Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 7
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ И ПОСТАНОВКА ЗАДАЧ
ИССЛЕДОВАНИЯ 16
1.1.Методы определения параметров частиц дисперсных систем16
1.1.1. Классификация методов -16
7.7. L1. Микроскопические методы 17
LLL2. Методы рассеяния волн и частиц 17
7.7.7.5. Другие методы 18
1.1.2. Динамическое рассеяние света 19
1.1.3. Статическое рассеяние света, рентгеновского излучения и нейтронов 21
1.1.4. Спектротурбидиметрия 22
1.1.5. Электронная микроскопия 25
1.2. Получение, свойства и применение липосом 26
1.2.1. Строение и свойства липосом 26
1.2.2. Получение липосом 31
7.2.2.7. Мультилалгеллярные везикулы . 31
1.2.2.2. Малые одноламелпяриые везикулы 32
1.2.3. Применение липосом 34
1.2.3.1. Фундаментальные научные исследования 34
1.2.3.2. Фармакология и медицина 34
1.2.3.3. Косметические и другие применения 35
1.2.4. Мицеллярные системы и их применение 36
1.3. Иммунные комплексы 39
1.3.1. Растворимые и нерастворимые комплексы 39
1.3.2. Применение реакций с образованием иммунных комплексов 41
1.3.3. Методы исследования иммунных комплексов 42
1.4. Синтез, оптические свойства и применение биоконъюгатов
золотых наночастиц 43
1.4.1. Синтез коллоидных наночастиц золота. Получение конъюгатов наночастиц с макромолекулами 43
1.4.2. Оптические свойства наночастиц золота и биоконъюгатов 45
1.4.3. Применение конъюгатов коллоидного золота с биополимерами 47
1.5. Постановка задач исследования 49
ГЛАВА 2. РАЗРАБОТКА И ТЕСТИРОВАНИЕ УСТАНОВКИ ДЛЯ
РЕАЛИЗАЦИИ МЕТОДА ДИНАМИЧЕСКОГО
СВЕТОРАССЕЯНИЯ 52
2.1. Принципы метода и варианты его реализации 52
2.2. Реализация метода ДРС в аналоговом режиме 56
2.2.1. Схема установки 56
2.2.2. Программное обеспечение для обработки данных в аналоговом режиме и его тестирование 58
2.2.3. Измерение размеров тестовых латексных образцов 62
2.2.4. Сравнение с данными спектротурбидиметрии 64
2.2.5. Влияние концентрации рассеивателей, температуры и вязкости дисперсионной среды на результаты измерения тестовых образцов 67
2.2.6. Анализ бимодальной взвеси и солевой агрегации 70
2.2.7. Тестирование установки с помощью наночастиц коллоидного золота 72
2.2.7.1. Синтез и характеристика образцов 72
2.2.7.2. Результаты измерений и их обработка 73
2.3. Реализация метода в режиме счета фотонов 76
2.3.1. Схема установки 76
2.3.2. Принципы работы программного комплекса DynaLS 78
2.3.3. Тестирование установки с помощью латексных образцов 81 '2.3.4. Исследование полидисперсности золотых золей 83
2.4. Определение параметров мицеллярных растворов ПАВ с помощью созданной установки 85
2.5. Заключение и выводы по Главе 2 90
ГЛАВА 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАРАМЕТРОВ ЛИПОСОМ МЕТОДАМИ СПЕКТРОТУРБИДИМЕТРИИ И ДИНАМИЧЕСКОГО
СВЕТОРАССЕЯНИЯ 92
3.1. Теория спектротурбидиметрического метода определения
размера и толщины оболочки липосом 93
3.1.1.-Основные соотношения для монодисперсной взвеси 93
3.1.2. Учет спектральной зависимости оптических констант 95
3.1.4. Результаты расчетов и их обсуждение 100
3.2. Экспериментальная часть 104
3.2.1. Материалы и методы. Приготовление образцов 104
3.2.2. Результаты спектротурбидиметрии 105
3.2.3. Сравнение сданными динамического светорассеяния 107
3.3. Заключение и выводы по Главе 3 109
ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ЧАСТИЦ НЕРАСТВОРИМЫХ
. ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ 112
4.1. Теория метода 113
4.1.1. Основные соотношения для монодисперсной взвеси 113
4.1.2. Учет спектральной дисперсии оптических констант и полидисперсности частиц 115
4.1.3. Расчет калибровок для определения состава частиц иммунных комплексов по измерениям гидродинамического размера, волнового экспонента и удельной мутности 117
4.2. Экспериментальная часть 120
4.2.1. Материалы и методы , 120
4.2.2. Кривые преципитации и кинетические измерения светорассеяния 122
4.2.3. Определение состава частиц из измерений гидродинамического
размера и удельной мутности 124
4.2.4. Определение состава частиц из измерений волнового
экспонента и удельной мутности 125
4.3. Заключение и выводы по Главе 4 130
ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ БИОКОНЪЮГАТОВ КОЛЛОИДНОГО
ЗОЛОТА 131
5.1. Новая модель биоконъюгатов золотых наночастиц:
оптимизация наносенсоров 132
5.1.1. Многослойная модель биоконъюгатов 132
5.1.2. Методика расчетов спектров экстинкции и рассеяния для новой модели биоконъюгатов 133
5.1.3. Изменение спектров экстинкции и рассеяния при формировании первичного и вторичного полимерного слоя. Оптимизация наносенсоров 136
5.2. Экспериментальное исследование адсорбции биополимеров
на золотых наночастицах с пользованием спектров
статического рассеяния и поглощения света и метода
динамического светорассеяния 141
5.2.1. Препараты и реактивы. Приготовление конъюгатов 141
5.2.2. Приборы и методики измерений 142
5.2.3. Результаты экспериментов и их обсуждение 145
5.2.4.Неоднородная модель адсорбции желатина на частицах золота 151
5.3. Заключение и выводы по разделу 154
ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ ПО ДИССЕРТАЦИИ 156
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 161
Введение к работе
Методы светорассеяния и спектроскопии поглощения широко используются в исследовании дисперсных систем биологической природы [1], поскольку они удачно сочетают информативность анализа и невозмущающий характер зондирования. Наиболее распространенными вариантами метода светорассеяния является измерение угловой зависимости интенсивности и поляризации рассеянного излучения [1,2, 3], спектроскопия интегрального рассеяния (спектротурбидиметрия) [4] и динамическое рассеяние света [5]. В отличие от спектроскопии поглощения, спектроскопия статического (упругого) рассеяния света используется довольно редко, хотя потенциальные возможности этого метода далеко не изучены.
При решении обратных задач светорассеяния [2, 6] обычно используется простейшая модель однородной сферы, в некоторых случаях привлекается модель двухслойных частиц или модель однородного сфероида [3, 7]. В большинстве прикладных работ основной акцент сделан на анализе дисперсного состава взвеси в терминах среднего размера или распределения по размерам. Гораздо меньше работ посвящено анализу структуры частиц и её зависимости от природы объекта, физико-химических условий среды и т.п. Эта сравнительно мало разработанная область биофизики дисперсных систем и является главной целью данной диссертации. Именно этот аспект объединяет три типа объектов исследования: липосомы, частицы нерастворимых иммунных комплексов и биоконъюгаты коллоидного золота. При разработке конкретных методик исследования данных объектов были использованы четыре оптических метода: спектроскопия поглощения, спектротурбидиметрия, спектроскопия статического углового рассеяния [8] и динамическое светорассеяние.
Рассмотрим выбор объектов исследования и начнем с липосом, которые имеют огромное прикладное значение. Последние разработки в данной области [9] связаны с проблемой адресной доставки лекарственных
субстанций в пораженные органы и ткани человека и животных. Включение лекарственных препаратов в липосомы может значительно повысить их терапевтическую эффективность поскольку, с одной стороны, препарат, находящийся в липосоме, защищен ее мембраной от действия неблагоприятных факторов, а с другой - та же мембрана не позволяет токсичному препарату превысить допустимую концентрацию свободного препарата в организме. Липосомы хорошо подходят как переносчики лекарственных препаратов и с точки зрения биологической совместимости. Водные дисперсии многослойных липосом, благодаря способности удерживать воду, являются высокоэффективным увлажняющим агентом и широко применяются в косметической промышленности. Не потеряли актуальность и традиционные применения липосом в фундаментальных исследованиях как модели клеточных мембран [10]. Для всех перечисленных приложений знание структуры липосом имеет исключительную важность. Основными параметрами структуры для моноламеллярных липосом являются размер и толщина фосфолипидной оболочки.
Иммунные комплексы имеют большое значение в различных областях науки. Образование межмолекулярных комплексов и последующее фазовое разделение (иммунопреципитация) лежат в основе целого ряда иммунохимических методов исследования структуры и функции биополимеров [11, 12]. Иигибирование реакции преципитации при добавлении в систему соединений с известной химической структурой используется для идентификации биополимеров и установления их строения [13]. На основе эффекта иммунопреципитации разработаны способы тонкой очистки биопрепаратов [14]. Для понимания механизма формирования иммунных комплексов важное значение имеет структура формирующихся частиц преципитата [12].
Металлические наночастицы (прежде всего частицы золота и серебра) являются одним из важнейших объектов современной напотехнологии [15,
16]. Биоконъюгаты наночастиц представляют собой структуру, состоящую из металлического ядра и адсорбированных или химически прикрепленных биомакромолекул [17, 18]. Оптические свойства металлических наночастиц определяются локализованным плазменным резонансом (ЛПР), связанным с коллективными колебаниями свободных электронов [19]. Важным свойством ЛПР является его зависимость от ближайшего диэлектрического окружения наночастиц [19, 20, 21]. Этот принцип используется для конструирования наносенсоров нового поколения, способных оптически детектировать взаимодействия биомакромолекул вблизи поверхности наночастиц [16, 22]. Регистрация биоспецифического связывания узнающих молекул (адсорбированных на частицах) с молекулами-мишенями проводится по изменению величины [23] или положения [24] максимума экстинкции на длине волны ЛПР, а также резонансного светорассеяния от ансамблей наночастиц в суспензии [8] или на диэлектрическом субстрате [16]. В последнем случае используются микроскопические системы с темиопольным освещением, скомбинированные с CCD камерами или микроспектрографами [16]. Совсем недавно были получены [25, 26] рекордные показатели по чувствительности подобных сенсоров в цептомолярном диапазоне и показана возможность детектирования спектров резонансного рассеяния от отдельных частиц. Это открывает путь к регистрации межмолекулярных взаимодействий на уровне отдельных молекул.
Обсудим теперь методы исследования, использованные в диссертации. В случае непоглощающих дисперсных систем (липосомы и иммунные комплексы) использовали спектротурбидиметрига и динамическое светорассеяние. Первый метод имеет хорошую теоретическую базу [4, 12, 27] и реализуется на доступной спектрофотометрической аппаратуре с учетом необходимых простейших модификаций [27]. Метод динамического светорассеяния [28] в настоящее время широко используется в биофизических исследованиях, однако он требует специальной и довольно
дорогостоящей аппаратуры. Поэтому одна из задач диссертации была связана с созданием установки для реализации этого метода в ИБФРМ РАН. Наконец, в случае биоконъюгатов коллоидного золота достаточно информативной является спектроскопия поглощения в видимой области. В дополнение к ней мы использовали новую разработку - дифференциальную спектроскопию статического рассеяния поглощающих систем, предложенную в [8].
Научная новизна работы:
Разработан метод определения среднего размера и толщины оболочки
липосом, основанный на совместном использовании спектротурбидиметрии
и динамического рассеяния света. Построены теоретические калибровочные
зависимости волнового экспонента от среднего радиуса полидисперсной
взвеси липосом с использованием строгого решения Ми для двухслойных
сфер и учетом спектральной зависимости оптических констант оболочки и
среды.
Разработан метод оценки внутренней структуры частиц нерастворимых иммунных комплексов, основанный на комбинации измерений удельной мутности и среднего гидродинамического радиуса частиц. Развит вариант решения данной задачи на основе спектротурбидиметрии. Для систем с белковыми антигенами подтверждено, а для систем с углеводными антигенами впервые обнаружено, что объемная доля биополимеров, входящих в состав частиц нерастворимых иммунных комплексов, составляет около 30 %.
Предложена новая (многослойная) модель биоконъюгатов металлических наночастиц с золотым ядром и неоднородной полимерной оболочкой. В рамках данной модели обнаружены две области оптимальных разме ров золотых наночастиц: 40-60 нм для экстинкции и 70-90 нм для статического рассеяния, позволяющие получить максимальный оптический
отклик при присоединении к биосенсору молекул-мишеней и формировании вторичного слоя биополимера.
Впервые проведено экспериментальное исследование адсорбции трех биополимеров (IgG человека, трипсин и желатин) на золотых частицах двух диаметров (18 и 34 им) с совместным использованием трех методов: спектроскопии статического рассеяния и экстинкции и динамического рассеяния света.
Научно-практическая значимость работы:
Созданная установка для метода динамического рассеяния света реально используется при решении различных задач, связанных с оценкой дисперсного состава систем.
Оперативный метод контроля среднего размера и толщины оболочки липосом может быть использован для создания эффективных форм лекарственных препаратов на основе липосомальных суспензий.
Разработанная методика определения структуры частиц нерастворимых иммунных комплексов позволяет количественно оценивать эффект ингибирования реакции иммуиопреципитации при определении химического состава антигенных детерминант.
Обнаруженные оптимизационные максимумы размеров частиц, позволяющие получить максимальный оптический отклик при присоединении молекул-мишеней к конъюгату, могут быть использованы для оптимизации наиосенсоров на основе частиц коллоидного золота.
Достоверность научных результатов подтверждается
воспроизводимостью экспериментальных данных и их соответствием теоретическим расчетам, а также качественным и количественным согласием с результатами независимых исследований других авторов.
На защиту выносятся следующие основные положения:
Совместное применение методов динамического рассеяния света, спектротурбидиметрии, спектроскопии экстинкции и статического рассеяния
позволяет охарактеризовать размер и структуру частиц исследованных дисперсных систем.
Волновой экспонент липосом не зависит от толщины оболочки и определяется только внешним радиусом частицы.
Теоретические калибровочные зависимости удельной мутности и волнового экспонента взвеси вместе с измерениями этих параметров позволяют определить размер липосом и толщину их оболочки.
Измерение удельной мутности и гидродинамического радиуса или волнового экспонента частиц нерастворимых иммунных комплексов позволяет определить объемную долю биополимеров в терминах среднего показателя преломления.
Объемная доля биополимеров в составе исследованных частиц нерастворимых иммунных комплексов с углеводными и белковыми антигенами составляет около 30 %.
Основные изменения в спектрах рассеяния и поглощения света конъюгатами коллоидного золота происходят при формировании первичной полимерной оболочки толщиной менее 5 им. Максимальный теоретический оптический сигнал при присоединении молекул-мишеней к биоконъюгату наблюдается для золотых наночастиц с диаметром 40-60 нм (экстинкция) и 70-90 нм (рассеяние).
Адсорбция трипсина и IgG человека на частицах коллоидного золота моделируется двухслойной моделью с золотым ядром и толщиной слоя полимера 4-6 нм. Адсорбция желатина на частицах коллоидного золота моделируется неоднородной многослойной моделью с общей толщиной 16-20нм.
Личный вклад диссертанта и результаты, полученные совместно с другими исследователями:
Личный вклад соискателя состоит в разработке и изготовлении экспериментальных установок для реализации метода динамического
рассеяния света, проведении расчетов и экспериментов, интерпретации полученных данных.
В иммунохимических экспериментах использовались антитела, полученные к.х.н. Шварцбурдом Б.И. и к.б.н. Матора Л.Ю., а также препарат ЛПБК, полученный д.б.н. Конновой С.А. Эксперименты по определению состава частиц нерастворимых иммунных комплексов выполнены совместно с аспирантом Бурыгиным Г.Л. Теоретические расчеты оптических свойств конъюгатов коллоидного золота выполнены совместно с д.ф.-м.н. Хлебцовым Н.Г. и к.ф.-м.н. Мельниковым А.Г. Экспериментальные исследования адсорбции биополимеров на золотых наночастицах и оптических свойств биоконъюгатов коллоидного золота выполнены совместно с к.б.н. Дыкмапом Л.А и к.б.н. Богатыревым В.А.
Работа выполнена в Лаборатории физической химии клеточных структур и Лаборатории биосенсоров на основе наиоразмерных структур ИБФРМ РАН в рамках плановых госбюджетных тем НИР.
Гранты. Данные исследования поддерживались грантами РФФИ (проекты № 01-03-33130, № 01-04-48736, 03-03-06535 МАС), совместным грантом фонда CRDF и Минобразования РФ № REC-006 (студенческий грант 2000, два аспирантских гранта 2001, 2002 и грант для молодых ученых 2003), грантом Президента РФ № НШ-1529.2003.4, а так же грантом для поддержки научно-исследовательской работы аспирантов вузов Минобразования РФ АОЗ-2.11-608.
Апробация результатов: Основные результаты диссертации представлялись на следующих научных конференциях:
Региональная конференция Молодежь и наука на пороге 21 века, Саратов, 1998.
"Saratov Fall Meeting - International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophysics Workshop on Optical
Technologies in Biophysics & Medicine, Saratov, Russia, 1999, 2000, 2001, 2002, 2003.
1-ая Российская школа-конференция Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине, Саратов, 2002.
4-я Всероссийская конференция молодых ученых Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии, Саратов, 2003.
Международная конференция, посвященная 100-летию со дня рождения Р. В. Мерцлина Физико-химический анализ оісидкофазиьгх систем, Саратов, 2003.
NATO Advanced Study Institute Photopolarimetry in Remote Sensing, Yalta, Ukraine, 2003.
6th and 7th Conf. on Electromagnetic and Light Scattering by Nonspherical Particles: Theory, Measurements, and Applications, Halifax, 2001; Bremen, 2003.
11th Int. Conf. on Surface and Colloid Science (IACIS), Iguassu Falls, Brazil, 2003. .
Donostia Int. Physics Center Workshop Optical Properties of Complex Materials over Different Length Scales, San Sebastian, Spain, 2003.
Публикации: По теме диссертации опубликовано 22 работы, в том числе б статей в рецензируемых журналах и 9 статей в зарубежных изданиях (из них 3 приняты в печать).
Структура диссертации такова. В первой главе дан анализ литературных данных, включая методы определения размера частиц в дисперсных средах, получение, свойства и применение липосом, свойства иммунных комплексов, синтез, оптические свойства и применение биоконъюгатов золотых наночастиц. Вторая глава посвящена разработке и тестированию установки для реализации метода динамического рассеяния света. В третьей главе представлена теоретическая разработка и практическая апробация нового метода исследования структуры липосомальиых частиц. В четвертой главе проведена теоретическая разработка и экспериментальная
апробация двух вариантов метода определения усредненного состава частиц нерастворимых иммунных комплексов в терминах среднего показателя преломления. Пятая глава посвящена теоретическому анализу оптических свойств и экспериментальной проверке многослойной модели биокопъюгатов коллоидного золота на примере шести систем (три типа биополимеров и два золя с различным размером частиц).
Диссертационная работа изложена на 182 страницах, содержит 49 рисунков, 4 таблицы, и 221 литературный источник.
