Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 7
1.1 Строение и свойства тромбоцитов 7
1.2 Процессы характеризующие активацию тромбоцитов 12
Адгезия тромбоцитов 12
Реакция высвобождения 15
Агрегация тромбоцитов 16
Изменение концентрации и размера тромбоцитов 20
1.3 Рассеяние и поглощение света малыми частицами 24
Метод лазерной дифракционной спектроскопии для определения
распределения частиц по размерам 27
ГЛАВА 2. Материалы и методы 30
2.1 Метод лазерной дифракционной спектроскопии 30
Прибор "Mastersizer Micro". Блок схема 30
Восстановления исходного распределения частиц по размерам из картины светорассеяния 31
Объемная концентрация рассеивающих частиц 33
2.2 Определение размеров и оптических свойств тромбоцитов 34
2.3 Индукторы активации тромбоцитов 35
2.3 Выделение тромбоцитов 36
2.4 Определение концентрации тромбоцитов на счетчике клеток 37
2.5 Турбидометрическии метод исследования агрегации тромбоцитов 37
2.6 Метод сканирующей электронной микроскопии для исследования количества и Морфологии адгезированных тромбоцитов 39
2.7 схема проведения эксперимента 40
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 43
3.1 Выбор экспериментальных условий для измерения углового распределения рассеянного на тромбоцитах света 43
3.2 Определение размеров и оптических свойств тромбоцитов 44
Выбор модели анализа и презентации с помощью минимизации коэффициента невязки 44
Вычисление среднего объема тромбоцитов 47
Вычисление концентрации тромбоцитов 48
Использование концентрации тромбоцитов для выбора презентации 48
Процедура получения распределения тромбоцитов по размерам,
вычисления СОТ и концентрации тромбоцитов здорового донора 51
3.3 Изменения оптических свойств тромбоцитов под действием индукторов активации 56
Сдвиговое напряжение 58
Изменение рН 61
Хранение в тромбоцитарных контейнерах 64
Заключение 68
Выводы 69
Список литературы
- Реакция высвобождения
- Восстановления исходного распределения частиц по размерам из картины светорассеяния
- Определение концентрации тромбоцитов на счетчике клеток
- Вычисление среднего объема тромбоцитов
Введение к работе
Биосовместимость медицинских изделий, предназначенных для кратковременного или длительного контакта с кровью, во многом определяется реакцией тромбоцитов, играющих важную роль в поддержании гемостаза и сохранении агрегатного состояния крови [13]. Несмотря на прогресс в изучении отдельных этапов и механизмов активации тромбоцитов различными внешними факторами, описание процессов, характеризующих реакцию клеток, носит часто качественный или полуколичественный характер. В значительной степени это связано с ограниченным количеством имеющихся методов исследования.
Известно, что концентрация тромбоцитов в организме поддерживается постоянной, и ее существенное изменение клинически проявляется рядом тяжелых заболеваний [16]. Более того, основными отрицательными эффектами при использовании систем искусственного и вспомогательного кровообращения являются тромбозы, тромбоэмболии, тромбоцитопения и т.д., обусловленные взаимодействием тромбоцитов с чужеродной поверхностью.
Традиционно функциональное состояние тромбоцитов связывают с их способностью к адгезии, агрегации и высвобождению внутриклеточных биологически активных веществ [19, 13].
К сожалению, количество адгезированньгх тромбоцитов и их морфология не могут дать объективной информации о влиянии поверхности на клетки. Так, например, на контактирующей с потоком крови поверхности изделия не всегда удается найти адгезированные тромбоциты, но при этом активация клеток в объеме крови может инициировать образование тромбоэмбол.
Степень активации тромбоцитов часто оценивают по реакции высвобождения внутриклеточных биологически активных веществ (АДФ, серотонин, тромбин и т.д.). Однако такой метод является дорогостоящим, а полученные результаты не отличаются хорошей воспроизводимостью.
Широко распространенным методом анализа функциональных свойств тромбоцитов является изучение их агрегационной активности. Метод основан на увеличении светопропускания суспензии тромбоцитов под действием индукторов агрегации физической или химической природы [28]. Следует заметить, что измеряемый эффект может быть связан не столько с уменьшением количества рассеивающих объектов в результате агрегации клеток, сколько с изменением индивидуальных размеров тромбоцитов и их оптических свойств - коэффициентов преломления и поглощения.
В связи с этим, поиск новых экспериментально определяемых количественных параметров, характеризующих функциональное состояние тромбоцитов, является актуальной и практически важной задачей, имеющей большое фундаментально-прикладное значение.
Для измерения оптических свойств и размеров тромбоцитов был выбран метод лазерной дифракционной спектроскопии. Несмотря на сложность метода, связанного с необходимостью математического решения обратной задачи рассеяния света и выбором начальных данных о параметрах распределения по размерам и оптических свойствах рассеивающих частиц, он достаточно часто применяется для определения размеров объектов не биологической природы (суспензии, эмульсии, аэрозоли).
Учитывая высокую чувствительность метода лазерной дифракционной спектроскопии к выбору оптических свойств объектов для определения их размеров, нами было высказано предположение о возможности использования данного метода для определения размеров и оптических свойств тромбоцитов как показателей, характеризующих их функциональное состояние.
В связи с этим, целью настоящей работы является разработка на основе лазерной дифракционной спектроскопии метода измерения размеров и оптических свойств тромбоцитов человека.
Исходя из поставленной цели, основные задачи работы сводились к следующему:
1) найти экспериментальные условия для измерения углового распределения рассеянного на тромбоцитах света (картины светорассеяния);
2) доказать возможность использования метода лазерной дифракционной спектроскопии для определения размеров и оптических свойств тромбоцитов (коэффициенты преломления и поглощения);
3) оптимизировать экспериментальную процедуру определения размеров и коэффициента преломления тромбоцитов человека методом лазерной дифракционной спектроскопии;
4) исследовать влияние скорости сдвига, рН среды и контакта с чужеродной поверхностью на размер и коэффициент преломления тромбоцитов.
Реакция высвобождения
Реакция высвобождения (тромбоцитарная секреция) - это специфическая реакция клеток, которая развивается в ответ на их мембранную активацию и выражается в селективном высвобождении активных веществ из гранул в окружающую среду [77]. Основной особенностью секреторного процесса, отличающего его от выделения при повреждении или при повышении проницаемости мембран, служит относительно быстрое и избирательное высвобождение хранимых в гранулах веществ параллельно соответствующему снижению их содержания в клетке.
В тромбоците человека выделяют три типа гранул: а гранулы, электронноплот-ные тельца и лизосомы. Тромбоцитарные секреторные реакции осуществляются быстро (20 - 120 секунд). Стимуляция секреции включает в себя этап мембранной активации и передачу сигнала внутрь клетки. Затем происходит пространственное перемещение тромбоцитарных структур и субстанций за счет сократительной системы, сопровождающееся высвобождением содержимого гранул. Гетерогенность гранул хранения приводит к различиям в кинетике секреции. Вначале происходит высвобождение из а гранул, позже из плотных телец, и затем из лизосом (причем в последнем случае, даже при максимальной стимуляции секретируется только 30-60 % ли-зосомальных ферментов. Содержимое а гранул высвобождается легко. Даже контактная активация при центрифугировании крови приводит к получению тромбоцитов, которые уже в значительной степени осуществили этот вид секреции. После действия слабых агонистов (АДФ, адреналин, малые концентрации коллагена и тромбина) происходит высвобождение и из а гранул, и из плотных телец. При применении больших концентраций коллагена или тромбина, секреция захватывает все три типа гранул (а гранулы, плотные тельца, лизосомы). Перестройка и активация сократительных структур на конечном этапе стимуляции секреции приводит к развитию в клетке так называемого внутреннего сокращения. В результате этого в центре тромбоцита группируются гранулы, окруженные микротубулами [16], а это может повлечь за собой изменение оптических свойств тромбоцита.
Как отмечалось выше, высвобождение содержимого гранул (серотонина, АДФ, тромбоцитарного фактора 4 и др.) может происходить под действием тромбина, АДФ, коллагена и других факторов активации тромбоцитов. АДФ может высвобождаться и при повреждении клеток. Для определения количества высвободившихся веществ обычно используют радиоимунный метод [27, 33, 55, 26, 19] и люминесцентный анализ [43, 37, 44, 19].
Под действием тромбина, АДФ, коллагена и других факторов активации, с помощью которых изучают высвобождение содержимого гранул тромбоцитов, тромбоциты могут изменить свой размер. Учитывая структурные особенности мембраны тромбоцитов, изменение размеров клеток может привести к изменению площади и проницаемости (плотности) мембраны, что должно повлиять на эффективность высвобождения содержимого гранул во внеклеточное пространство. Следовательно, изменение размера клеток, может быть информативным и при изучении тромбоцитарной секреции.
Агрегация тромбоцитов
Агрегация тромбоцитов может происходить в условиях in vivo после активации тромбоцитов разрушенной стенкой эндотелии или чужеродным материалом, in vitro в объеме при добавлении индуктора агрегации в интенсивно перемешиваемую суспензию тромбоцитов. Имеется много путей активации клеток, которые, как правило, включают связывание индуктора агрегации (АДФ, адреналин, фактор активации тромбоцитов, коллаген, тромбин, и др.) со специфическими рецепторами на внешней мембране тромбоцита и могут также инициироваться сдвиговыми напряжениями, температурой, рН среды и т.д. Затем следует передача сигнала внутрь клетки путем изменения концентрации внутриклеточных метаболитов (Са2+, Н+ и др.) и активация рецепторов фибриногена. После этого происходит связывание отдельных клеток друг с другом фибриногеновыми мостиками с образованием клеточных агрегатов и реакция высвобождения химических веществ из клетки [11].
Выделяют два типа агрегации: первичную и вторичную. Первичная агрегация является непосредственным результатом действия на плазматическую мембрану тромбоцита внешних физиологических стимулов. Вторичная агрегация развивается после первичной и обусловлена активацией секреции в стимулированных клетках с последующим действием на мембрану клеток высвободившихся эндогенных индукторов.
Если количество добавленного к тромбоцитарной плазме АДФ недостаточно для секреторного процесса и вызывает только первичную агрегацию, то через несколько минут после контакта клеток с АДФ происходит дезагрегация. При этом, с помощью повторного добавления АДФ можно определить, что дезагрегировавшие тромбоциты на некоторое время теряют способность агрегировать [11, 16], т.е. становятся рефрактерными. Возможно, в таких тромбоцитах активация приводит к ультраструктурным реорганизациям, т.е. можно предположить, что органеллы сконцентрировались в центре клетки благодаря сократительным реакциям, но не произошло высвобождение содержимого органелл (такой рефрактерный тромбоцит должен иметь отличный от интактного тромбоцита размер и оптическую плотность). В этом случае через некоторое время тромбоцит может восстановиться [16].
Восстановления исходного распределения частиц по размерам из картины светорассеяния
С помощью теории Ми, используя некоторые допущения, возможно вычислить картину светорассеяния, зная распределение по размерам рассеивающих частиц. К сожалению, в нашем случае необходимо решить обратную задачу, которая значительно сложнее. Для ее решения необходимо сделать следующие шаги. В зависимости от имеющихся предположений о распределении частиц, необходимо выбрать одну из трёх моделей анализа: полидисперсную, мультимодальную или мономодальную. Это означает, что истинное распределение частиц по размерам не имеет ярко выраженных экстремумов в первом случае, что таких экстремумов несколько во втором и всего один - в третьем. Затем следует выбрать один из представленных в программе наборов значений коэффициентов преломления среды, материала частиц и коэффициента поглощения материала частиц. Набор значений коэффициентов называется презентацией. Выбор модели и презентации осуществляется экспериментатором.
После измерения прибором картины светорассеяния, на основании её вида, программное обеспечение делает первичное предположение о распределении частиц по размерам, используя одно из множества распределений имеющихся в программе. Это распределение называется пробным. Используя выбранные модель и презентацию, вычисляется картина светорассеяния, которая наблюдалась бы на частицах, имеющих пробное распределение. Вычисленное таким образом угловое распределение рассеянного света сравнивается с экспериментально полученным распределением, и на основании наблюдаемой разницы делаются изменения в пробном распределении частиц по размерам. Картина светорассеяния пересчитывается для нового пробного распределения частиц по размерам. Эта операция повторяется до тех пор, пока разница между экспериментально полученной картиной светорассеяния и вычисленной не достигнет минимума. Пробное распределение частиц по размерам после этого представляется как аппроксимация настоящего распределения по размерам.
Основной сложностью описанной выше процедуры восстановления распределения частиц по размерам является выбор презентации. Необходимо задать вид предполагаемого распределения, оптические свойства исследуемых частиц. К сожалению, общего алгоритма для решения этой проблемы нет и исследователи решают эту проблему индивидуально в каждом случае.
Всегда существующие расхождения между расчётным угловым распределением рассеянного света и измеренным характеризуются коэффициентом невязки. Этот коэффициент вычисляется как относительное среднеквадратичное отклонение рассчитанного углового распределения рассеянного света от углового распределения, измеренного прибором. Чем ближе этот коэффициент к нулю, тем лучше модель описывает экспериментальные данные. Принято считать, что при значении коэффициента невязки меньше 1 % модель хорошо описывает экспериментальные данные. Значение коэффициента невязки больше 5 % указывает на плохой выбор модели анализа и презентации.
Программное обеспечение прибора позволяет представлять полученное распределение частиц в виде различных гистограмм. Так, по оси абсцисс можно отложить нормальную или логарифмическую шкалу с любой шириной окна (в пределах 0,31 - 301 мкм) и с количеством интервалов не более 100. По оси ординат возможно отложить относительное количество (% от общего количества), относительный суммарный линейный размер (% от суммы диаметров всех частиц), относительную общую площадь или объем частиц (% от площади или объема занимаемого всеми частицами) соответствующие определенному интервалу размеров. Встроенный язык программирования позволяет написать программы для автоматизации процесса обработки и сохранения данных в форматах, позволяющих транспортировать их в другие программы для дальнейшей обработки.
Определение концентрации тромбоцитов на счетчике клеток
Агрегометр "Aggregation analyzer 220LA" (Biola Ltd, Москва) регистрирует агрегацию тромбоцитов традиционным турбидометрическим методом и имеет два независимых измерительных канала. Светопропускание суспензии тромбоцитов измеряется в процентах от светопропускания плазмы бедной тромбоцитами в обоих каналах одновременно с шагом не менее 1 с и продолжительностью не более 15 мин. Данные по изменению светопропускания во времени (агрегатограммы) записываются на связанный с прибором компьютер. Программное обеспечение позволяет вычислять тангенсы угла наклона касательных к агрегатограмме в любых ее точках и найти ее максимальное значения, а также определить максимальное светопропускание в процессе агрегации.
Скорость магнитной мешалки, перемешивающей тромбоцитарную плазму, и температура в измеряемой ячейки поддерживаются встроенным процессором независимо в каждом канале. Прибор также имеет 8 термостатируемых ячеек. Использовали магнитные мешалки с тефлоновым покрытием.
Пробы ПОТ разливали по 500 мкл в силиконизированные стеклянные кюветы (TEST TUBES 7.25x55 mm Flat Bottom, BIO/DATA Corporation) и перед началом регистрации агрегации помещали в термостатируемые при 37 С ячейки прибора на 3 минуты. Температура в измерительных ячейках автоматически поддерживалась при 37 С блоком температурного контроля. Кривые агрегации снимали в течении 15 мин с шагом 1с.
Для регистрации агрегации индуцированной изменением рН в 500 мкл ПОТ добавляли 36 мкл уксусной кислоты концентрацией 0,3 М (таким образом конечная концентрация кислоты в плазме составляла 20 мМ). рН ПОТ контролировали на рН-метре ORION 310.
Для регистрации активации индуцированной сдвиговым напряжением, ПОТ перемешивали мешалкой со скоростью вращения 800 об/мин., что соответствует сдвиговому напряжению 5-Ю дин/см или сдвиговым скоростям порядка 100-300 1/с. Такие сдвиговые напряжения действуют на тромбоциты при течении крови по артерии диаметром 0,5 см со средней скоростью порядка 50 см/сек.
Для регистрации агрегации индуцированной АДФ концентрацией 5 мкМ в 500 мкл ПОТ добавляли 17 мкл АДФ концентрацией 155 мкМ (155 мкМ АДФ - 50 мл физиологического раствора и 3,31 мг АДФ фирмы "Sigma" М=427,2).
Для количественного описания процесса активации под действием изменения рН, после воздействия напряжения сдвига и АДФ концентрацией 5 мкМ в работе использовали степень агрегации (I), т.е. значение светопропускания после выхода на стационарное значение - плато.
Полиэтилен низкой плотности ПЭНП ГОСТ 10354-73 размером 10 х 20 мм, предназначенные для контакта с ПОТ, предварительно отмывали в растворе этилового спирта и диэтилового эфира (объемное соотношение спирт/эфир 1:1) в течение 10 минут, после чего образцы промывали 10 минут в дистиллированной воде и сушили на воздухе.
Капли исходной тромбоцитарной плазмы и плазмы после изменения рН и воздействия на нее напряжения сдвига, наносили на поверхность полиэтилена с помощью микропипетки (по 50 мкл) и инкубировали во влажной атмосфере в течение 15 минут. Влажная атмосфера необходима для предотвращения высыхания капли за время инкубации.
После инкубации образцы интенсивно промывали в физиологическом растворе для удаления обратимо адгезированных тромбоцитов, фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида в течение 2 часов и обезвоживали в растворах этилового спирта возрастающих концентраций по следующей схеме: 50% спирт - 3 мин, 70% спирт - 3 мин, 90% спирт - 3 мин, 96% спирт - 10 мин. Готовые образцы сушили на воздухе и монтировали на столики для электронной микроскопии.
Необходимое для электронномикроскопических исследований токопроводя-щее покрытие получали методом ионного напыления в течение 8-10 минут при постоянном токе 5-7 мА на установке JFC-1100 (JEOL, Япония). В качестве напыляемого материала применяли медь. Для исследования структуры поверхности образцов, количества и морфологии адгезированных тромбоцитов использовали сканирующий электронный микроскоп JSM Т-ЗЗО (JEOL, Япония) и установку для получения оцифрованных изображений AN-10000 (Link Analytical, Англия). Визуализацию адгезированных тромбоцитов проводили при ускоряющем напряжении 5 кВ и токах пучка около 10 ПА. При меньших значениях ускоряющего напряжения резкость получаемого изображения недостаточна для анализа морфологии отдельных адгезированных клеток. При увеличении ускоряющего напряжения затрудняется возможность детектирования полностью распластанных тромбоцитов из-за значительного вклада в сигнал электронов, отраженных из объема образца.
Вычисление среднего объема тромбоцитов
Таким образом выработана следующая схема проведения экспериментов. 1. Приготовление ПОТ - центрифугирование цитратной крови при 100g в течение 20 минут. 2. Разбавление ПОТ физиологическим раствором в 10 раз (оптимально - 1 мл ПОТ и 9 мл физ. раствора). 3. Измерение углового распределения рассеянного на тромбоцитах света. 4. Восстановление распределений тромбоцитов по размерам из картины светорассеяния для набора коэффициентов преломления. Использовали мультимодальную модель анализа, коэффициент преломления среды пср = 1,33, индекс поглощения х - 0,001, коэффициенты преломления тромбоцитов п = 1,339; 1,350; 1,357; 1,370; 1,390; 1,417; 1,456; 1,530. 5. Вычисление СОТ и концентрации тромбоцитов из полученных распределений тромбоцитов по размерам для выбранных коэффициентов преломления. СОТ и концентрацию тромбоцитов при пср = 1,33, х = 0,001, п = 1,339; 1,350; 1,357; 1,370; 1,390; 1,417; 1,456; 1,530 вычисляли с помощью программ описанных выше. 6. Определение истинных СОТ и концентрации тромбоцитов. Строили графики зависимости СОТ и концентрации тромбоцитов от коэффициента преломления тромбоцитов. СОТ и концентрацию тромбоцитов находили при значении п = 1,388.
Время от забора крови до окончания исследований составляло 1-2 часа. Следовательно, необходимо выяснить влияние времени хранения тромбоцитарной плазмы в силиконизированном стеклянном бюксе на контролируемые свойства тромбоцитов (концентрацию, размер и коэффициент преломления тромбоцитов, их агрегационные свойства).
Концентрация тромбоцитов в конце эксперимента и после воздействия уксусной кислоты и напряжения сдвига колебалась в пределах 5 % относительно концентрации измеренной сразу после получения ПОТ. Такие колебания в счете совпадают с ошибкой измерения одной пробы клеток, равной 5%. Поэтому, изменения в концентрации тромбоцитов можно считать не значительными и принять, что концентрация тромбоцитов не менялась в течение всего эксперимента и после воздействий.
На рис. 10 представлены характерные графики зависимости концентрации тромбоцитов (рис. 10 а) и СОТ (рис. 10 б) от коэффициента преломления, полученные в начале эксперимента (сразу после выделения тромбоцитов из крови) и в конце эксперимента (через 1,5 -2,0 часа). Горизонтальная прямая соответствует концентрации тромбоцитов измеренной на счетчике клеток.
Основываясь на постоянстве концентрации тромбоцитов в плазме, из графика (а) находим, что коэффициент преломления п не изменился и равен 1,387 ± 0,002.
Из графика (б) находим размер тромбоцитов сразу после их выделения СОТис. ход = 6,0 + 0,2 мкм3 (кривая «исход» п = 1,387) и после хранения СОТпосле хранения = 5,8 ± 0,2 мкм3 (кривая «хранение» п = 1,387). И так, хранение тромбоцитов в силикони-зированном бюксе привело к незначительному уменьшению СОТ с 6,0 ± 0,2 мкм3 до 5,8 ± 0,2 мкм3, при этом коэффициент преломления не изменился.
Описанная выше процедура определения влияния хранения тромбоцитов в си-ликонизированной посуде на СОТ и п была проведена и для других 25 образцов ПОТ. В результате получили: СОТИСХОД = 5,9 + 0,4 мкм3, СОТПОСле хранения = 5,8 + 0,5 мкм3; иисход = 1,388 ± 0,004, «после храНения = 1,388 ± 0,005. По критерию Стьюдента, выборки значений СОТ ии дои после хранения совпадают с вероятностью 90%. Следовательно, при хранении тромбоцитов в течение 2 часов в стеклянной силико-низорованной посуде СОТ и коэффициент преломления не изменяются.
Изменение степени спонтанной агрегации, агрегации индуцированной АДФ и уксусной кислотой после хранения в силиконйзированном бюксе приведено в таблице 1.
Из таблицы 1 видно, что хранение в течение 2-х часов в силиконизированной посуде при комнатной температуре не влияет на агрегационные свойства тромбоцитов. Усредненный показатель степени агрегации практически не меняется как для агрегации индуцированной уксусной кислотой и АДФ, так и для спонтанной агрегации. Причем, по критерию Стьюдента, значения степени спонтанной и индуцированных агрегаций до и после хранения совпадают с вероятностью 90%.
Для иллюстрации возможностей разработанного метода было исследовано влияние сдвигового напряжения, изменения рН среды и контакта тромбоцитов с поверхностью биоматериала на СОТ и коэффициент преломления тромбоцитов.
В работе использовали слабые воздействия на клетки, т.е. такие при которых не происходит значительного уменьшения количества клеток в суспензии (за счет адгезии или агрегации), а происходят изменения свойств индивидуальных клеток. Это объясняется тем, что существующие биоматериалы, предназначенные для контакта с кровью, являясь тромборезистентными, как правило, не вызывают необратимой агрегации клеток.
Так как (было упомянуто ранее) программное обеспечение прибора "Mastersizer Micro" позволяет вычислять распределение частиц по размерам и их оптические свойства для однородных частиц, слабые воздействия осуществляли на тромбоциты выделенные из крови - плазму обогащенную тромбоцитами (ПОТ).
В качестве слабых воздействий на тромбоциты были выбраны изменение рН (воздействие уксусной кислотой концентрацией 20 мМ) и сдвиговое напряжение (5 у 10 дин/см ), которые осуществляли и контролировали с помощью лазерного агрего-метра "Aggregation analyzer 220LA" российской фирмы Biola Ltd, а так же хранение в тромбоцитарных контейнерах фирм Baxter (США) и Ravimed (Польша).
