Изучение фотосинтетического электронного транспорта в солюбилизированных и встроенных в липосомы пигмент-белковых комплексах фотосистемы 1 Плутахин Геннадий Андреевич

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ

ОБ ОРГАНИЗАЦИИ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОЙ ЭЛЕКТРОН- ТРАНСПОРТНОЙ ЦЕПИ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ 10

I.I. Пигмент-белковые и белковые комплексы фотосинтетических мембран и их функции 10

1.2.Цитохромы высших растений 17

1.3.Пигмент-белковые комплексы фотосистемы и структура реакционного центра 21

1.4.Пластоцианин и его место в электрон-транспортной цепи 29

1.5.Взаимодействие ферредоксина и ферредоксин-НАДФ-редуктазы с компонентами

электрон-транспортной цепи 34

1.6.Циклический электронный транспорт 39

ГЛАВА 2. ЗАДАЧИ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 44

2.1. Выделение хлоропластов 44

2.2. Выделение ПБК ФСІ 45

2.3.Определение относительного обогащения ПБК реакционными центрами 46

2.4.Приготовление липосом с ПБК ФСІ . 46

2.5.Спектры поглощения и дифференциальные спектры "окисление минус восстановление" . .47

2.6. Спектры флуоресценции 48

2.7. Запись дифференциальных спектров "свет минус темнота" и кинетики фотоиндуцированных окислительно-восстановительных реакций . 48

2.8.Восстановление НАДФ 49

2.9.Измерение фотоиндуцированного поглощения кислорода 49

2.10.Потенвдометрическое титрование 49

2.II.Регистрация замедленной флуоресценции . 50

2.12.Регистрация фотоиндуцированной энергизации протеолипосом 50

2.13.Реактивы и препараты 51

ГЛАВА 3. ОДНОЛУЧЕВОЙ ДИФЕРЕНЦИАЛЬНЫЙ СПЕКТРОФОТОМЕТР 52

3.1. Физические основы метода дифференциальной спектрофотометрии 52

3.2.Устройство, принцип работы и технические характеристики однолучевого дифференциального спектрофотометра 55

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПИГМЕНТ-ЕЕЖОВЫХ КОМПЛЕКСОВ С ЭКЗОГЕННЫМИ ДОНОРАМИ И АКЦЕПТОРАМИ ЭЛЕКТРОНОВ 65

4.1. Некоторые характеристики ПБК ФСІ 66

4.2.0кислительно-восстаноительные превращения Р700 в отсутствие доноров и акцепторов

электронов 69

4.3.Кислород как один из возможных акцепторов электронов 73

4.4.Влияние экзогенных доноров и акцепторов электронов на окислительно-восстановительные процессы в ПЕК ФСІ 79

4.5.Кинетические характеристики электрон-транспортной цепи,способной восстанавливать НАДФ 91

4.6.Обсуждение результатов главы 4 98

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ПУТЕЙ ЭЛЕКТРОННОГО ТРАНСПОРТА НА АКЦЕПТОРНОЙ СТОРОНЕ РЕАКВДОННОП) ЦЕНТРА ФОТОСИСТЕМЫ I 102

5.1. Реконструкция циклического электронного транспорта,индуцируемого ПЕК ФСІ в присутствии цитохрома с 103

5.2.Исследование восстановления НАДФ и циклического электронного транспорта в ПБК ФСІ с неполным субъединичным составом 109

5.3.Влияние глицерина на электрон-транспорт ные функции акцепторной части реакционного

центра ФСІ - 114

5.4.Влияние обработки мочевиной на электронный, транспорт на акцепторном участке реакционного центра 118

5.5.Обсуждение результатов главы 5 121

ГЛАВА 6. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЖТРОН-ТРАНСПОРТНЫХ СВОЙСТВ ПИШЕНТ-БЕЖОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ФОТОСИСТЕМЫ ВСТРОЕННЫХ В ЛИПОСОМЫ 125

б.І.Влияние встраивания ПБК ФСІ в липосомына характеристики окислительно-восстанови

тельных превращений Р700 в отсутствие доноров и акцепторов электронов

6.2.Окислительно-восстановительные процессы при добавлении к протеолипосомам доноров

и акцепторов

б.З.Взаимодействие Р700 с пластоцианином, цитохромом с и влияние на взаимодействие

азолектиновой мембраны

6.4.Краткое обсуждение результатов главы 6 .

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

• Пигмент-белковые и белковые комплексы фотосинтетических мембран и их функции
• Выделение хлоропластов
• Физические основы метода дифференциальной спектрофотометрии
• Некоторые характеристики ПБК ФСІ
• Реконструкция циклического электронного транспорта,индуцируемого ПЕК ФСІ в присутствии цитохрома с

Введение к работе

В результате фотохимических и химических процессов при фотосинтезе происходит преобразование энергии солнечного света в энергию химических связей, протекающее в несколько этапов. За трансформацию энергии у высших растений ответственны специализированные органеллы фотосинтезирующих клеток - хлоропласти,имеющие сложную мембранную организацию. Фотоиндуцированный транспорт электронов в мембранах тилакоидов протекает с участием пяти типов мембранных комплексов, взаимодействие между которыми осуществляется с помощью подвижных переносчиков различной химической природы. Изучение механизмов фотосинтетических процессов с целью прогнозирования продуктивности сельскохозяйственных растений на ранних этапах селекционного отбора является существенной научно-практической задачей. Интенсивное развитие генетики и генной инженерии позволяет надеяться на разработку в будущем способов совершенствования фотосинтетического аппарата. С другой стороны, весьма перспективным может быть использование положенных природой в основу фотосинтеза принципов преобразования солнечной энергии в другие формы, в том числе химическую и электрическую ( Calvin 1976.Борисов 1978, Клейтон 1984) путем создания искусственных систем.

Исследование многообразия процессов,приводящих к запасанию солнечной энергии, требует использования широкого круга современных методов.Немалая роль в этом принадлежит биофизическим методам. Первичные процессы фотосинтеза с момента поглощения хлорофиллом света до разделения и стабилизации зарядов в реакционных центрах фотосистем протекают по законам квантовой механики. В последующих темновых процессах электронного транспорта важную роль играют физико-химические процессы, а их исследование основано на анализе кинетики окислительно-восстановительных реакций,в которых участ- вуют редокс-компоненты электрон-транспортной цепи.

Поскольку фотосинтезирующие органеллы клеток высших растений сложны, весьма перспективным представляется исследование электронного транспорта на фрагментах хлоропластных мембран и отдельных молекулярных комплексах хлоропластов, а также в реконструированных мембранных системах, содержащих минимальное число компонентов, необходимых для выполнения отдельных фотосинтетических функций.

В настоящей работе исследуются электрон-транспортные пути, индуцируемые на свету пигмент-белковыми комплексами фотосистемы I из хлоропластов шпината в солюбилизированном состоянии и после встраивания их в азолектиновые липосомы. Основным методом исследования является анализ кинетики фотоиндудированных окислительно-восстановительных превращений Р700 и экзогенных доноров и акцепторов электронов. Необходимые для этого экспериментальные данные получены высокочувствительным методом дифференциальной спектро-фотометрии, для чего был построен однолучевой дифференциальный спектрофотометр с несколькими рабочими режимами. Использование разных режимов работы спектрофотометра дало возможность подобрать оптимальные условия для решения конкретных задач исследований.

Солюбилизированный ПБК ФСІ, как показано нами, в отсутствие акцепторов электронов способен восстанавливать растворенный в реакционной среде кислород. После введения в реакционную среду фер-редоксина и ферредоксин-НАДФ-редуктазы электронный поток на.акцепторной стороне реакционного центра переключается на НАДФ.Последующее добавление цитохрома с инициирует циклический электронный транспорт, за интенсивностью которого удобно следить по стационарному уровню окисленности цитохрома с. Обработка ПБК дьух-молярной мочевиной, а также удаление некоторых минорных субъединиц, ингибирует нециклический электронный транспорт.Полученные результаты показывают, что на акцепторной стороне реакционного цент- pa ФСІ на уровне железо-серных центров А и В имеет место разделение электронного потока на циклический и нециклический с участием двух пулов растворимого ферредоксина.

Встраивание П5К ФСІ в азолектиновые липосомы позволило реконструировать трансмембранную функцию реакционного центра,фото-индуцированный электронный транспорт в присутствии восстановленных ФМС и ДХФИФ в таких условиях находится под контролем энерги-зованного состояния мембраны. В присутствии пластоцианина кинетика темпового восстановления Р700 у протеолипосом имеет двухфазный характер, что, по нашему мнению, отражает различную ориентацию ПЕК относительно внешней поверхности мембраны.Исследование характеристик обеих фаз в различных условиях позволило предположить, что местом локализации пластоцианина в нативных хлоропластах является внутренняя поверхность мембраны тилакоидов, на которой находится и Р700. В протеолипосомах пластоцианин способствует восста-навлению реакционных центров,донорная часть которых отделена от него фосфолипидной мембраной.

ГМВА I. ОБЗОР ІШЕРАТУРН. СОВРЕМЕННЫЕ ПРОСТАВЛЕНИЯ ОБ ОРГАНИЗАЦИИ ФОТОСШТЕТИЧЕСКОЙ ЭЛЕКТРОН-ТРАНСПОРТНОЙ ЦЕПИ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ І.І.Пигмент-белковые и белковые комплексы фотосинтэтических мембран и их функции

Преобразование энергии солнечного света в химическую энергию протекает в специализированных органеллах фотосинтезирующих клеток - хлоропластах, представляющих собой сложные мембранные структуры.На первой (световой) стадии фотосинтетического процесса поглощение света специальными пигментами хлоропластов - хлорофиллом а и ъ приводит в итоге к разделению зарядов в реакционных центрах и последующему переносу электронов по цепи редокс-компонентов, асимметрично локализованных в сопрягающей мембране.Конечным результатом первичных процессов фотосинтеза является фотоиндуциро-ванное восстановление НАДФ и синтез АТФ. В последующей, темновой стадии АТФ и НАДФ-Н используются в ферментативных реакциях цикла Кальвина для ассимиляции С02» Кислород,являющийся побочным продуктом первичных стадий фотохимических реакций, играет огромную роль в стабилизации состава земной атмосферы.

По современным представлениям основной структурной единицей хлоропластов являются замкнутые мембранные образования - тилако-иды.Электронно-микроскопические исследования позволили выявить особенности топологической организации хлоропластов. Стопки тила- с кондов, плотно спресованных друг с другом по внешней поверхности двухслойных мембран,образуют граны, которые соединены между собой в пределах хлоропласта ламеллами строїш. Внешняя поверхность мембран стромы в отличие от плотно сжатых мембран граны находится в прямом контакте с внутрихлоропластным пространством (матриксом). В настоящее время считается, что первичные процессы фотосинтетического преобразования энергии обеспечиваются пятью мембран- ными комплексами, три из которых являются пигмент-белковыми;они содержат молекулы обеих форм хлорофилла, а также каротиноиды ( Bengis, Nelson 1975, Островская 1979, Markwell et.al. 1979, Гуляев и др. 1979, Гуляев, Тетенькин 1981, Anderson 1980). Около половины общего количества белка тилакоида и большую часть общего количества хлорофилла (см.обзор Anderson 1982ь ) содержит светособирающий комплекс.Основное назначение комплекса -поглощение световых квантов с последующим переносом энергии возбуждения к двум другим комплексам,имеющим в своем составе реакционные центры ФСІ (пигмент-белковый комплекс ФСІ) и ФС2 (пигмент-белковый комплекс ФС2).В реакционных центрах последних двух комплексов энергия возбуждения инициирует разделение электрических зарядов. Создаваемая при этом разность в окислительно-восстановительных потенциалах между первичными продуктами фотореакции и редокс-компонентами тилакоидов индуцирует спонтанный поток электронов вдоль электрон-транспортной цепи и обеспечивает восстановление ЕАДФ. В транспорте электронов по градиенту окислительно-восстановительного потенциала участвует четвертый мембранный комплекс ( Ьб/1 _ комплекс),имеющий в своем составе цитохромы f , ъ₅2 ^й железо-серный центр (белок Риске) ( Nelson,Neumann 1972, Hurt, Hauska 1981, Hurt et. al. 1981 ). Так как перенос электронов по цепи, включающей цитохромный комплекс,приводит к переносу через мембрану протонов внутрь тилакоида,часть энергии трансформируется в трансмембранную разность электрохимических потенциалов ионов водорода А Мц⁺ ( Hurt et.al. 1982). В результате внутритилакоидное пространство закисляется.И,наконец,разница в концентрации протонов по обе стороны мембраны используется пятым мембранным комплексом - сопрягающим комплексом, для образования АТФ ( см.Самуилов 1982 ).В хлоропластах этот белковый комплекс состоит из водорастворимой части, включающей актив- ные центры АТФ синтетазной и АТФазной реакций (CPj) и гидрофобной, которая погружена в мембрану и, по-видимому, служит протонным каналом (CP_Q).

Из хлоропластов при использовании мягких методов разрушения тилакоидов могут быть выделены "легкие" дигитонияовые частицы, представляющие собой замкнутые в везикулы ламеллы стромы.Такие частицы обнаруживают фотоактивность, присущую первой фотосистеме ( Wessels,Spijkertoer 1981 ). Помимо пигмент-белковых комплексов ФСІ в этих частицах содержатся цитохромный комплекс и пласто-цианин,пигментная часть обеднена хлорофиллом ъ ( v/arden, Bolton 1974, Кренделева и др. 1978). Тяжелая фракция частиц, получаемая при дифференциальном центрифугировании, содержит обе фотосистемы. Эти эксперименты, а также результаты электронной микроскопии, привели к выводу о том, что стромальная часть обогащена первой фотосистемой, в то время как перегородки гран содержат в

ОСНОВНОМ фотосистему 2. ( Andersson, Anderson 1980, Andersson, Haehnei 1982 ). ПБК ФСІ в гранах содержатся только в концевых зонах гранальных мембран и на внешней мембране.Сопрягающий фактор расположен, как и ПБК ФСІ,исключительно в расстыкованных областях тилакоидной мембраны ( Miiier,Staeheiin 1976).Свето-собирающий комплекс преимущественно расположен в тех же областях тилакоидов, где сконцентрированы ПБК <Ю2, т.е. в стыкованных Областях граны (Andersson , Anderson 1980,Andersson, Haennel 1982, Gerola 1981, Anderson 1982 Ъ ).

Цитохромный комплекс,по всей видимости,равномерно распределен ВО всех мембранах тилакоидов ( Sane et al. 1970, Anderson 1982a, Anderson , Maikin 1982 ). Жидкий мембранный матрикс, очеввдно, позволяет комплексам свободно передвигаться в пределах определенных частей тилакоида, осуществляя при этом взаимодействие компонентов фютосинтетической электрон-транспортной цепи друг с другом.Латеральная неоднородность в распределении фотосинтетических мембранных комплексов позволила сделать вывод об отсутствии в хлоропластах единых функционально-структурных электрон-транспортных цепей фотосинтеза ( Anderson,Andersson 1982), постулированных ранее в рамках широко принятой z - схемы.

Представление о трансверсальной организации тилакоидных мембран может быть получено на основе схемы,приведенной на рис.1. Такое расположение комплексов в мембране позволяет описать электрон-транспортные процессы в хлоропластах следующим образом.После поглощения КЕанта света хлорофильной антенной фотосистемы 2 энергия мигрирует к длинноволновой форме хлорофилла а с максимумом поглощения при 680 нм,являющейся первичным донором реакционного центра ФС2.Возбужденная молекула Р680 является сильным восстановителем, и электрон за время менее I не переносится на феофитин и далее передается связанному пластохинону Q ( shuvaiov et ai. 1980, Климов,Красновский 1982). Через последующий акцептор,вторичный хинон R. ,электроны попадают в пластохиноновый пул (Пх) ( iimesz 1973).При восстановлении молекул пластохинонов происходит присоединение протонов из внешней среды.

Результаты многих исследований указывают на то,что пигмент-белковые комплексы обеих фотосистем пронизывают тилакоидную мембрану насквозь.Донорные части реакционных центров при этом оказываются на внутренней стороне мембраны, в то время как акцепторные - на внешней.В результате разделение электрических зарядов в реакционных центрах фотосистем происходит трансмембранно. Окисленный при этом первичный донор ФС2 восстанавливается электронами , получаемыми от воды.Посредником в этом процессе является кислородвыделяющая система,представляющая собой белковый комплекс, локализованный'на внутренней поверхности тилакоидной мембраны. Система имеет четыре окислительных состояния,на что указывает сВетособирающии номп пейс.

Рис Л. Схема структурно-функциональной организации электрон-транспортной ЦЄПИ ВЫСШИХ растений ( Anderson, Andersson, 1980 ). четырехкратная периодичность выхода кислорода на серию коротких насыщающих вспышек света ( Joiiot 1968, Kok et ai. 1970, siabac, Evans. 1977 ). В результате окисления Н₂0 два протона остаются во внутреннем пространстве тилакоида, а атомы кислорода,объединяясь в молекулы еще в кислородвыделяющеи системе, покидают тила-коид и выделяются в атмосферу или включаются в другие метаболические процессы внутри клеток.

Восстановленные фотосистемой 2 молекулы пластохинона взаимодействуют с цитохромным комплексом и, по всей вероятности, представляют собой подвижный челнок, соединяющий разнесенные в пространстве ПБК ФС2 и цитохромяый комплекс. По данным кинетических исследований электронный транспорт на этом участке является лимитирующим все фотосинтетические процессы ( cM.Junge 1975).Далее электроны через цитохром / передаются пластоцианину.Пластоцианин, как и пластохиноны, по-видимому,также представляет собой подвижный ПереНОСЧИК,СОеДИНЯЮЩИЙ ЦИТОХрОМНЫЙ КОМПЛеКС С ПБК ФСІ. ( Anderson, Andersson 1982 ). На участке переноса электронов между фотосистемами при окислении пластохинона во внутреннее пространство тилакоида выделяются протоны. При этом разница энергий окислительно-восстановительных потенциалов переносчиков электронов трансформируется в разность электрохимических потенциалов ионов водорода.

Фотохимическим донором электронов фотосистемы I является специализированный мономер или димер хлорофилла а с максимумом поглощения В Области 700 НМ / Р700/ ( Dornemann, Senger 1982). При разделении электрических зарядов в реакционном центре ФСІ электроны передаются на ряд последовательных переносчиков, ассоциированных в пигмент-белковом комплексе фотосистемы I.Достигнув конечных акцепторов Р430 (железо-серных белков), электроны переносятся на свободный ферредоксин. Непосредственным донором окис- ленного F700,по-видимому,является пластоцианин ( Segal, Sykes 1978, Haehnel et al. 1979 ).

На уровне конечного акцептора электронов Р430 и свободного ферредокеина электронный поток может разделяться на циклический и нециклический ( Crowther et ai.i979|V/itt 1979 ). Регуляторные механизмы, с помощью которых происходит переключение электронного транспорта на альтернативные пути, изучены недостаточно. Через ферредоксш-НАДФ-редуктазу при нециклическом транспорте

ЭЛеКТрОНЫ Передаются ОТ СЕОбОДНОГО (перреДОКСИНа К ІЇАДФ ( Hiyama et al.1977). этом завершается световая стадия фотосинтетического процесса. Восстановленный ІІАДФ служит далее источником электронов в ферментативных реакциях цикла Кальвина.

В процессе циклического электронного транспорта электроны от ферредоксина переносятся к цитохромному комплексу. Дальнейшим путь электрона к окисленному Р700 сопряжен с трансмембранным'.переносом протонов, что приводит к фотоиндуцированной энергизации мембраны ( ^Hi^nd- ^e_fc al- 4 977 ).

Для получения оптимального потока электронов между двумя фотосистемами согласно приведенной схеме,очевидно,требуется,чтобы стехиометрическое соотношение между основными тремя электрон-транспортными комплексами было равно единице. Однако, неравномерное распределение комплексов между стромальной и гранальной частями, а также варьирование соотношения между комплексагли дают основание считать, что единая структурно-функциональная цепь отсутствует ( Anderson, Anderssonl 982).Поэтому _с ТОЧКИ ЗрЄНИЯ ПОС- ледних достижений в изучении гетерогенности распределения комплексов между отдельными частями тилакоидных мембран развиваются новые представления о взаимодействии комплексов между собой ( Anderson 1980, Crofts, V/raight, 1983 ).

Одним из способов регуляции электронного транспорта может быть распределение поглощенной энергии между ПБК ФСІ и ЇЇБК ФС2 (см. Bennett 1983, Салаи и др. 1981). Эту функцию может осуществлять светособирающий комплекс. Как показано ( ^кУІ^е е* ^а1« 1983, Telfer et al. І984, Allen 1984), светособирающий комплекс может обратимо фосфорилироваться с помощью специальной кино назы.Электронмикроскопическое изучение препаратов хлоропластов показало, что в нефбсфорилированном состоянии большая часть светособирающего комплекса находится в гранальной части тилакоида ( Kyle et al. 1983).После фосфорилирования комплекс мигрирует в стромальную часть. Авторы делят всю совокупность комплекса на прочно связанный с ПБК ФС2 и свободный. Свободная часть комплекса - первичный пул, который осуществляет регуляцию активности фотосистем, распределяя энергию как между отдельными реакционными центрами <Ю2, так и между $С2 и ФСІ. Однако, корреляция между процессом фосфорилирования светособирающего комплекса и распределением энергии между фотосистемами в некоторых случаях получена не была ( Haworth, Melis 1983 ).

Как следует из приведенных данных, структура фотосинтетического аппарата высших растений довольно сложна и до конца не изучена. Экспериментальные результаты по изучению отдельных стадий в переносе электронов и сопряженных с ними процессов синтеза АТФ противоречивы и нуждаются в серьезных уточнениях. В связи с этим представляет интерес рассмотрение имеющихся на сегодняшний день экспериментальных фактов, раскрывающих структуру и взаимодействие основных компонентов фотосинтетического аппарата.

1.2. Цитохромы высших растений

Основные цитохромы фотосинтетической электрон-транспортной цепи связаны с цитохромным комплексом, который, по всей видимости, участвует в двух альтернативных процессах электронного транспорта -В нециклическом И В циклическом ( Glovacek et al. 1979, Chain

1979, Crouther et all. 1979, Peters et al..1984 ).

Разработка метода получения комплекса в очищенном виде дала в руки экспериментаторов возможность исследовать структуру и частично функцию ЭТОГО комплекса ( Hurt, Hauska 1981, 1982, Krinner et ai. 1982 ). Помимо полипептида 142 кД комплекс содержит цитохромы f , Ъ_5бз и железо-серный центр в соотношении 1:2:1 (Hurt,Hauska 1981 ). Среднеточечный окислительно-восстановитель-ный потенциал цитохрома f + 365 мВ и не зависит от рН среды в пределах рН 6 -г 8, в то время как Е^ цитохрома ъ^ при рН 7 варьирует в пределах -80 * 120 MB ( Matsuzaki et al. 1975, Rich., Bendai 1980 ). В изолированном цитохромном комплексе возможны две формы цитохрома ъ_5бз ^с различными окислительно-восстановительными потенциалами ( Hurt , Hauska 1983 ). Железо-серный белок цитохромного комплекса может быть выделен в чистом виде ( Hurt et ai. 1981, Prince 1983 ). Его среднеточечный окислительно-восстановительный потенциал + 290 мВ.

Являясь пластохинол-пластоцианиновой океидоредуктазой,комплекс выполняет еще одну функцию - накачку протонов во внутри -тилакоидное пространство,окисляя пластохинон.Окисление пласто-хинона, по-видимомуосуществляется железо-серным центром. При этом хинон переходит в семихинонную форму, способную, в свою очередь, восстанавливать цитохром ^ъ5бЗ* Восстановление цитохрома f осуществляется железо-серным центром. Злектрогенная функция цитохромного комплекса была изучена на протеолипосомах ( Hurt et ai. 1982). При добавлении к суспензии протеолипосом, инкрустированных цитохромными комплексами, хинонов и окисленного пластоцианина, наблюдали восстановление последнего и энергизацию мембраны.

К настоящему моменту взаимодействие индивидуальных компонентов цитохромного комплекса друг с другом и с компонентами электрон-транспортной цепи выяснены не до конца.Экспериментальные данные, полученные при исследовании хлоропластов и изолированных цито-хромных комплексов, интерпретируются с точки зрения возможного участия комплекса в одном из двух альтернативных процессов: Q - цикле И Ъ -цикле ( SelakjWhitmarsh 1982,Crofts,Wraight. 1983, O'Keefe 1983 ). В случае Q - цикла электрон от хино-на передается железо-серному центру, а полученный при этом се-михинон восстанавливает один из цитохромов "Ьсбз* Для полного осуществления реакции необходимы две молекулы хинона, в результате во внутритилакоидное пространство выделяются четыре протона. Восстановленная молекула цитохрома tw₃ передает пару электронов второй молекуле цитохрома, локализованного ближе к внешней стороне мембраны. Далее электроны акцептируются связанным хиноном,находящимся в цитохромном комплексе ( Hurt, Hauska І98І). Этот хинон был назван v . Пластохинон v также участвует в циклическом электронном транспорте,принимая электроны от восстановленного ферредоксина. Чувствительность к анти-мицину А в случае нециклического электронного транспорта объясняется ингибированием антибиотиком участка восстановленный ци- тохром ъ_сГ-> - связанный хинон V . В этом случае Q -цикл раз-рьз рывается, и электрогенная функция цитохромного комплекса, связанная с линейным транспортом,нарушается.Однако,в присутствии антимицина А возможно циклическое фосфорилирование через циклический медиатор ферредоксин, который способен взаимодействовать с хиноном V . При ъ - цикле транслокация протонов во внутритилакоидное пространство осуществляется цитохромами ^ъ5бз* Обе схемы предполагают дополнительную петлю, осуществляющую накачку протонов внутрь тилакоида. Такая петля работает только в циклической цепи.

Вопрос о пути окисления цитохрома f остается спорным несмотря на многочисленные доказательства расположения компонентов электрон-транспортной цепи в следующей последовательности: цито-хром f - пластоциашш -F700 ( Plensnicar, Bendall 1973, Davis et ai. 1980). О таком расположении переносчиков свидетельствуют эксперименты по реконструкции электрон-транспортной цепи последовательным введением в реакционную среду цитохрома и пластоциа-нина ( Curtis et ai. 1973), а также по изучению констант прямых реакций цитохрома f и пластоцианина с Р700 ( v/ood,Bendall 19?5). В то время как в зависимости от способа получения ПЕК ФСІ константа для взаимодействия Р700 с цитохромом не превышала

4 «10 с . М , аналогичная константа для пластоцианина была

7 —Т —Т больше 10' „ с . М . К такому же выводу о расположении переносчиков е электрон-транспортной цепи приводят результаты по реконструкции фотосистемы I при иммобилизации ПБК ФСІ ( Христин , 1984 ).

Помимо двух уже описанных цитохромов в хлоропластах высших растений регистрируется еще два цитохрома типа ъ с максимумом в дифференциальном спектре "окисленный минус восстановленный" при 559 нм. Различают деэ типа цитохромов ъ^ - низкопотенциальный и Еысокопотенциальный ( "b_55gLp и Ъ^дНР ' соответственно ) ( Rich, Bendall,1980 ). Высокопотенциальная форма имеет окислительно-восстановительный потенциал,близкий к потенциалу цитохрома f vоколо + 370 мВ). Для цитохрома ^Ъ559ЬР яотєндиал равен +20 мВ. Некоторые авторы высказывают мнение, что низкопотенциальная форма является модифицированной формой Еысокопотен-циального цитохрома ( Matsuda,Butler 1983 ). Повреждение цитохрома в процессе выделения хлоропластов действительно имеет место, однако, модифицированные формы имеют потенциал в области +55 -f + 100 мВ, т.е. значительно более высокий, чем у цитохрома ^Ъ559ЬР нативных хлоропластов. При выделении хлоропластов питохром ^Ъ559НР ассоциирован с фотосистемой 2, но низкопотенциальная форма регистрируется совместно с цитохромным комплексом или во фракции Д-І44. От щтохромного комплекса Ъ₅сдтр удается отделить солюбилизацией в растворе холата и октилглюкозида.

1.3. Пигмент-белковые комплексы фотосистемы I и структура реакционного центра

Активным началом фотосинтетических реакций являются реакционные центры фотосистем.Локализация и пространственная ориентация реакционных центров в тилакоидной мембране обеспечивает разделение конечных продуктов фотореакции (окисленного первичного донора и восстановленных акцепторов) в пространстве так, что окисленный донор находится Енутри, а восстановленные акцепторы - снаружи тилакоида.Трансмембранное разделение электрических зарядов обеспечивается, по-видимому, специальной организацией реакционных центров.

Первичным донором фотосистемы I является мономер или димер хлорофилла а , обнаруживаемый по уменьшению оптической плотности при окислении в области 700 и 430 нм и по сигналу ЭПР от катион-радикала Р700 ⁺ ( Hiyama, Ке 1972, Den Blanken, Hoff 1983 , O'Maiiey , ВаЪсоск 1984 ). В различных условиях Р700 титруется как одноэлектронный переносчик со среднеточечным окислительно-восстановительным потенциалом около +460 мВ (Шувалов 1976 ).

По современным представлениям перенос электронов между компонентами реакционного центра происходит по туннельному механизму.В пользу этого свидетельствуют результаты экспериментов по влиянию низких температур на скорость восстановления Р700 после выключения действующего света ( Mathis, Sauer 1978, Ке et al,-1979,Mathis, Gonjfaud 1979 , Бухов,Карапетян 1978,1979). Окисление P700 под действием света с последующим темновым восстановлением в результате рекомбинации восстановленного акцептора с окисленным Р700 можно наблюдать вплоть до 5К.

Применение методов дифференциальной спектрофотометрии и метода ЭПР позволило определить состав акцепторов реакционного центра и последовательность их взаимодействия друг с другом.Дан-ные по изучению акцепторной части РЦ ФСІ суммированы в обзорных статьях ( Ке 1973, 1978, Mathiв 1980, Шувалов, Красновский 1981).

Конечными акцепторами реакционного центра являются структурно с ним связанные железо-серные белки с окислительно-восстановительными потенциалами -550 И - 590 мВ ( Chamorovsky , Gam-mack , 1982). Впервые анион-радикалы восстановленных акцепторов были зарегистрированы методом ЭПР ( Malkin, Bearden 1971, Bearden,Maikin. 1972a ). Ки наряду с изменениями в дифференциальном спектре Р700 обнаружил широкую спектральную полосу в области 430 нм, отождествленную впоследствии с полученным ранее сигналом ЭПР ( Hiyama, Ке 1971). По максимуму в дифференциальном спектре акцептор был назван Р430. Измерения окислительно-восстановительных превращений Р700 и Р430, проведенные рядом исследователей ( Bearden,Malkin 1975, Шувалов и др. 1976 ), показали тождественность их кинетических характеристик. Было также обнаружено, что на каждый поглощенный фотон продуцируется один окисленный Р700 И ОДИН восстановленный ЖелеЗО-СерныЙ центр ( Bearden, Malkin 1972ъ ). Для объяснения результатов окислительно-восстаноштельного титрования было предложено существование дєух железо-серных центров,обозначенных А и Б. Центр А имеет более высокий окислительно-восстановительный потенциал ( Ке et ai. 1973, Evans 1975, Heathcote et al., 1978 ).

Промежуточным переносчиком электронов и донором для Р430 является также железо-серный белок с окислительно-восстановительным потенциалом - 705 мВ, обозначаемый А2 или X ( Evans , Cammack 1975, Evans et al. І98І,ЧаморовскиЙ,Каммак 1983). Этот белок в свою очередь восстанавливается от акцептора Aj, названного первичным акцептором первой фотосистемы. По результатам спектральных измерений и ЭПР спектрометрии, достаточно противоречивых, природа первичного акцептора точно не установлена.Считается, что в роли этого акцептора могут выступать димер или моно-мер хлорофилла а ИЛИ федштш ( Shuvalov et al..1979; Baltimore, Malkin 1980, Swarthoff et al. 1982, Ikegarai Ke 1984 ).

В последнее время при низких окислительно-восстановительных потенциалах среды методом ЭПР зарегистрирован триплетный сигнал, появляющийся в результате рекомбинации радикалов Р700⁺ и Aj . Показано, что сигнал отсутствует, если последующие акцепторы находятся в окисленном состоянии. Из этих результатов авторы делают вывод о существовании более раннего, чем Aj , акцептора электронов,Обозначенного ШЛИ A ( Eonnerjea, Evans 1982, Gast et al. 1983).

Как следует из изложенного материала,акцепторная часть реакционного центра достаточно сложна, а функциональная роль каждого из элементов акцепторной стороны понятна не до конца.Весьма спорным является вопрос о последовательности расположения и взаимодействии между собой железо- серных центров А и В. Исходя из значений окислительно-восстановительных потенциалов центр А при линейном расположении переносчиков должен являться терминальным акцептором реакционного центра. Однако, как показали исследования различных фотосинтезирующих организмов, не всегда соблюдается указанное ранее соотношение редокс-потенциалов для центров А и В. Примером МОГУТ СЛУЖИТЬ ЦИанобактерИИ Phormidium laminosum и хлоропласти ячменя, у которых потенциал центра В по сравнению с потенциалом центра А более Положительный ( Cammack et al., 1979, Uuget et ai.,1981). Чаморовским и Каммаком показано,что в широком диапазоне температур не наблюдается взаимодействия между железо-серными центрами, что указывает на работу их в параллельных цепях ( Chamorovsky,Cammack ., 1982).К Такому ЖЄ выводу приводит избирательная инактивация центра В мочевиной ( Goibec, warden, 1982). Однако,аналогичные работы по действию этиленгликоля,инактивации центра В диазонием, а также ЭПР спектрометрия при низкой температуре приводят к утверждениям о последовательном расположении Центров ( Evans,Heathcote l980,Malkin 1984). Таким образом реакционный центр может быть представлен следующей схемой:

Р70СГ (?4Ь0)

Фд-НАДФ-редуктаза

Рис. 2. Схема электрон-транспортных путей в реакционном

Центре ФОТОСИСТеМЫ I. \ Ке 1972, Bouges 1980, LIathis,Pailotin 1981).

На схеме стрелками указаны переходы и времена рекомбинации электронов восстановленных акцепторов с окисленным Р 700.Рекомбинация наблюдается в том случае, если последующие акцепторы находятся в восстановленном состоянии. Время рекомбинации возрастает с удалением акцептора от первичного донора.Стабилизация электричес- ких зарядов в реакционных центрах осуществляется, по-видимому, за счет увеличения расстояния между Р700 и акцепторами, а также за счет конформационных изменений компонентов в процессе окислительно-восстановительных изменений. Данные по влиянию температуры на перенос электронов указывают на туннельный механизм переноса между Р700, Ар А₂ И Р430 ( Бухов 1979; Ке et al. 1979, Visser et al. 1974).

Исследования с помощью ряда методов показали, что компоненты электрон-транспортной цепи расположены в мембране асимметрично в

СТрОГО Ориентированном ПОЛОЖеНИИ ( СМ.Обзоры Trebst 1974, Hauska 1975, Anderson, Andersson 1982 ). На пространственное разделение электрических зарядов указывает электрохромный сдвиг в спектре поглощения каротиноидов ( Duysens i954,Bait-sheffsky 1974 ). Трансмембранное разделение электрических зарядов возможно уже на уровне первичного донора Р700 и первичного акцептора Aj реакционного центра ( Hauska 1980 ).Расстояние между Р700 и Р430 оценено приблизительно в 40 Я , что согласуется с данными по измерению толщины фосфолипидной мембраны ( vis-ser et al. 1974 ).

Реакционный центр ФСІ является составной частью пигмент-белкового комплекса фотосистемы.ПЕК <ЕС1 по оценкам Гуляева и Тетенькина ( Гуляев, Тетенькин 1981) представляет собой элипсо-ид вращения с большой осью,параллельной плоскости тилакоидной мембраны. В комплексе ассоциировано несколько форм хлорофилла а, различающихся положением максимума поглощения в красной области спектра.

Применение различных методов выделения с использованием детергентов позволило получить ПЕК ФСІ с различным содержанием как пигмента,так и белка.Работы Нельсона позволили установить белковый субъединичный состав ПБК ФСІ и определить роль отдельных субъеДИНИЦ ( Nelson,Hotsany 1977, Bengis,Nelson,1977 ).

После обработки ПБК ФСІ детергентом при электрофорезе в поли-акриламидном геле выявляются шесть полос, обозначенных в порядке уменьшения электрофоретической подвижности латинскими цифрами от І до УІ. Субъединица I представляет собой полипептид 70 кД и имеет в своем составе хлорофилл. Светоиндуцпровашюе уменьшение поглощения при 700 нм указывает на присутствие первичного акцептора Aj и первичного донора Р700. Результаты по ЗПР-спектро-метрии показывают полное отсутствие у таких препаратов железо-серных центров.Препараты не способны окислять пластоцианин и восстанавливать НАДФ после введения в реакционную среду необходимых для этого компонентов. Протеолипосомы, инкрустированные первой субъединицей ПБК ФСІ, производят светоиндуцированное тушение флуоресценции 9-аминоакридина в присутствии циклического медиатора электронного транспорта ФМС ( Hauska І98Ш ), что может свидетельствовать о том, что трансмембранное разделение электрических зарядов в РЦ ФСІ происходит на уровне первичного донора и первичного акцептора.

Субъединицы I7,7_f7I с молекулярными весами 18,16,8 кД,соответственно, определяют способность ПБК восстанавливать НАД в присутствии пластоцианина или искусственных доноров электронов. Удаление легких субъединиц не влияет на хлорофильный состав антенн ( Takabe et ai. 1983).С этими субъединицами, возможно, связаны железо-серные центры,однако,вопрос локализации акцептора в какой-либо из субъединиц на сегодняшний день остается открытым. Следует учесть, что по данным низкотемпературного ЭПР спин-спиновое взаимодействие центров А и В указывает на близкую их локализацию друг к другу (5-6А), поэтому они могут быть расположены в одной молекуле ( Aasa et ai. 1981). В этом случае три указанные субъединицы могут обеспечивать необходимую конформацию реакционного центра,обеспечивающую взаимодействие Р430 со свободным ферредоксином и ферредоксш-ШЩФ-редуктазной.

В отсутствие третьей субъединицы с молекулярным весом 20 кД пигмент-белковые комплексы оказываются не способными окислять пластоцианин ( Наьішеї et аі. 198О). Однако,введение в реакционную среду катионов стимулирует донорную функцию пластоцианина,и поэтому считается, что основная задача третьей субъединицы состоит в понижении активационного барьера реакции пластоцианин -Р700 ( Bhardwaj et al. 1982 ).

Вторая субъединица с молекулярным весом 25 кД по мнению Бенджис и Нельсона ( Bengis,Nelson, 1977), по всей видимости, к структуре комплекса прямого отношения не имеет.

На основе результатов по двухмерному электрофорезу в поли-акриламидном геле Кокс и Миллер ( Соз:,Миііег 1983) пришли к выводу, что первая субъединица в некоторых случаях может быть полипептидным димером. Вторая и третья субъединицы находятся недалеко от первой и слабо ассоциированы друг с другом. Наоборот, между четвертой и пятой субъединицей наблюдается более тесная ассоциация.

Объединив данные об акцепторах ФСІ с результатами исследований по влиянию белковых компонентов ПБК ФСІ на электрон-транспортные свойства реакционного центра ФСІ Бенджис и Нельсон предлошши следующую модель реакционного центра ФСІ:

бнешняй поверхность мембраны

Рис. 3. Модель структуры реакционного центра фотосистемы I ( Bengis, I-Ielson, 1977 ).

Донор электронов в модели ассоциирован с двумя субъединицами компонента I. По мнению авторов модели реакционного центра,первая субъединица включает помимо 40 молекул хлорофилла а одну молекулу каротиноида.

Для шпината было показано, что хлорофильная антенна фотосистемы I содержит около 210 молекул пигмента, что несколько меньше размера антенны фотосистемы 2 ( Haworth et al.1983, Melis, Anderson 1983 ). По современным данным реакционные центры ФС2 делят на два типа $02^ и ФС2^ ( Anderson,Melis І983), В то время, как ФС2_Л локализуется в гранальной части тилакоида, ФС2уз находится в строме. Соответственно, отношение числа молекул антенного хлорофилла к числу реакционных центров Р680 равно 234 и 100. Существенная разница в размерах антенны гранальных и стромаль-ных комплексов, очевидно, отражает результат различной освещенности двух областей тилакоида.Около 77 % хлорофилла ъ связано с ФС2 ( Melis,Anderson 1983). Антенна ФСІ представлена несколькими спектральными формами хлорофилла а .Поэтому, в зависимости от степени очистки ПБК ФСІ получают препараты с различными спектральными характеристиками поглощения и излучения ( Mullet et ai. 1980).

Реакционные центры ПБК ФСІ находятся в фотохимически активном состоянии,даже если отсутствуют минорные субъединицы.В таком случае стабилизация электрических зарядов,по мнению Нельсона,осуществляется скорее всего за счет восстановления растворенного в среде кислорода (Bengis,Nelson 1977). В зависимости от использованных детергентов и их концентрации получены ПБК с различным.:, обогащением реакционными центрами по отношению к общему хлорофиллу. В препаратах, полученных с использованием тритона Х-100,отношение хлорофилла к содержанию фотоактивного пигмента составляет 20-30, а наиболее обогащенные реакционными центрами фрагменты, 'полученные обработкой выделенных с помощью дигитонина ПБК диэ-тиловым эфиром, имеют 5-9 молекул антенного хлорофилла на реакционный центр ( Кренделева и др. 1978,Гуляев и др. 1979). При использовании sds и тритона Х-100 получены комплексы,наиболее простые по составу с достаточно высоким обогащением ( хлорофилл/ /Р700 = 40-50 ). ( Bengis, Nelson 1977,Marwall et al.1979, Mullet et ai. 1980). В зависимости от метода получения препаратов в них могут полностью отсутствовать ( Bengis,Nelson 1977) или сохраняться (Brown І978) цитохромы и пластоцианин. Концентрация детергента в реакционной среде может определять вторичную структуру белков реакционного центра, что может сказываться на характере взаимодействия Р700 с аскорбатом (Захарова и др.1982).

1.4. Пластоцианин и его место в электрон-транспортной цепи

Вторичным донором реакционного центра ФСІ, по всей видимости, является пластоцианин. Этот белок с молекулярным весом около 10 кД является металлоферментом. Активный центр пластоцианина содержит медь, изменением валентности которой определяются окислительно-восстановительные свойства белка. В окисленном состоянии пластоцианин имеет интенсивный голубой цвет, в спектре поглощения присутствует широкая полоса с максимумом в области 590-600 нм. При восстановлении меди голубая окраска исчезает.Среднеточечный окислительно-восстановительный потенциал пластоцианина + 370 мВ, что близко к потенциалу цитохрома f ( + 365 мВ ). Белок довольно устойчив к нагреванию и изменению рН среды. Он легко восстанавливается аскорбиновой кислотой, цитохромом с и другими естественными и искусственными восстановителями. Пластоцианин - кислый белок с изоэлектрической точкой около рН 4,0.

Поскольку цитохром f и пластоцианин обладают почти одинаковыми потенциалами,местоположение их в электрон-транспортной цепи вызвало дискуссии.Вторым обстоятельством,усложнявшим интерпретацию экспериментальных результатов,являются физико-химические свойства пластоцианина.Пластопианин - гидрофильный белок,легко вымываемый при выделении хлоропластов или субхлоропластных фрагментов.Дефицит по пластоцианину в таких препаратах сказывается на скорости электронного транспорта, а в итоге на восстановлении НАДФ и синтезе АТФ (см.Рубин,Кренделева 1972).Добавление к препаратам экзогенного пластоцианина значительно стимулирует нециклические электрон-транспортные процессы (Ке, Shaw 1972).Однако, и в отсутствие пластоцианина цитохром f способен восстанавливать реакционные центры, окисленные светом ( Heiscm,Racker 1972 ). На основании действия коротковолнового и длинноволнового света на редокс - состояние цитохрома ^ и пластоцианина в хлоропластах было высказано предположение об участии пластоцианина как в циклическом,так и в нециклическом электронном транспорте, в то время как цитохром f в циклический транспорт не включался (АкулоЕа,Рощина 1977).Такой же точки зрения придерживается ряд других авторов ( Davis et ai. 1980, Wood 1974 ). Определенную роль в решении вопроса о последовательности этих переносчиков в электрон-транспортной цепи сыграло изучение электрон-транспортных процессов при избирательном ингибировании пластоцианина цианистым калием или ионами двухвалентной ртути ( Kimimura, Katon 1972, Olsen', Сох 1979 ). При введении В реакционную среду кси окисление цитохрома f и восстановление Р700 ингиби-руется. Однако, цитохром в таких условиях способен восстанавливаться от ФС2. К аналогичному эффекту приводит обработка хлоропластов хлористой ртутью, однако, цитохром в таких условиях восстанавливаться не способен ( oisen, Сох 1979 ). Авторы предполагают,что ртуть ингибирует электрон-транспортную цепь в двух местах, а цитохром f служит донором электронов для пластоцианина. При импульсном освещении хлоропластов кинетика темного восстановления Р700 состоит из трех фаз с временами 20, 200 мкс и 10 мс. Последняя наиболее медленная фаза - результат притока электронов от ФС2 ( Witt 1979). Время окисления пласто-цианина совпадает со второй фазой, что указывает на взаимодействие его с окисленным Р700. Наиболее быстрая фаза с временем полувосстановления 20 мкс чувствительна к присутствию цианида и ртути. Это дало основание предположить существование тесного комплекса между пластоцианином и реакционным центром, возможно через третью субъединицу ( Haehnel et al. 1979, Bengis,Nelson 1977).

Стехиометрическое отношение пластоцианйн: Р700 значительно выше единицы. Это может указывать на существование объединенного пула пластоцианина, осуществляющего взаимодействие цитохромного комплекса с реакционным центром ( Selak,\7hitmarsh.l984). Не исключено, что время восстановления 200 мкс Р700 реакционного центра -результат именно такого процесса. Несмотря на относительно высокую долю нейтральных галактолипидов в составе тилакоидной мембраны ( 80 % общих фосфолишщов), общий заряд тилакоида отрицательный. Это означает, что с поверхностью мембраны кислый белок связывается плохо. Закисление внутритилакоидного пространства в процессе сопряженной с электронным транспортом энергизации и хлоропластов должно понижать заряд как мембраны, так. и пластоцианина, что может повышать скорость диффузии, белка по мембране. Если учесть, что цитохромные комплексы распределены равномерно и свободно передвигаются в достаточно жидком липидном матриксе,то расстояния,преодолеваемые пластоцианином относительно невелики. Однако не исключено, что пластоцианйн может диффундировать не только в пределах некоторых локальных участков, но и из стромаль-ной части в гранальную и наоборот.

Как уже отмечалось,добавление экзогенного пластоцианина к субхлоропластным частицам ФСІ,обедненным пластоцианином,приводит к интенсификации электронного потока и увеличению степени окис-ленности цитохрома f ( Curtis et ai.I973). Однако, при восстановлении таким образом электрон-транспортных функций, не удается получить сопряженной с переносом электронов энергизации мембраны. Это, по-видимому, указывает на некоторое отличие места включения экзогенного пластоцианина в электронный транспорт по сравнению с эндогенным.

Способность экзогенного пластоцианина включаться в электронный транспорт в субхлоропластных частицах привела к предположению о локализации его с внешней стороны тилакоидной мембраны (Bohme 1978).Относительно большое расстояние между молекулой пластоцианина и первичным донором реакционного центра Р700, находящимся на противоположной стороне мембраны, явилось причиной поисков конкретных механизмов взаимодействия пластоцианина и Р700.Одним из таких механизмов может быть туннелирование электрона с участием виртуальных уровней (Воробьева и др. 1983). В рамках таких представлений зависимость константы скорости реакции между донором и акцептором от расстояния между ними более слабая,чем при прямом туннелировании, и перенос электронов может происходить на расстояния, превышающие 10 й.

Разработка методов получения фракций субхлоропластных частиц в нормальном и вывернутом состоянии позволила показать, что экзогенный пластоцианин эффективно восстанавливает реакционные центры именно той фракции, в которой Р700 находится с наружной

СТОРОНЫ Мембраны (вывернутые ЧаСТИЦЫ) ( Haehnel et al. 1981 )

Поэтому на сегодняшний день кажется более вероятным,что Пц локализован ближе к внутренней стороне мембраны тилакоида.

Искусственный медиатор циклического электронного транспорта

ДКФИФ в субхлоропластных частицах и нативных хлоропластах способен взаимодействовать с пластоцианином. В субхлоропластных частицах (отношение пластоцианин/Р700 = 0,3) в присутствии восстановленного ДХФИФ наблюдается две фазы темнового восстановления Р700. Быстрая фаза чувствительна к обработке цианидом калия. Обе фазы испытывают ускорение с увеличением концентрации ДКФИФ. Делается предположение, что за быструю фазу отвечают остатки в реакционной среде связанного с реакционным центром пластоцианина. В таких препаратах не наблюдается изменение редокс-состояния цитохрома f, что указывает на более высокое значение константы скорости взаимодействия пластоцианина с ДХФИФ по сравнению с константой взаимодействия С ЦИТОХРОМОМ ( Takano et al. 1982 ). .

Добавление солеи к хлоропластам ускоряет восстановление Р700 ОТ ЭКЗОГенНОГО ПЛастоциаНИНа ( Davis et al.1980,Takabe et al.1980). Эффективность процесса определяется главным образом валентностью и концентрацией катионов, но не анионов.Отсутствует, в связи с этим, явная зависимость константы взаимодействия от ионной силы (Lien, San Pietro 1979, Chain,1979 ). Изменение константы взаимодействия доноров с Р700 наблюдается также при варьировании рН среды. Это дает основание предполагать электростатический характер взаимодействия пластоцианина с Р700. Однако,повышение концентрации соли в реакционной среде не исключает конформационных изменений у макромолекул.

По рентгеноструктурным исследованиям молекула пластоцианина имеет размеры 4,0 х 2,8 х 3,2 нм и в ней идентифицированы две возможные области электронного переноса: отрицательно заряженная И гидрофобная (СМ. Обзор Crofts, Wraight 1983 ).

Зависимость от ионной силы раствора может свидетельствовать о том, что взаимодействие между пластоцианином и Р700 происходит с отрицательной стороны молекулы пластоцианина.

I.5.Взаимодействие ферредоксина и ферредоксин-НАДФ-редук-тазы с компонентами электрон-транспортной цепи

Фотохимические реакции, протекающие в фотосистеме I,обеспечивают быстрый перенос электронов - за время порядка 20 не ( Junge 1975),на железо-серные центры А и В.Следующим переносчиком в электрон-транспортной цепи ФСІ является растворимый ферредоксин, представляющий собой негемовый железо-серный белок. С помощью ферредоксин-НАДФ-редуктазы,содержащей ФАД,электроны далее передаются к НАДФ (см.обзор Bolton 1977).Ферредоксин -периферический белок и легко вымывается из мембран в процессе фракционирования хлоропластов, в то время как ферредоксин-НАДФ-редуктаза-интегральный протеин,остающийся в хлоропластах при их выделении ( Carriiio,Vaiiejos 1982 ). Восстановление НАДФ -двухэлектронныи процесс,однако ферредоксин является одноэлектрон-ным переносчиком с окислительно-восстановительным потенциалом --0,4 В. Это указывает на то, что на участке Фд - ферредоксин--НАДФ-редуктаза происходит преобразование одноэлектронного процесса в двухэлектронныи. Основную роль в преобразовании, по-видимому, играет флавопротеин ( Port, 1970,Клейтон 1984 ).

Роль ферредоксина не исчерпывается переносом электронов к ферредоксин-НАДФ-редуктазе. В зависимости от физиологического состояния фотосинтезирующего организма электронный поток может

НапраВЛЯТЬСЯ Также Как В ЦИКЛИЧескуЮ ЦеПЬ. (Crowther et al.1979), так и на кислород,находящийся в окружающем пространстве (Tefier et аі.1970, Редько и др. 1982,Chen,Arnon 1983). Способность ферредоксина принимать участие в альтернативных электрон-транспортных потоках,по-видимому, определяется свойствами как самого железопротеина,так и компонентов электрон-транспортной цепи, с которыми он взаимодействует.

Электрофорез ферредоксина в полиакриламидном геле дает две полосы с молекулярными весами II и 14 кД ( Христин,Акулова 1976, Imai et al. 1984, Незнайко и др. 1978, Гине и др. 1982 ).0бе молекулярные формы активны при восстановлении НДЦФ и имеют идентичные спектры поглощения, в то время как спектры ЭПР этих форм различаются ( Бурбаев и др. 1979 ). Различия в спектрах ЭПР указывают на то, что электронная и пространственная структура активных центров двух форм белка неодинакова.

Чаще всего встречаются ферредоксины,имеющие два или четыре иона железа на один активный центр белка ( Dutton, Rogers 1980 ). Каждый из трехвалентных ионов железа имеет в качестве лигандов четыре атома с еры. В восстановленном ... состоянии электрон приобретается только одним ионом железа, а в случае 4Fe - 4S - белка делокализуется между двумя или большим числом ионов железа.

Восстановленный ферредоксин способен непосредственно взаимодействовать с кислородом воздуха ( Telfer et al. 1970, Hosein, Palmer. 1983).Реакция характеризуется гиперболической зависимостью от концентрации кислорода, а первичным продуктом реакции является катион 0?>. Для поглощения одного эквивалента кислорода при этом требуется четыре эквивалента восстановительного ферредок-сина.Супероксидный радикал образуется также в том случае, если донором электронов для ферредоксина служит НАДФ«Н, однако для протекания реакции требуется присутствие ферредоксин-НАДФ-редук-тазы. Восстановленный ферредоксин реагирует не только с кислородом,но и с продуктом восстановления последнего - супероксидным ИОНОМ, а также С перекисью водорода ( Hosein, Palmer 1983 ).

Скорость реакции между ферредоксином и перекисью водорода в десять раз выше, чем между ферредоксином и кислородом.Способность восстановленного ферредоксина взаимодействовать с о*2 ^и %^2 может иметь определенное физиологическое значение в нативных хлоропластах. Все три вещества образуются при освещении изолированных

ХЛОрОПластов (Шувалов,КрасНОЕСКИЙ 1975, Diner,Mauzerall 1973, Vidaver et al., 1981, Telfer et al. ,-1970 ). Перекись водорода ИН-гибирует фотосинтетический процесе при низкой концентрации (ниже 10~⁵ М ). Активность каталазы, восстанавливающей HgOg до Н^О и Og, ингибируется аскорбатом, концентрация которого в хлоропластах может достигать высоких значений ( до 50 мм). Поэтому способность ферредоксина в хлоропластах взаимодействовать с продуктами восстановления кислорода может указывать на выполнение им защитной функции.

Биохимическое изучение ферредоксин -НАДФ-редуктазы также показало молекулярную гетерогенность этого фермента ( Gozzer et al., 1977, Hasumi et al. 1983 ). Было описано пять молекулярных форм ферредоксин-НАДФ-редуктазы, имеющих различный молекулярный вес и отличающихся друг от друга аминокислотным составом.Бее формы,однако, показали одинаковую способность переносить электроны от ферредоксина на НАДФ. По крайней мере восемь'форм флавопротеина получено в кристаллизованных препаратах ( Hasumi et al. 1983 ). Изобилие форм ферредоксин-НАДФ-редуктазы в последнем случае авторы объясняют активностью остаточной лротеазы, от которой невозможно было избавиться при выделении флавопротеина.По-видимому, гетерогенность ферредоксин-НАДФ-редуктазы является артефактом и

Определялась УСЛОВИЯМИ ВЫДелеНИЯ фермента И еГО Хранением ( Hasumi et al. 1983 ). Б противоположность этому показано, что условия Еыделения ферредоксина не являются причиной регистрации двух его молекулярных форм, хотя разрушение фермента также может приводить к увеличению числа полос при электрофорезе в полиакриламидном геле. Гетерогенность ферредоксина, возможно, имеет генетическую природу, так как содержание двух его форм варьирует в онтогенезе и под влиянием условий освещенности (Христин, Акулова 1976, Dutton, Rogers 1980 ).

Рентгеноструктурныи анализ кристаллизованных препаратов ферредоксин-НАДФ-редуктазы показал наличие двух областей белка, одна из которых необходима для связывания ферредоксина.Большое число'основных аминокислотных остатков образуют в молекуле ферредоксин-НАДФ-редуктазы кластер,который предположительно служит местом связывания ферредоксина,являющегося,как известно,кислым белКОМ ( Valle et al.1982;Hasumi et al. 1983 ). Аналогично СЧИ-тается,что флавопротеин имеет участок,специфически связывающий НАДФ.Исследования процесса диссоциации комплекса ферредоксин-НАДФ-редуктаза * НАДФ показали,что существуют деэ пункта связывания белка с НАДФ.Если один из них имеет высокое средство к НАДФ,является действительно специфичным к нему,то место низкого сродства,по мнению авторов,специфично к ферредоксину.По большинству оценок стехиометрия комплекса ферредоксин * Фд-НАДФ-редук-таза -v НАДФ представляет отношение 1:1:1 ( Bouges - Bocguet 1978).

Короткая вспышка света,вызывающая однократное срабатывание реакционного центра ФСІ,приводит к переносу к ферредоксин-НАДФ- рЄДуКТаЗЄ ОДНОГО Электрона За Время ОКОЛО 40 МКС (Bouges-Bocguet

1978).Образующиеся при этом полувосстановленные молекулы флаво- протеина в течение 30 мкс могут дисмутировать согласно реакции — о_ 2ФІГ = ФП лШ .Важным следствием этих исследований может быть предположение о возможной кооперации между разными акцепторными цепями ФСІ. Если такое предположение верно,то за счет обмена электронами между полувосстановленными флаЕОпротеинами могут создаваться условия,благоприятные для восстановления НАДФ.

Изучение Елияния концентрации ферредоксина на скорость восстановления НАДФ показало,что повышение содержания железопротеина более некоторой оптимальной величины приводит к ингибированию восстановления гшридиндинуклеотида хлоропластами и субхлоропластны- ми частицами (Замазова.Кренделева 1975,Редько и др.1982). Определенную роль в понижении скорости восстановления НАДФ с повышени-ем_ концентрации ферредоксина может играть трансгидрогеназная и диафоразная активность ферредоксин-ШЩФ-редуктазы,окисляющей НДДФ.Н в темноте и на свету (Макаров,Карташов 1971, McSwain,Arnon 1972).Высказано предположение,что концентрация ферредоксина в на-тивных хлоропластах может определять соотношение между нециклическими и псевдоциклическим электронным транспортом,регулируя тем самым соотношение между количеством синтезированного АТФ и восстановленного НДЦФ (Редько и др.1982).Это предположение подтверждается также тем,что поглощение протонов при циклическом электронном транспорте пропорционально концентрации ферредоксина в реакционной среде (Иванов,Тихонова І979).

Как уже отмечалось,ферредоксин-НАДФ-редуктаза расположена на внешней поверхности мембраны тилакоидов'преимущественно в ламе-лах стромы ( Bohme 1978).Гипотонически разрушенные хлоропласты требуют для восстановления НАДФ добавки в реакционную среду экзогенного ферредоксина, в то время как последующее введение ферре-доксш-НАДФ-редуктазы не изменяет кинетики восстановления ІЩФ. Это указывает на то, что в отличие от ферредоксина флавопротеин в таких условиях разрушения хлоропластов удерживается мембраной тилакоидов.Для вымывания ферредоксин-НАДФ-редуктазы из мембран используют буферы с повышенной молярностью солей.При обработке хлоропластов ЭДТА освобождается около 70 % флавопротеина,что приводит к выводу о необходимости для связывания белка с мембраной двухвалентных катионов ( Gozzer et ai.1977). Влияние солей на степень связывания белка с мембраной указывает на электростатический характер с ил, удерживающих ферредоксин-НАДФ-редуктазу ( сы-vert,Davis 1983).Изобилие нейтральных липидов, составляющих мембрану тилакоидов и не меняющих поверхностного потенциала при изменении ионной силы раствора,дало основание для предположения о том, что флавопротеин связывается с отрицательно-заряженными белковыми компонентами мембраны ( Carrilo, Vaiiejos, 1982 ). Повышение концентрации соли в среде приводит к ингибированию восстановления ЇЇАДФ. Іїомішо ослабевания при этом электростатических сил,удерживающих флавопротеин на поверхности мембраны,может меняться константа диссоциации комплекса Фд* ферредоксин-НАДФ-педуктаза ( Nakamura, Kimura 1971 ).

Сродство флавопротеина к ферредоксину и НАДФ определяется

НЄ ТОЛЬКО Концентрацией СОЛеЙ, НО И СОСТОЯНИеМ Мембраны ( Carrilo et ai. 1980, v/agner et ai. 1982). Показано, что на свету константа диссоциации комплекса ниже, чем в темноте.Ферредоксин,по-видимому, способствует связыванию флавопротеина с мембранным полипептидом с молекулярным весом 200-300 кД.В роли последнего может выступать ПБК Ф0І ( Wagner et al.1982). При этом редук-таза оказывается чувствительной к величине внутритилакоидного рН: с понижением рН вероятность образования связи между ПБК ФСІ и редуктазой понижается. Но и в этом случае ферредоксин-НАДФ-редуктаза остается связанной с мембраной.

1.6.Циклич ее кий электронный транс порт

В процессе ферментативного восстановления С0 в цикле Кальвина потребность АТФ превышает потребность ИАДФ'Н у растений Сд - типа в полтора раза.Для растений С^ - типа,у которых фиксация СО2 происходит по иному пути,отношение АТФ/НАДФ.її,необходимое для синтеза сахара,еще выше -2,5 (Белл I960).Восстановление одной молекулы НАДФ в хлоропластах связано с переносом по электрон-транспортной цепи двух электронов.Так как процесс электронного переноса сопряжен с синтезом АТФ, то важное значение приобретают исследования,связанные с выяснением количест- ва молекул АТФ, которые синтезируются в процессе переноса этой пары электронов. На основе экспериментов, проведенных на ранних этапах исследований, было показано, что при восстановлении одной молекулы НАДФ синтезируется также одна молекула АТФ. Это дало основание для предположения о дополнительном синтезе АТФ в результате циклического электронного транспорта вокруг фотосистемы I ( Urbach,Gimmer 1970, Slovacek et al. 1978, Crowther,Hind_;1980). Процесс образования АТФ по циклическому пути не связан с восстановлением НАДФ. Это компенсирует дисбаланс между необходимым числом макроэргических связей и количеством НАДФ»Н.

Возможный путь переноса электронов при циклическом фосфорили-ровании и участие в этом процессе компонентов хлоропластов обсуждались нами выше. На основании накопившегося экспериментального материала Ченом и Арноном ( Chen,Arnon- 1983 ) была представлена следующая схема циклической электрон-транспортной цепи:

РРОО-^Аі— Аг— FeS_B-—FeS_A

Пц ^<Рд ^x i^um.f— FeS^ PQ— цугп.Ь_5ЬЪ

В верхнем горизонтальном ряду схемы расположены компоненты реакционного центра ФСІ, в нижнем - цитохромного комплекса.Ферредок-син и пластоцианин выполняют в этом случае функцию подвижных переносчиков электронов. Эта схема не Еключает пул пластохинона, однако, как следует из ряда работ, пластохинон принимает участие в циклическом фосфорилировании ( ъ'бъше et al. 1971).Расположение железо-серных центров А и В в том порядке, как изображено на схеме, не является еще доказанным.

Основной трудностью, с которой приходится сталкиваться в процессе изучения циклического фотофосфорилирования, является существование альтернативного псевдояиклического транспорта, при

КОТОРОМ ЭЛеКТрОНЫ акцептируются раСТВОреННЫМ КИСЛОРОДОМ ( Elstner, Haupei 1973). В результате равновесие между синтезированным АТФ и восстановленным НАДФ сдвигается в сторону повышения относительного содержания АТФ. Для предотвращения протекания псевдоциклического электронного транспорта эксперименты проводят в анаэробных УСЛОВИЯХ ( Kylin et al., 1972 ).

Скорость фотофосфорилирования пропорциональна скорости потоков электронов и протонов (Тихонов и др.1982).

Изучение отношения АТФ/НАДФ'Н дало противоречивые результаты. При ингибировании кислородвыделяющей системы в качестве доноров электронов использовали бензидин и n,n,i ,и -тетраметил-бензидин. Первый из них помимо передачи электронов реакционному центру Еыделяет также протоны, что приводит к энергизации мембра-ны.В этих экспериментах максимальное отношение АТФ/2е, равное 0,9, получено при использовании в качестве донора электронов бензиди-на. Авторы считают, что полученное значение близко к значению в нативных хлоропластах ( Hart et al. 1974). При использовании второго донора, который не производит выделение протона,численное значение отношения АТФ/2е в два раза ниже, что отражает результат работы только пластохиноновой протонной помпы.

Для изучения циклического электронного транспорта используют липофильные искусственные кофакторы циклического фосфорили-рования,способные взаимодействовать с первой фотосистемой.Основным требованием,предъявляемым к таким кофакторам,является способность их к редокс-превращениям с участием электронов и протонов. Этому требованию удовлетворяют ДХФИФ и ФМС, широко применяемые для изучения фотоэнергетики (см.Булычев и др. 1979). Применение искусственных кофакторов циклического электронного транспорта оправдано не во всех случаях. Это объясняется тем, что они обеспечивают светоиндуцированную энергизацию мембраны не за счет акти- визации естественных пунктов энергетического сопряжения, а за счет создания искусственной петли вокруг фотосистемы I ( Bohme et ai. i97i|Braden,v»'inget 1974, Фадеева и др. 1982).

В ряде экспериментальных работ отношение АТФ/2ё равно или близко к двум ( Rosa 1979, Heber,Kirk 1975). В этом случае возникает проблема утилизации излишек АТФ.Так как темповая фиксация CCU - процесс более медленный по сравнению со скоростью синтеза АТФ и восстановления НАДФ, высокий уровень концентрации АТФ может прі-шодить к ингибированшо электронного транспорта и, соответственно, восстановления ЇЇАДФ. Как результат,ингибироваться будет весь фотосинтетический процесс в целом.

Противоречивы также результаты по изучению отношения числа выделенных внутрь тилакоида протонов к числу электронов,транспортированных от воды к НАДФ. Эта величина по разным оценкам варьирует от 2 до 4 (Saphon,Crofts 1977 , Иванов и др. 1984).

Изучение соотношения между количеством АТФ,синтезированного по альтернативным путям,проведенное Килином с соавторами (Куііп et ai., 1972, Kylin,Okkeh 1974) показало,что доля АТФ, синтезированного в результате циклического электронного транспорта,составляет 25 %.Ио оценке Ривса и Холла (:Reeves,Haii 1973 ) эта доля равна только І0 %. По мнению других авторов, электронный поток от воды к НАДФ полностью удовлетворяет потребности темно-еых реакций фотосинтеза в АТФ, который синтезируется в процессе

ЭНерГеТИЧеСКОГО СОПрЯЖеНИЯ С ЭТИМ ПОТОКОМ ( Heber.Kirk 1975 ).

В нативных хлоропластах низкая скорость циклического фото-фосфорилирования может быть результатом раннего светового насыщения ( Urbach, Gimmer 1950).Однако, циклическое фосфорилироваиие гложет иметь значение в начальный момент работы фотосинтетического аппарата после включения-света ( К1оЪ et ai. 1973). По- видимому, это необходимо для более быстрой энергизации мембраны. При низкой температуре или слабой освещенности листьев растений, когда скорость фотосинтеза незначительна,циклическое фосфорилиро-вание может играть более значительную роль ( Каратаев и др.1977). При выращивании клеток хлореллы на питательной среде,обедненной по азоту, вместе с изменением структуры хлоропластов наблюдается ингибирование функции фотосистемы 2.В этом случае АТФ синтезируется преимущественно в результате циклического электронного транспорта ( Попова.1984).

По мнению Л.Н.Белла, в условиях благоприятных для протекания фотосинтеза,количество световой энергии,запасаемой в виде макроэргических связей в процессе циклического фотофосфорилирова-ния,мало. Однако, в особых условиях, роль этого альтернативного пути может возрасти (Белл > 1980 ).

Таким образом,анализ литературных данных показывает, что задача,связанная с исследованиями путей переноса электронов и сопряженных с ними процессов при фотосинтезе у высших растений, до конца не решена, а отдельные её участки нуждаются в серьезных уточнениях.

class1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ

ОБ ОРГАНИЗАЦИИ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОЙ ЭЛЕКТРОН- ТРАНСПОРТНОЙ ЦЕПИ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ class1

Пигмент-белковые и белковые комплексы фотосинтетических мембран и их функции

Преобразование энергии солнечного света в химическую энергию протекает в специализированных органеллах фотосинтезирующих клеток - хлоропластах, представляющих собой сложные мембранные структуры.На первой (световой) стадии фотосинтетического процесса поглощение света специальными пигментами хлоропластов - хлорофиллом а и ъ приводит в итоге к разделению зарядов в реакционных центрах и последующему переносу электронов по цепи редокс-компонентов, асимметрично локализованных в сопрягающей мембране.Конечным результатом первичных процессов фотосинтеза является фотоиндуциро-ванное восстановление НАДФ и синтез АТФ. В последующей, темновой стадии АТФ и НАДФ-Н используются в ферментативных реакциях цикла Кальвина для ассимиляции С02» Кислород,являющийся побочным продуктом первичных стадий фотохимических реакций, играет огромную роль в стабилизации состава земной атмосферы.

По современным представлениям основной структурной единицей хлоропластов являются замкнутые мембранные образования - тилако-иды.Электронно-микроскопические исследования позволили выявить особенности топологической организации хлоропластов. Стопки тила с кондов, плотно спресованных друг с другом по внешней поверхности

двухслойных мембран,образуют граны, которые соединены между собой в пределах хлоропласта ламеллами строїш. Внешняя поверхность мембран стромы в отличие от плотно сжатых мембран граны находится в прямом контакте с внутрихлоропластным пространством (матриксом). В настоящее время считается, что первичные процессы фотосинтетического преобразования энергии обеспечиваются пятью мембранными комплексами, три из которых являются пигмент-белковыми;они содержат молекулы обеих форм хлорофилла, а также каротиноиды ( Bengis, Nelson 1975, Островская 1979, Markwell et.al. 1979, Гуляев и др. 1979, Гуляев, Тетенькин 1981, Anderson 1980). Около половины общего количества белка тилакоида и большую часть общего количества хлорофилла (см.обзор Anderson 1982ь ) содержит светособирающий комплекс.Основное назначение комплекса -поглощение световых квантов с последующим переносом энергии возбуждения к двум другим комплексам,имеющим в своем составе реакционные центры ФСІ (пигмент-белковый комплекс ФСІ) и ФС2 (пигмент-белковый комплекс ФС2).В реакционных центрах последних двух комплексов энергия возбуждения инициирует разделение электрических зарядов. Создаваемая при этом разность в окислительно-восстановительных потенциалах между первичными продуктами фотореакции и редокс-компонентами тилакоидов индуцирует спонтанный поток электронов вдоль электрон-транспортной цепи и обеспечивает восстановление ЕАДФ.

Выделение хлоропластов

Хлоропласти выделяли из листьев рыночного шпината ( Winget 1969). Листья выдерживали некоторое время на холоде,промывали водопроводной и дистиллированной водой.После удаления наиболее крупных прожилок листья гомогенизировали на холоде в буферном растворе, содержащем 0,35 М , 0,05 М фосфатный буфер ( рН 7,4), 0,2 М ЭДТА. На килограмм очищенных листьев затрачивали около литра буферного раствора.Полученную суспензию фильтровали через хлопчатобумажную ткань.Фильтрат центрифугировали в течение 1,5 мин при 500 х g для осаждения неразрушенных клеток и компонентов клеточной стенки. Полученный супернатант подвергали повторному центрифугированию при 1000 х g в течение 7 мин. Полученный осадок ресуспен-дировали в 0,2 М сахарозе, 3 мМ %сі2 , 3 мМ ксі , 50 мМ трис-HG1, рН 8,0 и дважды промывали в этом буфере. Хлоропласты концентрировали до содержания хлорофилла 6 мг/мл,добавляли глицерин до конечной концентрации 30 % и замораживали каплями в жидком азоте.В жидком азоте хлоропласты хранились в течение нескольких месяцев.Концентрацию хлорофилла определяли по методу Арнона ( Агпоп; 1949 ).

Физические основы метода дифференциальной спектрофотометрии

Поглощение света пигментами клеток фотосинтезирующих организмов приводит к разделению электрических зарядов в реакционных центрах и транспорту электронов по цепи молекул-переносчиков по градиенту окислительно-восстановительного потенциала.При переносе электронов происходит изменение в соотношении окисленных и восстановленных форм компонентов электрон-транспортной цепи. В процессе окислительно-восстановительных превращений целый ряд компонентов претерпевает изменение спектральных свойств в широкой области спектра.Небольшие изменения концентрации промежуточных продуктов окислительно-восстановительных реакций и соответствующие им незначительные изменения поглощения требуют для своего обнаружения современной высокочувствительной техники, способной регистрировать слабые изменения оптической плотности на фоне общего поглощения,создаваемого другими пигментами фотосинтетического аппарата. Одним из широко используемых для этого методов является дифференциальная спёктрофотометрия.Она позволяет в некоторых случаях исследовать фотосинтетические процессы в целых листьях растений и фотосинтезирующих микроорганизмах, а также в хлоропластах и субхлоропластных частицах.

Некоторые характеристики ПБК ФСІ

Как уже отмечалось в п. 2.2, ПЕК, полученные нами и:з хлоро-пластов шпината при электрофорезе в полиакриламидном геле, дают шесть белковых полос, которые отождествляются с шестью полипептидными субъединицами, образующими основу ПЕК (ЮІ. Отсутствие полос , которые модно было бы сопоставить с белковыми компонентами цитохромного комплекса или пластоцианином,указывает на отсутствие естественных для реакционного центра ФСІ доноров электронов.

В спектре поглощения препаратов ПЕК ФСІ при комнатной температуре основной максимум оптической плотности в красной области расположен при 673 нм (рис.6а).Отсутствие плеча в области 650 нм и относительно небольшое плечо при 575 нм указывает на обеднение препаратов хлорофиллом Ъ . Дифференциальный спектр "окисление минус восстановление" приведен в нижней части рисунка.Спектр характеризуется четырьмя полосами уменьшения поглощения с максимумами при 697,680,660,430 нм, а также увеличением оптической плотности в области 500 и при 445 нм. Спектр аналогичен дифференциальному спектру,полученному для ФС I другими методами ( Ке 1873, Шувалов и др. 1976). Для препарата,спектры которого приведены на рисунке 6, отношение Хл/ Р700 около 40.

Спектр низкотемпературной флуоресценции ПЕК ФСІ изображен на рис.7. Как следует из рисунка,максимум флуоресценции расположен в области 720 нм.

Реконструкция циклического электронного транспорта,индуцируемого ПЕК ФСІ в присутствии цитохрома

В нативных хлоропластах высших растений циклический электронный транспорт осуществляется растворимым ферредоксином и цито-хромным комплексом,которые в наших препаратах отсутствуют. Реконструкцию циклического потока электронов удобнее произвести добавлением в реакционную среду вместо b jj, _ цитохромного комплекса цитохрома с, поскольку последний доступен для исследователя в форме коммерческого препарата.

Штохром с является хорошим донором электронов для Р700. Как следует из рисунка 20, после добавления этого компонента скорость восстановления Р700 в препаратах ПБК ФСІ возрастает. Одновременно в ответ на включение действующего света увеличивается оптическая плотность при 550 нм, отражающая процесс окисления цитохрома с. Окисление цитохрома не обратимо после выключения света.

В длинноволновой части спектр аналогичен приводимому ранее дифференциальному спектру ЇЇБК ФСІ (рис.8), в то время, как в области 500-600 нм появляется серия новых полос.Основной максимум уменьшения оптической плотности находится при 550 нм, другой,менее.выраженный максимум,расположен при 517 нм.Кроме того, наблюдается увеличение поглощения при 536 и 565 нм. Форма спектра и положение основных максимумов в этой области полностью соответствуют дифференциальному спектру "цитохром с окисленный минус восстановленный", полученному нами на спектрофотометре " SPECORD uv vis ". Из этого можно сделать вывод, что на дифференциальном спектре "свет минус темнота" мы наблюдаем dt - полосу цитохрома с, окисленного реакционными центрами на свету.При добавлении пластощанина интенсивность линий в этой части спектра значительно возрастает,одновременно появляется плечо в области 590-600 нм, а максимум 565 нм сдвигается в длинноволновую сторону. По положению в спектре длинноволновое плечо совпадает с максимумом поглощения окисленного пластовданина.Как следует из рисунка 20, после введения в реакционную среду пластоцианина значительно ускоряется темновое восстановление Р700 и падает стационарный уровень его окисленности.