienhofer, 1977; E.F. Gale, 1981]. Аминогруппа феноксазинового цикла образует пару водородных связей с сахаро-фосфатным остовом ДНК, смотри рисунок 1. Спираль ДНК изогнута и сильно расплетена в области взаимодействия с АМД. Поэтому ее довольно сложно отнести к А или к В типу ДНК. В комплексах А и С угол закручивания - Г и 2 , в комплексе В -14% против 35 в В-ДНК [W, Liu, 1989]. Данные же кругового дихроизма [X. Qu, 2003] показывают, что при взаимодействии с 7аАМД олигонуклеотиды лишь незначительно изменяют свою вторичную структуру (не в месте встраивания 7аАМД). Различная степень перекрывание АМД с парами соседних с ним оснований сопровождается различной степенью расплетения ДНК. В комплексе В феноксазиновый цикл АМД перекрывается как с гуанином, так и с цитозином соседних Г-Ц пар, в комплексе А - лишь с гуанинами, в комплексе С - с гуанином с З -конца и Г-Ц парой с 5 -конца. Расстояние между основаниями в месте встраивания увеличено в среднем до 0,7 нм против 0,34 нм для В-ДНК
Флуоресцентная корреляционная спектроскопия
В настоящее время метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии (ФКС) получил широкое распространение в биологических исследованиях. Это связано с высокой чувствительностью метода: возможностью работы с нано- и субнаномолярными концентрациями; предоставляемой методом возможностью регистрации флуоресценции из объёма порядка фемтолитра; возможностью определения подвижности флуоресцирующих частиц и комплексов с их участием в широком диапазоне: от десятка микросекунд (соответствующих подвижности молекул красителей в воде) до секунд (соответствующих подвижности бактериальных клеток в вязких растворах); быстрым временем измерения: за время порядка десяти секунд можно судить об изменениях флуоресценции в исследуемом объёме и природе этих изменений; возможностью непосредственного измерения эффективности флуоресценции. В эксперименте ФКС регистрируется корреляционная функция (КФ) флуктуации флуоресценции в конфокальном объёме. Анализ КФ позволяет определить абсолютное число флуоресцирующих частиц (абсолютную концентрацию), их подвижность в растворе (коэффициент диффузии), то есть охарактеризовать распределение частиц по размерам; скорость внутримолекулярных конформационных переходов. Малая величина объёма 0,5x0,5x1,0 микрометров, в котором проводится измерение, позволяет использовать метод ФКС для субклеточных исследований. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия анализирует статистические флуктуации флуоресценции в малом освещаемом объеме образца и позволяет получить информацию о процессах, вызывающих эти флуктуации. Еще в конце 1960-х эти флуктуации рассматривали как маскирующие, вносящие дополнительный шум. Но, уже в 1970-х [E.L. Elson, 1974] и [A. Ehrenberg, 1974] было продемонстрировано, что эти флуктуации несут весьма важную информацию о находящихся в растворе флуоресцирующих частицах. С появлением конфокальной оптики, в 90-х, метод получил свое дальнейшее развитие [N.L. Thompson, 1991; R. Rigler, 1992; J. Widengren, 1996]. Первоначально использовавшийся исключительно для определения абсолютной концентрации и коэффициента поступательной диффузии флуоресцирующих частиц, метод ФКС был адаптирован для характеристики вращательной диффузии [S.R. Aragon, 1976], определения кинетических параметров химических реакций [R.D. Icenogle, 1983], измерения времени жизни флуоресценции [P. Kask, 1985], обнаружения межмолекулярного взаимодействия [J. Klingler, 1997], агрегации и самоассоциации [Т. Meyer, 1988; P. Hinterdorfer, 1997]. Для уменьшения фонового шума в ФКС использовалось двухфотонное возбуждение [К.М. Berland, 1995].
В случае однородного распределения флуоресцентной метки, применение принципов ФКС возможно к изображениям, полученным с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии [Z. Huang, 1996]. Не останавливается дальнейшее развитие метода и в настоящее время: в [A. Delon, 2004] предложен метод корректировки КФ с учетом фотообесцвечивания образца. Эксперименты ФКС проводились на установке ConfoCor (Zeiss, Германия). Стандартная установка для ФКС включает в себя следующие ключевые элементы (см. рисунок 5): В качестве источника излучения должен использоваться лазер, поскольку, некогерентное излучение невозможно сфокусировать в области с размерами порядка длины волны. Для освещения образца и регистрации флуоресценции используется конфокальный объектив с большой числовой апертурой. Объективы такого рода обеспечивают фокусировку света с точностью близкой к физическому пределу. Высокая числовая апертура обеспечивает минимальный размер конфокального объема (области, в которой фокусируется более 90% излучения возбуждения) и более эффективную регистрацию флуоресценции. Размеры конфокальной области при использовании идеального объектива определяются уравнением Э. Аббе: d = 0,61 X/NA, где d - диаметр дифракционного диска Эри, обратно пропорциональный числовой апертуре (NA) и уменьшающийся с уменьшением длины волны. Так как конфокальные объективы являются ахроматами, то объемы, где флуоресценция наиболее эффективно возбуждается и откуда она регистрируется, практически совпадают. Следующий важный элемент - пластинка Брумберга (дихроичное зеркало). Это светоделительная пластинка, отражающая свет с длиной волны меньшей некой фиксированной и пропускающая свет с длинной волны большей, чем эта фиксированная длина волны. Впрочем, наличие пластинки Брумберга не исключает необходимости использования запирающего светофильтра, эффективно блокирующего возбуждающее излучение и Рамановское рассеяние (в основном от воды, для водных растворов), и, вместе с тем, эффективно пропускающего флуоресценцию образца. Конфокальность регистрации флуоресценции обеспечивает наличие точечной диафрагмы в канале регистрации (см. рисунок 6), которая блокирует значительную часть излучения, попадающего на детектор из областей вне конфокального объема. В качестве детектора с низким уровнем шумов и высокой чувствительностью в ФКС используется лавинный фотодиод, имеющий большее, по сравнении с ФЭУ, мертвое время, но не имеющий послеимпульса в режиме счета фотонов. (В режиме счета фотонов на ФЭУ за основным импульсом следует послеимпульс ионной обратной связи.) Сигнал с лавинного фотодиода поступает на коррелятор, выполненный в виде электронной платы. На нем, собственно, и происходит построение корреляционной функции. Не менее важным для проведения эксперимента ФКС является наличие "хороших" спектральных фильтров и "хороших" красителей. Для получения корреляционной функции с удовлетворительным соотношением сигнал/шум необходимо зарегистрировать около миллиона фотонов от образца. Квантовый выход флуоресценции красителя должен быть, по возможности, высоким, а сам краситель - фотостабилъным. Светофильтры должны высокоэффективно пропускать свет в интересующем диапазоне и отражать (поглощать) свет вне этого диапазона. Особенно эффективно должно блокироваться мощное возбуждающее излучение. Теория и применение ФКС В ФКС флуктуации флуоресценции вокруг среднего значения используются, чтобы получить информацию о диффузии отдельных молекул, внутри- и межмолекулярных процессах. Флуктуации флуоресценции вызывает изменение числа частиц или интенсивности их флуоресценции в конфокальном объеме (рисунок 7). Измеряемую автокорреляционную функцию можно представить в виде: G(T)= F(t)F(t+T) / F(t) 2, где угловые скобки означают усреднение по времени Л
Поиск оптимального алгоритма обработки КФ и их последующий анализ
Для нахождения алгоритма оптимального для восстановления функции распределения по корреляционным функциям (измеряемым в ФКС) каждый из рассматриваемых в главе результаты алгоритмов реализовывался в виде программы в среде Matlab v. 4,0, Math Works Inc. Далее выполнялось сопоставление результатов работы сравниваемых алгоритмов. В заключение была выполнена модификация выбранного алгоритма с целью оптимизации и повышения стабильности получаемого решения. Окончательная обработка и анализ КФ выполнялись согласно схеме изложенной в результатах. В приложении В приводится текст наиболее важной программы для восстановления функции распределения частиц по размерам и определения характерных времен более быстрых, чем диффузия, по имеющемуся набору корреляционных функций. 2.6 Поиск оптимальной по энергии структуры 7аАМД при помощи молекулярной динамики Для выполнения расчетов с использованием молекулярной динамики трехмерную структуру 7аАМД получали добавлением 7-аминогруппы к АМД "экстрагированному" из структуры 2D55 (взятой из банка структур PDB, RCSB), молекулы шпилечного олигонуклеотида НР1 в различных кон формациях "готовились" в программе Hyperchem 6.03 из двухцепочечных Б-ДНК с определением положения нуклеотидов петли шпильки методом наименьших квадратов со шпилечной структурой 1BJH (PDB), неканоническая пара АГ создавалась заменой комплиментарного Ц на А. Далее, подвергшиеся вставке нуклеотиды и ближайшие к ним соседи оптимизировались в потенциале AMBER96. Заряды на молекуле 7аАМД рассчитывались после оптимизации его структуры и расчета зарядов на сетке в программе GAUSSIAN 03 (Gaussian.com), последующего восстановления точечных зарядов на атомах с помощью пакета RESP. Для формирования комплексов 7аАМД НР1 положение пары оснований олигонуклеотида НР1 и начальное положение 7аАМД в месте встраивания определялось методом наименьших квадратов. Затем геометрия олигонуклеотида оптимизировалась в потенциале AMBER96.
После этого к комплексу добавлялись противоионы натрия, оптимизировалось их положение. Наконец, задавались периодические условия, и к комплексу добавлялась TIP3 вода. Далее, стандартно, оптимизировалась вода, следом ионы и выполнялся расчет 10 пс молекулярной динамики. Затем в течение 10 пс температура повышалась от 0 К до комнатной. Выполнялся расчет одной наносекунды молекулярной динамики. "Готовились комплексы с положением 7аАМД в большой и малой бороздке ДНК, с нормальной и инверсной ориентацией аденина, с расположением 7аАМД с 5і и с 3 стороны относительно гуанина. Молекулы воды считались принадлежащими первой гидратной оболчке, если расстояние между молекулой сольвента и ближайшим атомом воды было меньше 4,5 А. 2.7 Измерения на установке ConfoCor Основу ФКС микроспектрометра составляет микроскоп Axiovert 200 (Zeiss, Germany), ФКС измерения выполнялись с использованием 40х водно-иммерсионного объектива с апертурой 1,2. Во всех экспериментах, если не оговорено особо, использовался 100 нМ раствор 7аАМД, 5 мМ какодилатный буфер (рН = 7,0), бычий сывороточный альбумин в концентрации 25 мкг/мл, 100 мМ КС1, 1 мкМ АМД, 0,02% Triton X-100, одно-цепочечная ДНК в концентрации 1 мкМ и двух-цепочечные ДНК - 10 мкМ (нуклеотидов). При титровании 7аАМД раствором ДНК фага X к большому объему 7аАМД (300 мкл 1 мкМ раствора 7аАМД в 5мМ какодилатном буфере, рН = 7,0) добавлялся малый объем до 6,6 мкл 1 мМ (в пересчете на пары оснований) раствора ДНК фага к в 5мМ какодилатном буфере. Измерения производились через 5 минут. Константа диссоциации находилась в виде решения методом наименьших квадратов уравнения: IFi = Ibg+{ab -a DNAl+W + Kj - DNAl+lO + Kj -4 10"6 [DNA] где Kd - константа диссоциации, [DNAJi - интенсивность флуоресценции для каждой из концентраций ДНК, 10"6 - суммарная концентрация 7аАМД, индексы Ь, f, bg - означают флуоресценцию связанного и свободного 7аАМД, фоновую флуоресценцию, а- эффективность флуоресценции, С - концентрация. При титровании 7аАМД раствором НР1 к 300 мл НР1 соответствующей концентрации добавлялось 6 мкл 5 мкМ 7аАМД. Затем раствор удалялся из измерительной ячейки и готовился вновь. Было найдено, что достаточно четырех циклов, чтобы концентрация 7аАМД в растворе длительное время оставалась постоянной. Концентрации свободного и связанного 7аАМД определялись как решение системы уравнений (10), (5) и (8). Уравнение (8), в случае наличия двух компонент в растворе (JTb, свободного и связанного 7аАМД с различной эффективностью флуоресценции, но одинаковыми корреляционными функциями, принимает вид: Ne=(o Nf a Nb)/fgt где Ne - эффективное число частиц в конфокальном объеме (пропорциональное абсолютной концентрации). 2.8 Уравнение гетерогенной абсорбции ФреЙндлиха Обычно, уравнение ФреЙндлиха используется для описания систем с развитой поверхностью, с концентрацией сорбента в микромолярном диапазоне.
Но при наномолярных концентрациях сорбента даже стеклянная поверхность кюветы оказывает существенное влияние на его объемную концентрацию. Напрямую использовать уравнение ФреЙндлиха для оценки количества адсорбировавшегося вещества невозможно. Отношение эффективного поверхностного объема к общему объему составляет величину порядка 10 для кубической кюветы 10x10x10 мм и 10 А приповерхностного слоя (характерный размер 7аАМД). Принимая во внимание закон сохранения масс и уравнение ФреЙндлиха (22), получим следующее уравнение для объемной концентрации: Со - Cv - КУ ЦСуТ = 0У где С0 и Су - начальная и объёмная (установившаяся) концентрация вещества, к и а - константы (смотри уравнение 22). 2.9 Устранение влияния сорбции/десорбции 7аАМД на ход эксперимента Приготовить водный раствор 7аАМД с заданной низкой концентрацией -нетривиальная задача, так как 7аАМД является амфифилом (содержит гидрофобные и полярные группы) и, поэтому, является поверхностно активным. При низких концентрациях адсорбцией уже нельзя пренебречь. Замена стеклянной кюветы на кварцевую, как и обработка стекла перфтордеканом уменьшают адсорбцию. Увеличение ионной силы раствора и добавление альбумина вызывают дальнейшее уменьшение адсорбции. Но ни эти меры, ни даже силиконизация поверхности измерительной ячейки не уменьшают адсорбцию настолько, чтобы сорбцией-десорбцией флуорофора можно было пренебречь в ходе эксперимента. Наиболее эффективным способом оказалось насыщение поверхности многократным промыванием свежеприготовленным раствором, содержащим краситель. Результаты и обсуждение В самом начале представлены флуоресцентные свойства 7аАМД в дейтерированных растворителях. Затем демонстрируется структурные данные для более наглядного восприятия последующей информации. Далее, детально анализируется сольватохромный эффект 7аАМД и, с его помощью - энергетика взаимодействия интеркалирующей части 7аАМД с ДНК. Следом выполняется попытка описать механизмы, объясняющие данные кинетики взаимодействия 7аАМД с ДНК. Для того чтобы продолжить характеризовать физико-химические свойства 7аАМД необходимо представить алгоритм, позволивший использовать метод ФКС для обладающего низким квантовым выходом 7аАМД, объяснить выбор используемого алгоритма. В заключении, с применением ФКС изучаются неспецифическая сорбция 7аАМД, его фотохимическая активность, определяются константы диссоциации 7аАМД из комплекса с ДНК фага X и из комплекса со шпилечным олигонуклеотидом НР1.
Исследование кинетики взаимодействия 7аАМДи ДНК
Формирование комплекса между ДНК и 7аАМД - это быстрый процесс, протекающий в секундном и даже миллисекундном диапазоне. Изучение подобных процессов возможно с использованием метода флуорометрии в остановленном потоке (stopped-flow). Знание константы скорости реакции позволяет судить о ее механизме. С помощью метода флуорометрии в остановленном потоке нами было установлено существование лишь быстрой фазы в случае формирования комплекса 7аАМД с одноцепочечным олигонуклеотидом НР1. Статистически достоверно наличие медленной фазы (в минутном диапазоне) установлено не было. Формирование комплекса происходит за 0,29 сек, что соответствует константе скорости реакции в 1,21 105 NfV1. На рисунке 17 представлена временная зависимость интенсивности флуоресценции 7аАМД при взаимодействии с НР1 (кривая 1) в диапазоне сотен миллисекунд. Характерная временная константа в 0,3 секунды, смотри таблицу 8, означает, что встраивание феноксазиновой части актиномицина в шпилечную структуру ДНК происходит очень быстро. При добавлении избыточного количества АМД к комплексу 7аАМД с НР1 наблюдается падение интенсивности флуоресценции 7аАМД до значения, характерного для его свободного состояния. Это означает, что происходит практически полная диссоциация комплекса 7аАМД с НР1. Временная зависимость интенсивности флуоресценции для этого процесса изображена на рисунке 17 (кривая 2), Время вытеснения составляет 0,31 секунды (таблица 8) и практически не отличается от времени связывания 7аАМД с НР1. Следовательно, наличие дополнительной аминогруппы в феноксазиновом цикле существенно энергию взаимодействия актиномицина с HP 1 не изменяет. Вместе с тем, как будет показано далее, константа диссоциации комплекса составляет порядка 7,8 10 8 М, константа обратной реакции, в таком случае, будет характеризоваться временем в 106 секунд. То есть "узким местом" будет процесс диссоциации комплекса. Процесс диссоциации от наличия десятикратного избытка АМД может идти лишь напротив - медленнее.
Соответственно, должен существовать эффективный, с низким энергетическим барьером, механизм замены 7аАМД в комплексе с НР1 на аналогичный ему АМД. При образовании комплекса с ДНК фага X хромофор антибиотика встраивается между основаниями ДНК и находится в гидрофобном окружении. Это приводит к увеличению квантового выхода флуоресценции 7аАМД, хотя и не столь значительному, как в случае образования комплекса со шпилечным олигонуклеотидом [R.M. Wadkins, 2000]. Кинетика связывания 7аАМД с ДНК имеет, по меньшей мере, две фазы - быструю (миллисекундную) и медленную (десятки секунд) [R. Bittman., 1975; С. Brown, 1987]. На рис. 18 представлена кинетика связывания 7аАМД с ДНК фага X. Комплексообразование представляет собой реакцию первого порядка ввиду избыточности концентрации ДНК. Процесс увеличения интенсивности флуоресценции характеризуется как минимум двумя компонентами: 4,6 секунды (константа ассоциации 2 104 М" с ) и 40 секунд (таблица 8). Быстрая компонента обладает большим весом. Несмотря на то, что в случае ДНК быстрая фаза имеет на порядок большее эффективное время, чем в случае НР1, можно сделать предположение, что быстрая фаза связана со встраиванием актиномицина в спонтанно образующиеся одноцепочечные структуры на ДНК, Временные различия могут быть обусловлены различной длиной олигонуклеотида (НР1) и ДНК, и, соответственно, их разной конформационной подвижностью; более низким значением константы диссоциации для центров связывания 7аАМД на НР1 {смотри далее, 7,8 10" М) по сравнению с гетерогенной популяцией центров связывания на ДНК (смотри далее, 7,4 Ю-6 М). Медленная компонента, как сообщалось в [R. Bittman, 1975] соответствует реакции первого порядка. Следовательно, усиление флуоресценции происходит ввиду взаимных конформационных перестроек в уже сформировавшихся комплексах. Как было обнаружено для олигонуклеотидов [L.E. Xodo, 1989], а позже и для ДНК на уровне хромосом [Н. Kurahashi, 2004], в линейной ДНК также возможно самопроизвольное образование крестообразных структур. Таким образом, весьма вероятно, что происходит перераспределение 7аАМД на ДНК в спонтанно образующиеся в результате тепловых флуктуации новые крестообразные (шпилечные) структуры, В пользу этого выступают два аргумента: интенсивность флуоресценции из шпилечных (крестообразных) структур выше, а константа диссоциации из них существенно ниже. Увеличение ионной силы раствора (50 мМ NaCl, таблица 8) приводит к двукратному уменьшению вклада быстрой компоненты процесса ресорбции, в то время как вклад медленной фазы остается почти неизменным. Это дает основания предполагать, что формирование промежуточного комплекса НР1 7аАМД ДНК определяется ионными (полярными) взаимодействиями, а ресорбция антибиотика контролируется гидрофобными (неионными) взаимодействиями. В качестве контроля на качество реактивов и специфичность описываемых реакций ресорбция наблюдалась также в присутствии ионов магния (3,2 мМ MgCl2, таблица 8). При этом наблюдалось ожидаемое сокращение характерных времен для обоих процессов. На основании результатов этой серии экспериментов in vitro можно рассматривать одноцепочечныи олигонуклеотид как потенциальный переносчик актиномицинов к ДНК в клетке, исключающий неспецифическое связывание и повышающий концентрацию АМД в растворе. 3.5 Анализ корреляционных функций Изучение слабо флуоресцирующих веществ в флуоресцентной корреляционной спектроскопии (ФКС) затруднено низким соотношением сигнал/шум, необходимостью особо тщательно контролировать фоновую флуоресценцию. Стандартные одно- и двухкомпонентные модели, используемые для определения молекулярных параметров 7аАМД на установке ConfoCor, не обеспечивают удовлетворительной воспроизводимости оцениваемых параметров.
В связи с этим возникла проблема поиска алгоритма обработки данных ФКС, позволяющего использовать метод для веществ с низким квантовым выходом (квантовый выход 7аАМД 0,01). Представленный далее подход позволяет использовать ФКС в случаях низкого квантового выхода исследуемых соединений при наличии фоновой флуоресценции, что важно также для внутриклеточных измерений. Он состоит в анализе КФ флуктуации флуоресценции контрольных и опытного образцов, дополненных поляризационными измерениями. На первом шаге регистрируется несколько (пять в нашем случае) корреляционных функций (рисунок 20), интенсивность флуоресценции, корреляционные функции от всевозможных контрольных образцов. Затем производится их усреднение (рисунок 21) и рассчитывается среднеквадратическое отклонение в каждой точке корреляционной функции. Интересно, что график среднеквадратического отклонения в двойном логарифмическом масштабе выглядит в виде прямой линии (рисунок 22). На следующем шаге выбирается регуляризирующий параметр а функционала (20) так, чтобы воспроизвести основные особенности корреляционной функции (смотри выше), но на функции распределения отсутствовали лишенные физического смысла пики (то есть экстра-пики с таким характерным средневзвешенным коэффициентом диффузии, существование частиц с которым в растворе невозможно), В заключение находятся: средневзвешенная (для каждого пика) функция распределения, подвижность флуорофоров, среднее число флуоресцирующих частиц, имеющих данную подвижность; определяется процент молекул перешедших в триллетное состояние. Рисунок 20. Первый этап обработки корреляционных функций. Пояснения в тексте. Далее приводится сравнение известных на сегодня алгоритмов с целью выбора наиболее подходящего для анализа корреляционных функций (КФ) в эксперименте ФКС. Будет показано, что наиболее подходящим алгоритмом оказался алгоритм, разработанных для анализа данных динамического светорассеяния.
