Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Электронный транспорт в мембране тилакоида. Структурные и функциональные аспекты 13
1.1.1. Пространственная организация хлоропласта и тилакоидной мембраны 14
1.1.2. Цитохромный bef комплекс 17
Цитохролі/. 20
Цитохром be 21
Железосерный белок Риске 21
1.1.3. Фотосистема 1 22
Структура фотосистемы 1 22 ,
Субъединицы фотосистемы 1 и их функции 23
Светособирающий комплекс 1 25
1.1.4. Пластоцианин 25
Структура 25
Диффузия в люмене тилакоида 27
1.1.5. Флаводоксин 29
1.1.6. Структуры фотосинтетических белок-белковых комплексов... 31
Комплекс пластоцианина и цитохрома f 31
Комплекс пластоцианина и фотосистемы 1 34
Комплекс фотосистемы 1 и флаводоксина 35
1.2. Экспериментальные данные по кинетике транспорта электрона 36
1.2.1. Кинетика реакции пластоцианина и цитохрома/в растворе 36
1.2.2. Кинетика реакции пластоцианина и фотосистемы 1 в растворе 38
1.2.3. Кинетика реакций пластоцианина с цитохромом/и фотосистемой 1 в люмене тилакоида 45
1.2.4. Кинетика реакции фотосистемы 1 и флаводоксина в растворе. 46 1.3. Математические модели транспорта электронов при фотосинтезе 49
1.3.1. Кинетические модели 50
Модели цитохромного b$f комплекса 52
Модели фотосистемы 1 53
Модели полной цепи электронного транспорта 53
1.3.2. Пространственно-распределенные модели электронного транспорта 55
1.3.3. Модели броуновской динамики 56
Основы метода броуновской динамики 56
Описание взаимодействия пластоцианина и цитохрома/. 60
Модель взаимодействия і(итохрома с и цитохром с-оксидазы с учетом мембраны 64
1.3.3. Применение метода молекулярной динамики при моделировании связывания белков 65
1.4 Заключение к главе 1 67
ГЛАВА 2. Многочастичная модель броуновской динамики фотосинтетических белков 69
2.1. Модельная сцена 69
2.2. Движение подвижных переносчиков 70
2.2.1. Эллипсоиды вращения для моделирования движения молекул пластоцианина, цитохрома/и флаводоксина 73
2.3. Электростатическое взаимодействие белков 75
2.3.1. Электростатические потенциалы для моделирования взаимодействия белков пластоцианина, флаводоксина, цитохрома/и фотосистемы 1 78
2.4. Описание формы белков и их столкновений 82
2.4.1. Аппроксимация поверхности белков пластоцианина, флаводоксина, цитохрома/и комплекса фотосистемы 1 набором сфер для моделирования столкновения молекул 83
2.5. Параметры модели и получаемые кинетические кривые 86
2.6 Заключение к главе 2 88
ГЛАВА 3. Многочастичное компьютерное моделирование взаимодействия пластоцианина и цитохрома/в растворе и люмене тилакоида 89
3.1. Моделирование взаимодействия пластоцианина и цитохрома/в растворе 90
3.1.1. Построение модели 90
3.1.2. Зависимость константы скорости от расстояния связывания... 92
3.1.3. Зависимость константы скорости от вероятности связывания. Влияние мутаций пластоцианина 93
3.1.4. Оценка параметров модели 95
3.1.5. Зависимость константы связывания пластоцианина и цитохрома/от ионной силы 96
3.1.6. Заключение к разделу 3.1 98 *
3.2. Моделирование взаимодействия пластоцианина и цитохрома/в люмене тилакоида 99
3.2.1. Построение модели 99
3.2.2 Зависимость константы связывания пластоцианина и цитохрома/ от ширины люминального пространства 100
3.2.3. Зависимость константы связывания пластоцианина и цитохрома /от плотности расположения цитохрома/на мембране 105
3.2.4. Описание экспериментальных данных по влиянию гиперосмотического шока на реакцию пластоцианина и цитохрома/в люмене тилакоида с помощью многочастичной модели 107
3.2.5. Изучение роли электростатических взаимодействий в связывании пластоцианина и цитохрома/в люмене тилакоида 109
3.2.6. Влияние гетерогенного распределения молекул пластоцианина в люмене на кинетику его связывания с цитохромом/ 111
3.2.7. Заключение к разделу 3.2 112
ГЛАВА 4. Многочастичное компьютерное моделирование взаимодействия фотосистемы 1 с пластоцианином и флаводоксином в растворе 114
4.1. Моделирование взаимодействия флаводоксина и фотосистемы растворе 114
4.1.1. Построение модели 116
4.1.2. Результаты моделирования 117
4.2. Моделирование взаимодействия пластоцианина и фотосистемы растворе 120
4.2.1. Построение модели 121
4.2.2. Оценка параметров модели 122
4.2.3. Зависимость константы связывания пластоцианина и фотосистемы 1 от ионной силы 124 V
4.3. Заключение к главе 4 126
Заключение 127 :
Выводы 130
Список литературы 131
- Пространственная организация хлоропласта и тилакоидной мембраны
- Эллипсоиды вращения для моделирования движения молекул пластоцианина, цитохрома/и флаводоксина
- Зависимость константы связывания пластоцианина и цитохрома/от ионной силы
- Моделирование взаимодействия пластоцианина и фотосистемы растворе
Введение к работе
Актуальность проблемы Изучение механизмов взаимодействия белков и мульти-белковых комплексов, участвующих в реакциях первичных процессов фотосинтеза, и механизмов их регуляции представляет большой интерес для современной биологии. Для исследования этих процессов используют методы направленного мутагенеза, исследуют протекание реакций в присутствии различных ингибиторов и солей, при различной ионной силе, рН раствора, температуре, строят математические модели.
Исследования с помощью направленного мутагенеза дороги и требуют больших затрат времени. Поэтому большой интерес представляют модели, описывающие взаимодействия белков. С одной стороны, расчеты на модели не должны занимать много времени, с другой - достаточно реалистично описывать происходящие процессы.
В реакциях первичных процессов фотосинтеза участвуют мембранные комплексы фотосинтетических реакционных центров - фотосистемы 1 (PSI) и фотосистемы 2 (PSII), цитохромный b6f комплекс и подвижные белки переносчики - пластоцианин и ферредоксин у высших растений и их аналоги у цианобактерий и некоторых водорослей - цитохром Св (cytc6) и флаводоксин. Небольшие гидрофобные молекулы пластохинона осуществляют транспорт электрона в мембране.
В кинетических моделях первичных процессов фотосинтеза (Ризниченко 1991; Stirbet, Govindjee et al. 1998; Лебедева, Беляева и др. 2000; Лебедева, Беляева и др. 2002) перенос электрона внутри мембранных комплексов описывается с помощью вероятностей состояний комплексов, а стадии транспорта электрона подвижными переносчиками — с помощью закона действующих масс. Эти модели не могут учесть геометрию люминального пространства, в котором происходит транспорт электронов пластоцианином от цитохромного b6f комплекса к PSI. Многочастичные модели процессов фотосинтеза (Коваленко, Абатурова и др. 2007), учитывающие особенности диффузионного пространства для подвижных переносчиков и неоднородность распределения комплексов в мембране, хорошо описывают эффекты, связанные с геометрией. Они базируется на экспериментальных кинетических данных и данных о характере распределения комплексов в мембране. Однако эти модели не учитывают электростатические взаимодействия белков и их сложную поверхность. Есть работы по броуновской динамике взаимодействия фотосинтетических белков (Pearson & Gross 1998; Rienzo, Gabdoulline et al. 2001; Gross & Pearson 2003; Haddadian & Gross 2005), учитывающие реальную форму белков и электростатические взаимодействия. Однако в этих работах моделируется взаимодействие только пары белков, не рассматриваются ансамбли взаимодействующих '" макромолекул и не учитывается форма реакционного объема.
В данной работе метод многочастичного прямого моделирования * объединен с методом броуновской динамики и применен к описанию взаимодействия белков в фотосинтетических процессах. Разработанная нами модель учитывает сложную геометрию люминального пространства, электростатические взаимодействия белков и их форму, а также позволяет получать кинетические кривые связывания белков. В модели используются современные данные о структуре фотосинтетических белков. Возможность построения такой модели появилась в последние годы благодаря получению данных о структуре исследуемых белков и развитию вычислительных ресурсов компьютеров. Метод может быть применен для моделирования взаимодействия белков различной природы.
Цели и задачи работы Целью работы является изучение с помощью многочастичного компьютерного моделирования роли электростатических взаимодействий, формы фотосинтетических электрон-транспортных белков и геометрии люминального пространства в формировании кинетики связывания белков.
Были поставлены следующие задачи:
1. Разработать метод многочастичного компьютерного моделирования для описания взаимодействия фотосинтетических электрон-транспортных белков с учетом электростатических сил и сложной формы белков.
2. Построить модели взаимодействия в растворе следующих фотосинтетических белков: пластоцианина и цитохрома/ пластоцианина и комплекса PSI, флаводоксина и комплекса PSI.
3. Оценить параметры прямых многочастичных моделей (вероятности и расстояния связывания) с использованием экспериментальных данных по взаимодействию белков в растворе.
4. Построить модель взаимодействия пластоцианина-цитохрома / в люмене тилакоида.
5. Изучить влияние электростатических взаимодействий и геометрии на кинетические характеристики процессов. Сравнить полученные эффекты с экспериментальными данными.
Научная новизна Впервые построена многочастичная компьютерная модель броуновской динамики фотосинтетических белков, учитывающая электростатические взаимодействия, сложную форму белков и геометрию люминального пространства. Разработан метод аппроксимации поверхности белков набором сфер. Проведена идентификация параметров отдельных стадий процессов по экспериментальным данным.
На модели показана важная роль электростатических взаимодействий в связывании пластоцианина с цитохромом^ пластоцианина с фотосистемой 1, фотосистемы 1 с флаводоксином. На модели впервые показано, что изменение размеров люминального пространства дает возможность регуляции скорости связывания пластоцианина с цитохромом / и фотосистемой 1.
Практическая значимость Результаты исследования существенно углубляют современные знания о роли электростатических взаимодействий и геометрических ограничений реакционного пространства в связывании подвижных белков переносчиков с мультибелковыми фотосинтетическими мембранными комплексами.
Построенная модель позволяет изучать влияние мутаций белков на эффективность процессов фотосинтеза, что имеет большое практическое значение для оптимизации экспериментального поиска мутантов для повышения эффективности выхода фотосинтеза. Данная модель может быть использована для изучения взаимодействия белков различной природы, как в растворе, так и в реакционном объеме сложной формы и с гетерогенным распределением реагентов. Модель будет использована при проведении практикумов по биофизике (темы - «Биологические мембраны» и «Математическое моделирование биологических процессов»).
Апробация работы Материалы диссертации докладывались и обсуждались на: 13-той -
15-той Международных конференциях «Математика. Компьютер. Образование», Дубна, 2006, 2008, Пущино, 2007; Международной конференции «Photosynthesis in the Post-Genomic Era: Structure and Function of Photosystems», Пущино, 2006; Международном семинаре «Trends in Transient Interactions between Biological Macromolecules», Севилья, Испания, 2007; 16- ом Международном симпозиуме «Flavins and Flavoproteins», Хака, Испания, 2008; семинарах кафедры биофизики биологического факультета МГУ. Публикации По материалам диссертации опубликовано 16 работ, из них 2 — в журнале, рекомендованном ВАК для соискателей ученых степеней, 1 - в зарубежном рецензируемом журнале, 4 - в сборниках научных трудов международных конференций и 9 тезисов - в сборниках тезисов докладов международных конференций.
Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, четырех глав, содержащих описание методов и результатов работы, выводов, приложения, списка литературы из 148 наименований. Объем диссертации 143 страницы, 42 рисунка и 7 таблиц.
Благодарности Автор выражает благодарность с.н.с, к.ф.-м.н. Коваленко И.Б. за внимание и постоянную помощь в работе, Громову П.А. и к.ф.-м.н. Устинину Д.М. за участие в создании модели. Автор благодарит доцента, к.т.н. Грачева Е.А., профессора, д.б.н. Кренделеву Т.Е. и чл.-корр. РАН, д.б.н. Рубина А.Б. за ценные консультации.
Пространственная организация хлоропласта и тилакоидной мембраны
Хлоропласты высших растений (рис. 2А, 2В) обладают высокопроницаемой наружной мембраной и менее проницаемой внутренней, в которую встроены специальные транспортные белки. Эти мембраны отделяют внутреннее пространство хлоропласта от цитоплазмы клетки. Между мембранами находится узкое межмембранное пространство. Внутренняя мембрана окружает строму (на свету рН стромы и 8), в которой содержатся различные растворимые ферменты (белкового синтеза, цикла Кальвина, синтеза липидов и др.), ДІЖ (-300 копий (Staehelin & van der Staay 1996)), мРНК, 70S рибосомы. В строме расположены тилакоиды -уплощенные дисковидные мешочки. Внутренние полости тилакоидов сообщаются между собой, образуя люминальное пространство (на свету рН 5, содержится около 80 видов белков (Peltier, Emanuelsson et al. 2002; Schubert, Petersson et al. 2002)). Люминальное пространство отделено от стромы непроницаемой для ионов тилакоидной мембраной (Албертс, Брей и др. 1987).
Большая часть тилакоидов образует гранальные стопки, остальные тилакоиды расположены в строме, при этом частично они могут входить в состав гран (рис. 2Б, 2Г). Типичный хлоропласт содержит от 40 до 60 стопок гран с диаметром 0.3-0.6 мкм. Толщина тилакоида 15 нм (Staehelin & van der Staay 1996).
Рис. 2. А-схема хлоропласта по (Purves, Orians et al. 1995), Б-схема организации тилакоидной мембраны в хлоропласте, В - электронная микрофотография хлоропласта из (Staehelin & van der Staay 1996), Г - электронная микрофотография тилакоидов из (Staehelin & van der Staay 1996). Тилакоидная мембрана имеет сложную пространственную организацию. Трансмембранные белковые комплексы распределены в мембране неоднородно. В гранальной части тилакоидной мембраны находятся комплексы PSII. PSI и АТФ-синтазы в основном встречается в стромальных и краевых, выдающихся в строму участках тилакоидной мембраны. Цитохромный Ьвї комплекс распределен в мембране однородно (рис. 2Б).
Характерной особенностью тилакоидных мембран является их отрицательный поверхностный заряд (Мокроносов & Гавриленко 1992). На наружной поверхности мембран плотность зарядов выше. Поверхностный заряд играет важную роль в процессе формирования гран. Катионы, экранируя отрицательные заряды на поверхности мембран, снижают силы их отталкивания, что ведет к слипанию мембран и образованию стопки тилакоидов - граны (процесс стэкинга). Arvidsson и Sundby предложили модель пространственной организации тилакоидной мембраны хлоропласта (Arvidsson & Sundby 1999). Согласно этой модели, сворачивание одной-длинной тилакоидной везикулы с единым интратилакоидным пространством (люменом) приводит к образованию гранальных стопок (рис. 2Б).
В статье (Albertsson 2001) приводится количественная модель организации мембраны тилакоида. По этой статье мы составили таблицу 1. Плотность распределения Cyt Ьбґ комплексов примерно 1.3-10 шт./мкм . На 1 PSI в среднем приходится 2 молекулы Рс (Норе 1993).
Согласно модели (Albertsson 2001), 20% мембран существует в виде стромальньтх ламелл, 80% существует в виде гранальных стопок. В процессе линейного транспорта осуществляется перенос электронов от фотосистем 2, расположенных в спаренных участках тилакоидов, к фотосистемам 1, расположенным в стромальных участках. Посредниками в этом переносе выступают Cytb6f комплексы, расположенные равномерно в мембране тилакоидов, и подвижные переносчики - PQ в мембране и Рс в люминальном пространстве. В циклическом транспорте электронов не принимают участия PSII, зато участвуют Fd/Fld, переносящие электроны от фотосистем 1 к Cyt b6f комплексам в строме.
Цитохромный Ъв комплекс, наряду с фотосистемами 1 и 2, является мульти-белковым комплексом, локализованным в тилакоидной мембране хлоропласта и вовлеченным в процесс фотосинтетической трансформации энергии. В фотосинтической электрон-транспортной цепи цитохромный b6f; комплекс занимает положение между PSII и PSI, контролируя общую скорость транспорта электронов от первичного донора к терминальному акцептору, и обеспечивая баланс между притоком электронов (от PSII в случае нециклического и от ферредоксина в случае циклического транспорта) и оттоком электронов от PSI. Важнейшей функцией цитохромного b6f комплекса является сопряжение транспорта электронов по электрон-транспортной цепи с формированием электрохимического потенциала протонов (Ацн+) на мембране тилакоида, который используется для синтеза АТФ. С точки зрения энзимологии Cyt Ьбґ комплекс является пластохинол-пластоцианин оксидоредуктазой, т.е. катализирует окисление пластохинола и восстановление пластоцианина (Hope, Huilgol et al. 1992; Hope 1993). На каждый, переданный пластоцианину электрон, он переносит два протона в люмен. Второй электрон уходит в цепь переноса электрона Cyt bef комплекса.
Эллипсоиды вращения для моделирования движения молекул пластоцианина, цитохрома/и флаводоксина
Для расчетов коэффициентов вязкого трения для моделирования движения молекул с помощью уравнений броуновской динамики мы аппроксимировали их эллипсоидами вращения. Объектами нашего моделирования являются пластоцианин, флаводоксин, цитохром/ и мультибелковый комплекс фотосистемы 1 со связанным LHCI. При моделировании реакции в тилакоиде цитохром/и фотосистема 1 считаются неподвижными, так как они связаны с мембраной. При моделировании реакции в растворе пластоцианин, флаводоксин и цитохром/ считаются подвижными. Фотосистема 1 значительно больше пластоцианина, флаводоксина и цитохрома/ ее масса примерно в 40 раз больше, чем у пластоцианина и соответственно ее коэффициент диффузии значительно меньше чем у него. Поэтому при моделировании реакций в растворе мы считали фотосистему 1 неподвижной, эллипсоидом не аппроксимировали и коэффициенты вязкого трения для нее не рассчитывали.
На рис. 14 представлены эллипсоиды вращения для молекул пластоцианина, флаводоксина и цитохрома/ рассчитанные в соответствии с процедурой, описанной в разделе 2.2. В табл. 4 приведены полученные значения полуосей эллипсоидов.
В работах по броуновской динамике (Pearson & Gross 1998; Rienzo, Gabdoulline et al. 2001; Gross & Pearson 2003; Haddadian & Gross 2005) для расчета коэффициентов вязкого трения белок представлялся в виде сферы. Исследуемые нами белки (особенно пластоцианин и цитохром/ больше похожи на эллипсоиды вращения, чем на сферы (рис. 14, табл. 4). Таким образом, гидродинамические свойства молекул в нашей модели описываются точнее.
Электростатические взаимодействия играют ключевую роль в процессах связывания многих белков (Gross 1996; Норе 2000; Рубин 2000). Если белок находится далеко от других белков, то его движение определяется только свободной броуновской диффузией. При приближении к другим белкам и комплексам белок ориентируется в электрическом поле, создаваемом этими белками, и может занять выгодную позицию для последующего связывания.
При значительных расстояниях между поверхностями белков (больше 35 А) электростатические взаимодействия очень слабы из-за экранирования электрического поля молекулами воды и противо-ионами. На расстоянии 35 А в растворе с ионной силой 100 мМ экранирование приводит к уменьшению электростатического потенциала в 80 раз по сравнению с раствором без ионов соли (Финкелыптейн & Птицын 2002). Поэтому в модели электростатическое взаимодействие между белками учитывается только при сближении их поверхностей на расстояние менее 35 А, которое мы назвали расстоянием электростатического взаимодействия.
Для описания электростатических взаимодействий необходимо рассчитать электростатическую силу и ее момент, действующие на белок со стороны других белков, находящихся ближе расстояния электростатического взаимодействия. Для этого перед началом моделирования движения белков вокруг каждого белка в прямоугольной трехмерной области заданного размера рассчитывается значение потенциала электрического поля для заданной ионной силы и рН раствора. Размер области зависит от расстояния взаимодействия и выбирается автоматически таким, чтобы возможно было рассчитать взаимодействие рассматриваемых белков внутри расстояния взаимодействия. Для расчета электростатической силы и момента силы, при выполнении условия, что расстояние между поверхностями двух молекул белков меньше расстояния взаимодействия, нам надо знать значение потенциала первого белка не только на расстоянии взаимодействия, но и в области, занимаемой остальными частями второго белка. Таким образом, размер области для расчета потенциала вокруг первого белка определяется максимальным его радиусом (расстоянием от центра белка до наиболее выступающего атома), максимальным диаметром второго белка (максимальным расстоянием между атомами белка) и расстоянием взаимодействия.
В области для расчета потенциала задается прямоугольная трехмерная сетка (трехмерная матрица) с определенным шагом h (рис. 15). Величина шага является параметром модели и определяет точность расчета потенциала. В программе с уменьшением шага сетки при фиксированном значении расстояния взаимодействия увеличивается количество ячеек и соответственно увеличивается количество памяти, занимаемой потенциалом и время расчета электростатического взаимодействия белков. В наших расчетах мы брали величину шага сетки равную 2 А. Ячейкам сетки присваиваются значения заряда, диэлектрической проницаемости и ионной силы.
Зависимость константы связывания пластоцианина и цитохрома/от ионной силы
Чем лучше совпадение модельных значений констант с экспериментальными, тем ближе должны лежать точки на рис. 29 к биссектрисе угла (масштаб осей одинаков). Лучше всего совпадение наблюдается при ионной силе 100 мМ. Это связано с тем, что мы подбирали значения параметров именно для этой ионной силы.
Качественное совпадение модельных и экспериментальных зависимостей констант связывания Рс и его мутантных форм с cyt/от ионной силы позволяет сделать вывод о том, что предложенный метод многочастичного моделирования образования комплекса белков с учетом электростатических взаимодействий применим для описания взаимодействия Рс и cytf.
Построена модель взаимодействия белков пластоцианина и цитохрома/ учитывающая сложную геометрию среды, затрудненность диффузии из-за столкновений с белками и белковыми комплексами, а также электростатическое взаимодействие между пластоцианином и цитохромом/ Проведена оценка параметров модели по экспериментальным данным. На прямой модели изучено влияние ионной силы раствора на кинетические характеристики взаимодействия пластоцианина и цитохрома/ Модель корректно описывает зависимость бимолекулярной константы связывания белков от ионной силы в растворе, что говорит об адекватности описания электростатического взаимодействия белков.
В данном разделе с помощью метода прямого компьютерного моделирования изучается диффузия белка пластоцианина и процесс его связывания с цитохромом / в люмене тилакоида. Значения параметров модели (расстояния и вероятность связывания) принимались равными значениям параметров для реакции в растворе, которые мы получили в предыдущем разделе (3.1). Мы предполагаем, что эти элементарные параметры, характеризующие процесс образования комплекса двух белков, не зависят от объема и размеров системы.
В модели учитывалось наличие мембран, ограничивающих люминальное пространство, молекулы цитохрома/располагались в люмене в соответствии с экспериментальными данными о структуре цитохромного b6f комплекса, пластоцианин диффундировал в люмене под действием случайной и электростатической сил. С помощью модели исследовалась зависимость константы связывания белков пластоцианина и цитохрома/от геометрии (длины и ширины) люминального пространства и характера расположения молекул цитохрома/ (в люмене и растворе) и молекул пластоцианина (равномерно в люмене или только в стромальной части).
Модель люминального пространства представляла собой реакционный объем, имеющий форму прямоугольного параллелепипеда, сверху и снизу он был ограничен мембранами, с торцов были применены зеркальные граничные условия (рис. 30). Площадь мембран, расстояние между ними, плотность расположения cyt/ на мембранах и концентрация подвижных переносчиков оценивались по литературным данным: диаметр гранальной мембраны варьируется от 300 до 600 нм (Staehelin & van der Staay 1996), плотность цитохромных b6f комплексов на мембране равна 2,55 на 1000 нм (Albertsson 2001). Количество молекул пластоцианина, как и в случае моделирования реакции в растворе (раздел 3.1), мы приняли равным количеству Cyt b6f комплексов (при толщине люмена 100 А это соответствует концентрации пластоцианина 430 мкМ).
Совместив две PDB структуры - комплекс белков пластоцианина из шпината и цитохрома/из турнепса (PDB структура 2PCF (Ubbink, Ejdebeck et al. 1998)) и цитохромный b6f комплекс из Chlamydomonas reinhardtii (PDB структура 1Q90), мы нашли возможное взаимное расположение комплекса пластоцианина и цитохрома/относительно мембраны (рис. 8Б). Полученную ориентацию молекул цитохрома/ (из комплекса 2PCF) относительно мембраны мы реализовали в модели.
С помощью компьютерной модели мы изучали влияние ширины люминального пространства (расстояния между мембранами) на константу связывания Рс и cyt/ Расстояние между мембранами изменяли от 7 до 200 нм. При этом количество молекул (270 молекул Рс и 270 молекул cyt/) и площадь мембран (322x322 нм ) оставались постоянными. Таким образом, менялся объем и концентрация молекул. Мы рассматривали два случая: а) молекулы cyt/ закреплены на мембране в люмене; б) молекулы cyt/ диффундируют в реакционном объеме кубической формы, при этом объем и количество молекул такие же, как и в случае (а) (рис. 31). Случай (а) соответствует экспериментальным данным по расположению цитохрома / относительно мембраны в тилакоиде; случай (б) соответствует эксперименту на выделенных частицах в растворе. Результаты численных экспериментов приведены на рис. 32 и 33.
Моделирование взаимодействия пластоцианина и фотосистемы растворе
Результаты нашей работы позволяют установить связь между значением ширины люмена и скоростью электронного транспорта в люмене тилакоида. В работе (Craz, Salbilla et al. 2001) наблюдали ингибирование реакции Рс и cyt/на клетках Chlamydomonas reinhardtii при гиперосмотическом стрессе. Авторами показано, что добавление соли, сахарозы или глюкозы приводит к удалению воды из люминального пространства, и, как следствие, к его сужению, по их оценкам, в среднем с 5 нм до 1.5 нм. Это приводило к ингибированию реакций взаимодействия Рс с cyt/ и PSI, так как минимальный диаметр пластоцианина 2.8 нм. Наша модель описывает ингибирование реакции Рс и cyt/при сужении люминального пространства с 10 до 7 нм (рис. 33а).
Мы считаем, что оценки ширины люмена в работе (Cruz, Salbilla et al. 2001) (1.5-5 нм) несколько занижены по сравнению со значениями из обзора (Dekker & Boekema 2005) (6-11 нм) и из работы по электронно-микроскопической томографии тилакоидов (Shimoni, Rav-Hon et al. 2005) (10 нм), так как давление, используемое для получения тонких срезов хлоропластов, может приводить к их сжатию (Dekker & Boekema 2005).
В работе (Haehnel, Propper et al. 1980) на изолированных хлоропластах из шпината при гиперосмотическом стрессе наблюдали увеличение скорости взаимодействия Рс с PSI и cytf. Этот эффект был объяснен уменьшением люминального пространства и, как следствие, увеличением концентрации Рс. Несоответствие этих экспериментальных результатов экспериментальным результатам из (Cruz, Salbilla et al. 2001) может быть из-за разных условий экспериментов и из-за того, что люминальные части тилакоидных мембран и связанные с ними белки в Chlamydomonas reinhardtii могут отличаться от таковых у высших растений, и в случае с высшими растениями препятствовать сильному сужению люмена. Увеличение константы скорости реакции с 1.5-108 МГ -с-1 до 2.2-108 М -с-1 при сужении люмена с 100 до 10 нм наблюдалось нами в модельном эксперименте (рис. 33). Скорость же реакции (пропорциональна произведению константы скорости и концентраций реагентов) при повышении концентрации реагентов должна еще больше увеличиваться. Увеличение скорости реакции при сужении люмена видно из сравнения голубой и зеленой кинетических кривых на рис. 326. Однако при дальнейшем сужении люмена происходит ингибирование реакции (синяя кинетическая кривая на рис. 326).
Таким образом, возрастающий участок модельной зависимости константы связывания пластоцианина с цитохромом/от расстояния между мембранами (рис. 33 а) соответствует экспериментам по ингибированию реакции при гиперосмотическом стрессе (Cruz, Salbilla et al. 2001) за счет препятствия мембран формированию комплекса, а убывающий -соответствует экспериментам по увеличению скорости при гиперосмотическом стрессе (Haehnel, Propper et al. 1980) за счет повышения концентрации реагентов, когда еще не происходит затруднения формирования комплекса. Область кривой, которой соответствует эксперимент, зависит от особенностей строения тилакоидов и условий проведения эксперимента.
Взаимодействие пластоцианина и цитохрома/в люмене тилакоида - это пример биохимической реакции, ингибирование которой происходит за счет изменения физических характеристик окружающего пространства, в данном случае - изменения ширины люмена. Мы предполагаем, что физиологический смысл такого ингибирования может заключаться в регуляции электронного транспорта на стадии восстановления или окисления пластоцианина в люмене тилакоида, наряду с уменьшением скорости выделения протонов в люмен при взаимодействии пластохинолов с Cyt Ьбґ комплексом и другими механизмами регуляции, препятствующими фотоповреждениям при высокой интенсивности света и замедляющими скорость линейного электронного транспорта (Murakami & Packer 1970; Рубин 2000). Такой физический механизм регуляции может замедлять скорость переноса электрона при линейном транспорте, так как сужение люмена происходит в гранальных областях тилакоидных мембран. Однако в стромальных областях тилакоида, где происходит циклический транспорт электронов, сужения люмена не наблюдается (Murakami & Packer 1970).
Для выяснения роли электростатических взаимодействий при связывании пластоцианина и цитохрома/в люмене тилакоида мы повысили в модели ионную силу раствора со 100 мМ до 1000 мМ. Результат моделирования представлен на рис. 35. Константа связывания при повышении ионной силы для реакции в люмене, как и в случае реакции в растворе, упала на два порядка.
