Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 8
1.1. Структура Na+,K+-AT4>a3bi 8
1.2 Субстраты, последовательность реакций и цикл Альберса -Поста 10
1.3. Структура и механизм работы Са5*-АТФазы 12
1.3.1 Перемещение цитоплазматических доменов и структурные изменения в трансмембранном домене . 14
1.3.2 Упрощенная схема работы Ссг*-АТФазы 17
1.4. Центры связывания ионов в белке 20
1.4.1. Центры связывания ионов в No*,}С-АТФазе. 20
1.4.2 Перестройка трапемембраниых спиралей при конформационном переходе Et - Е^. 25
1.5. Электрогенность Na+,K+ - АТФазы. Диэлектрические коэффициенты 27
1.6. Модель электрогенного транспорта ионов Na*,^ - АТФазой 29
1.7. Изучение электро генного транспорта, осуществляемого Na+,K+ - АТФазой 31
1.8. Переходные токи в модельной системе БЛМ с адсорбированными фрагментами 34
1.9. Изменения емкости, связанные с работой №*,К*-АТФазы 39
1.10. рН зависимость электрогенного транспорта 43
1.11. Реконструкция Na+,К*-АТФазы 45
ГЛАВА 2. Теоретическое описание транспорта ионов натрия в NA+,K+-AT(DA3E 51
2.1. Физическая модель 51
2.2. Энергетика и электростатика 52
2.3. Кинетические уравнения 58
2.4. Емкость и проводимость 61
2.5. Внеклеточный и внутриклеточный каналы 65
ГЛАВА 3. Материалы и методы 68
3.1. Составы растворов, выделение №+,К+-АТФазы и 19 - кД фрагмента 68
3.2. Экспериментальная система: БЛМ + адсорбированные мембранные фрагменты 70
3.3. Экспериментальная система: золотой электрод - тиол - адсорбированные фрагменты 76
3.4 Метод поверхностного плазмонного резонанса 80
3.5. Реконструкция Na+,K+-ATOa3bi и 19-кД фрагментов в бислойиую липидную мембрану по методу Шиндлера 80
3.6. Метод компенсации внутримембранпого поля с помощью второй гармоники емкостного тока...82
ГЛАВА 4. Результаты исследования и их обсуждение 83
4,1 Электрогенный транспорт в системе БЛМ - МФ. Кинетика изменения емкости проводимости, связанные с работой ^+,К+-АТФазы при фотовысвобождении caged- АТФ 83
4.2. Электрогенный транспорт в системе БЛМ - МФ. Частотные зависимости изменения приращения емкости и проводимости 89
4.2.1. Аппроксимация частотных зависимостей 89
4.2.2. Частотные зависимости изменения емкости и проводимости при различных концентрациях ионов натрия 93
4.3. Сравнение глубины внеклеточного и внутриклеточного каналов доступа 101
4.4. Зависимость электрогенного транспорта ионов натрия №+К+-АТФазой от рН 104
4.4.1. Измерение частотных зависимостей изменения емкости и проводимости при разных значениях рН. 104
4.5 Электростатическое поле в системе БЛМ с адсорбированными мембранными фрагментами с ^+,К+-АТФазой
4.5.1. Электростатические потенциалы, возникающие при адсорбции МФ на БЛМ. 111
4.5.2. Изменение электростатического поля вследствие переноса ионов натрия Na К*У~АТФазой. 123
4.6 Электрогенный транспорт в системе золотой электрод-тиол-адсорбированные фрагменты 128
4.7 Реконструкция Ш+,К*-АТФазы и 19-кД фрагментов в бислойиую липидную мембрану 136
Заключение 141
Выводы 145
Литература
- Перемещение цитоплазматических доменов и структурные изменения в трансмембранном домене
- Кинетические уравнения
- Экспериментальная система: золотой электрод - тиол - адсорбированные фрагменты
- Электрогенный транспорт в системе БЛМ - МФ. Частотные зависимости изменения приращения емкости и проводимости
Введение к работе
Na+,K+-AT
Ыа+,К+-АТФаза была открыта в 1957 году Йенсом Христианом Скоу (Skou, 1957), позднее (в 1997 г.) получившим за это Нобелевскую премию. С тех пор исследованию молекулярных механизмов работы и структуры Ыа+,К+-АТФазы было посвящено большое количество работ. Установлены гены, кодирующие данный белок, определена аминокислотная последовательность, охарактеризованы основные функциональные свойства, найдены специфические ингибиторы, действующие на различные стадии работы фермента, разработаны методы выделения и очистки. Однако до сих пор не удалось получить белок в кристаллической форме и расшифровать структуру Ма+,К+-АТФазы с атомным разрешением. Поэтому пока не установлена трехмерная структура Ыа+,К+-АТФазы, и многие вопросы, касающиеся механизма ее функционирования, остаются на данный момент открытыми.
6 Особый интерес представляет изучение электрогенного переноса ионов натрия, осуществляемого №+,К+-АТФазой в среде, не содержащей ионов калия. В этих условиях можно изучать кинетику процесса, регистрируя нестационарные электрические токи после быстрого введения АТФ, либо скачкообразного изменения напряжения. Нестационарный электрический ток в Na+,K+-ATOa3e после скачкообразного изменения напряжения изучают на изолированных клетках или фрагментах клеточной мембраны ("гигантский пэтч кламп"). Такие объекты обычно содержат не только АТФазу, но и другие мембранные белки, что затрудняет измерения (для получения "чистого" электрического сигнала АТФазы приходится использовать процедуры вычитания сигнала, записанного после ее ингибирования. Исследования электрогенного транспорта в очищенной от посторонних белков Na+,K+-ATOa3e проводятся на модельной системе, в которой мембранные фрагменты (МФ), содержащие Ыа+,К+-АТФазу, адсорбированы на поверхности бислойной липидной мембраны (БЛМ). Такая система позволяет исследовать электрогенный транспорт ионов натрия, вызванный либо быстрым освобождением АТФ из связанной формы, либо приложением переменного напряжения. Разработанные к настоящему времени экспериментальные методы позволяют с помощью электрических измерений определить скорость отдельных стадий электрогенного транспорта и получить важную информацию о пути переноса ионов в белке, в частности, о так называемых "каналах доступа" ионов, через которые происходит обмен ионов натрия и калия между водным раствором и центрами связывания ионов внутри белка. Несмотря на интенсивные исследования электрогенного транспорта, осуществляемого Ыа+,К+-АТФазой, ряд вопросов относительно механизма ее функционирования остается открытым. В настоящее время достаточно хорошо изучен транспорт ионов во внеклеточном канале, в частности, показано, что он состоит из нескольких стадий, хотя до сих пор остается невыясненным происхождение этих стадий и нет их теоретического описания. Очень мало изучен транспорт во внутриклеточном канале, само
существование которого ставилось под сомнение. Предметом настоящей работы является детальное исследование электрогенного транспорта в обоих каналах Ыа+ДС+-АТФазы с помощью метода импедансной спектроскопии на
модельной системе.
Перемещение цитоплазматических доменов и структурные изменения в трансмембранном домене
Связываясь с Са -АТФазой, АТФ «сшивает» цитоплазматические "74 домены Р и N таким образом, что у - фосфат АТФ и Mg оказываются связанными с Р доменом, сгибая его (Toyoshima and Mizutani, 2004). N -домен закрепляется в напряженном наклоненном состоянии и соприкасается с А - доменом. Спираль Ml вытягивается и изгибается так, что верхняя часть трансмембранного домена закрывает доступ к центрам связывания ионов со стороны цитоплазмы. Фосфорилирование Asp 351 приводит к диссоциации АДФ, что запускает «раскрытие» области контакта N и Р доменов. Вращение А - домена приводит к тому, что TGES петля вклинивается в эту «брешь» и взаимодействует с центром фосфорилирования. Это приводит к значительным перестройкам трансмембранных спиралей М1-М6: движение вниз спирали М4, остроугольный изгиб М5 и вращение Мб, что в конечном итоге разрушает центры связывания ионов кальция (Toyoshima and Nomura, 2002). Нижние части спиралей Ml и М2 сдвигают M4L («нижняя» часть трансмембранной спирали М4), открывая тем самым «ворота» во внутреннюю полость ЭПР. В результате открытия ворот ионы кальция уходят из активного центра Са2+-АТФазы во внутреннее пространство ЭПР (люмен). Вместо ионов кальция связываются протоны. Транспорт протонов в обмен на кальций, согласно последним данным, необходим для сохранения нужной конформации «пустых» центров связывания (Obara et al., 2005).
Петля TGES цитоплазматического домена А фиксирует отдельные молекулы воды и катализирует разрушение (дефосфорилирование) аспартил фосфата. Высвобождение фосфата и Mg вызывает выпрямление Р - домена, что по очереди приводит к снятию напряжения с Ml и М2 так, что M4L закрывает внеклеточные ворота. Амфифильная часть трансмембранной спирали МІ (МГ) формирует "трубу", ведущую к аминокислотному остатку Glu 309, запирающему участки связывания Са («воротный» аминокислотный остаток).
Изменяя область контакта между собой, Р и N домены контролируют положение А домена, который управляет воротами. АТФ, фосфат, Mg2+ и Са изменяют поверхность раздела (контакта) между доменами.
Если принять описанную выше гипотезу работы Са -АТФазы, то стоит отметить, что наиболее масштабные структурные перестройки осуществляются без участия АТФ или фосфата. Можно предположить, что при помощи АТФ, Са2+-АТФаза согласует и направляет в нужном направлении исходно стохастические перемещения отдельных доменов, исключая тем самым возможность обратной реакции (Toyoshima et al., 2004).
Как уже упоминалось, по структуре и механизму функционирования Ыа+,К+-АТФаза имеет много общего с рассмотренной выше Са2+-АТФазой, и основное различие касается строения и селективности центров связывания ионов. Согласно современным представлениям, белок содержит полость, сформированную трансмембранными участками, которая может вмещать, в зависимости от конформации, либо два иона калия, либо три иона натрия. Считается, что в этой полости расположены центры связывания, обладающие селективностью к ионам натрия или калия. При специфической обработке Ка+,К+-АТФазы трипсином можно получить так называемый "19-кДа фрагмент". Он представляет собой оставшиеся после воздействия фермента трансмембранные участки белка. Трипсин отщепляет участки фосфорилирования и связывания АТФ; способность к связыванию и окклюзии ионов при этом сохраняется, что указывает на внутримембранное расположение участков связывания (Karlish et al., 1990). В пользу такой модели говорит и тот факт, что окклюзия ионов обоих типов обеспечивается с участием одних и тех же аминокислотных остатков, расположенных в трансмембранной части белка.
Ввиду отсутствия трехмерной модели Ка+,К+-АТФазы высокого разрешения, детальную структуру центров связывания ионов и их положение в белке точно установить пока невозможно. Интенсивные рентгеноструктурные исследования №+,К+-АТФазы и родственных ей белков по-прежнему продолжаются. На данный момент удалось получить структуру Ыа+,К+-АТФазы только с разрешением 11 A (Rice et al., 2001). Детальная структура Са -АТФазы внесла огромный вклад не только в изучение самой Са2+-АТФазы, но и позволила значительно продвинуться в вопросе строения участков связывания и механизмов функционирования Na+,K+-АТФазы. Учитывая тот факт, что Ка+,К+-АТФаза имеет высокую степень гомологии с Са -АТФазой, можно делать предположения о возможном расположении участков связывания в Na+,K+- АТФазе. Степень гомологии для трансмембранной части составляет примерно 40 %, что не достаточно для построения аккуратной модели. С другой стороны, степень гомологии для спиралей М4-М6, формирующих участки связывания ионов в Са -АТФазе, составляет 60 %. Используя информацию о гомологии и строя карты валентности, можно отобрать аминокислотные последовательности -кандидаты для центров связывания ионов. Считается, что места связывания катионов находятся в середине трансмембранной части белка и расположены между консервативными четвертым, пятым и шестым трансмембранным столбами (рис. 1.4.1) (Ogawa and Toyoshima, 2002). Для «гомологичного
04- 1-І моделирования» использовали Са - связанную форму Са -АТФазы и форму, где участки связывания были свободны. Эти формы Са2+-АТФазы соответствуют Na+ и К+ связанным формам Na+,K+-АТФазы. Полученные в этой работе карты валентности позволили выделить два участка I, II, где валентность была 0,9 или выше (рис. 1.4.1). Найденные положения участков I, II совпадали с местами связывания ионов в Са2+-АТФазе. Аминокислотные остатки, формирующие эти участки, идентичны таковым в Са -АТФазе. За пределами этих участков валентность оказалась 0,6. После этого в расчетах по построению карт валентностей стали учитывать распределение молекул воды. При наличии двух молекул воды в двух участках - III и S, валентность оказалась выше 0,9. Участок III соприкасается с участком I, окруженным спиралями М5, Мб и М9 (рис. 1.4.1).
Кинетические уравнения
Особый интерес представляет регистрация малых приращений емкости в широком спектре частот приложенного напряжения, при различных концентрациях ионов натрия и протонов. Это позволит выделить отдельные стадии ионного транспорта, определить их скорости и относительные расстояния, на которые происходят перемещения ионов (диэлектрические коэффициенты). Долгое время считалось, что транспорт двух ионов натрия во внутриклеточном канале является электронейтральным. При этом оставалась непонятной природа этого явления. В последнее время в литературе было выдвинуто предположение, что транспорт этих ионов электронейтрален потому, что сопряжен с протонированием-депротонированием центра связывания (Apell and Diller, 2002). Эта гипотеза основывалась на результатах экспериментов, проведенных с использованием электрохромных флуоресцентных зондов. Фактически, вместо перемещения двух ионов натрия в мембране происходит их электронейтральный обмен на протоны. Однако метод флуоресцентных зондов в данном случае не является доказательным. Он регистрирует статическое связывание ионов в активном центре, но не позволяет изучать кинетику их перемещения в канале доступа. Оно может быть зарегистрировано с помощью прямых электрических измерений, которые позволяют непосредственно проверить гипотезу о NaVH обмене и определить кинетические параметры такого процесса. Именно это планируется выполнить в рамках данной работы.
Определенные недостатки, присущие модели с адсорбированными на БЛМ фрагментами (см. Обзор литературы), диктуют необходимость разработки новых модельных систем. Одной из них может служить золотой электрод, покрытый тиолами, на котором адсорбированы мембранные фрагменты. Преимуществом этой системы является отсутствие электрострикции и высокая стабильность, что позволяет осуществлять быструю смену растворов. Эта модель использована в наших исследованиях для решения ряда задач, касающихся внутриклеточного канала доступа.
Идеальной системой для изучения механизма активного транспорта могла бы быть бислойная мембрана, в которую встроена Na+,K+-AT &a3a. Поэтому представляется интересным использование подхода, основанного на реконструкции белка методом Шиндлера. Попытки встроить Ыа+,К+-АТФазу в плоскую БЛМ проводились неоднократно в течение 20 лет, но без заметных успехов. Для того, чтобы изучать каналы, в которых происходит перенос ионов натрия в №+,К+-АТФазе, нам казалось естественным осуществить реконструкцию ее 19 - кД фрагмента, который, по-видимому, играет существенную роль в функционировании этого белка. До настоящего времени все работы, посвященные 19 кД фрагменту, проводились на липосомах, тогда как мы предполагаем использовать плоскую БЛМ..
На основании сказанного были сформулированы следующие задачи:
1. Опираясь на разработанную теорию и экспериментальные данные, полученные методом импедансной спектроскопии, определить кинетические параметры всех стадий переноса ионов натрия, осуществляемого Ыа+,К+-АТФазой.
2. Изучить влияние рН среды и концентрации ионов натрия на скорость транспорта, с целью выяснить возможную конкуренцию Н и Na+ за места связывания в Na+,K+-ATOa3e.
3. Оценить глубины внеклеточного и внутриклеточного каналов доступа и тем самым определить локализацию места связывания одного из ионов натрия в Na+,K+-ATOa3e.
4. Осуществить реконструкцию 19-кД фрагментов №+,К+-АТФазы в бислойную липидную мембрану и изучить их ионофорные свойства.
Необходимость теоретического рассмотрения нестационарного транспорта ионов натрия, осуществляемого Ыа+,К+-АТФазой, вызвана тем, что ни одна из разработанных ранее теоретических моделей не позволяет адекватно описать результаты измерений методом импедансной спектроскопии. Модель, предложенная (Apell et al., 1987; Lauger, 1991; Wuddel and Apell, 1995), объясняла кинетику тока короткого замыкания, вызванного быстрым введением АТФ. Она рассматривала формальную кинетику биохимических реакций цикла Алберса-Поста. Этот подход оказывается слишком сложным для рассмотрения нестационарных токов, вызванных приложенным к мембране переменным напряжением. Нестационарный транспорт ионов натрия с внеклеточной стороны при приложении переменного напряжения в присутствии АТФ рассматривался в более простой модели. Она позволила объяснить ранние результаты измерений релаксации тока, наблюдающейся при скачкообразном изменении напряжения (Rakowski, 1993), а также изменений адмиттанса мембраны, вызванных функционированием Ыа+,К+-АТФазы (Соколов et al., 1997; Sokolov et al, 1998). Эта модель рассматривала перемещение только одного иона натрия с внеклеточной стороны белка и предполагала, что оно состоит из двух стадий.
Экспериментальная система: золотой электрод - тиол - адсорбированные фрагменты
Электрические измерения проводили с помощью хлорсеребряных электродов с агаровыми мостиками. В качестве солевых мостиков использовали наконечники для микропипеток, концы которых были заполнены агаром. Наконечники заполнялись раствором, в который погружали электроды. Состав этого раствора был аналогичен раствору в ячейке. Сопротивление электродов с мостиками составляло не более 10 - 20 кОм, что соответствовало постоянной времени заряда емкости БЛМ (величиной 1 - 3 нФ) около 50 мкс и позволяло проводить измерения в области частот до 2 кГц.
Для измерения емкости и проводимости БЛМ к одному электроду подключали генератор переменного напряжения треугольной формы (выход ЦАП платы L783 или L780, Lcard, Россия), а ко второму - усилитель Keithley-427 (США), выход которого был связан с платой АЦП (той же платы L783). Значения емкости и проводимости вычислялись с помощью разработанной Соколовым B.C. программы, которая позволяла также регистрировать кинетику изменения этих величин во времени.
При измерении электрических сигналов, связанных с активностью Ка+,К+-АТФазы, использовался метод, описанный в работе (Fendler et al., 1985; Borlinghaus et al., 1987) и усовершенствованный для измерения малых изменений емкости и проводимости мембраны (Соколов и др., 1992; Sokolov et al., 1998; Sokolov et al., 2001). Электрические сигналы записывали после вспышки ультрафиолетового света, вызывающей быстрое освобождение АТФ из связанной формы. Источником ультрафиолетового света служила импульсная ксеноновая лампа с сапфировым окном FJ-249 («EG&G», США).
Освобождение АТФ в отсутствие ионов калия приводило к появлению переходного тока, связанного с переносом ионов натрия Ыа+,К+-АТФазой из раствора в область контакта БЛМ с фрагментами (Fendler et al., 1985; Borlinghaus et al., 1987). Эта область, которую иногда называют «третьей водой», представляет собой заполненную буферным раствором щель между мембранами (БЛМ и мембранным фрагментом) и имеет очень малый объем (рис, 3.1). В эту область обращена внеклеточная сторона Ка+,К+-АТФазы. После быстрого введения АТФ и переноса Ыа+,К+-АТФазой ионов натрия в отсутствие ионов калия устанавливается относительно долгоживущее фосфорилированное состояние P-E22Na+. Оно является метастабильным и в результате медленного спонтанного дефосфорилирования релаксирует в основное состояние Е]. Время жизни фосфорилированного состояния не превышает нескольких десятков секунд. Кроме дефосфорилирования, после вспышки длительное время продолжается гидролиз освободившегося АТФ, что обеспечивает затухающий во времени прямой переход Ej— Ег. Поэтому при проведении серии измерений следующую вспышку давали не ранее, чем через 10 минут, что гарантировало завершение указанных выше процессов и возвращение На+,К+-АТФазы в исходное состояние (Borlinghaus et al., 1987). Амплитуда тока короткого замыкания медленно возрастала при каждой последующей вспышке в течение того времени, пока продолжалась адсорбция фрагментов. Измерения начинали после того, как амплитуды сигнала тока короткого замыкания в серии вспышек переставали изменяться, что говорит о приближении количества адсорбированных на БЛМ мембранных фрагментов к предельному значению.
Электрические сигналы записывали с помощью платы L-783 или L-780 (Lcard, Россия). При регистрации тока короткого замыкания один из электродов заземлялся, а второй был подключен к входу операционного усилителя Keithley-427, с выхода которого сигнал подавался на вход аналого-цифрового преобразователя (АЦП) платы. При регистрации приращений емкости и проводимости на один из электродов с аналогового выхода платы подавалось напряжение синусоидальной формы с амплитудой 50 мВ. Это напряжение поступало также на вход одного из каналов АЦП. Второй электрод ячейки соединялся с входом операционного усилителя Keithley-427 (США), выход которого был связан с входом другого канала АЦП. Для того чтобы зарегистрировать переменный ток, связанный с функционированием АТР-азы и составляющий доли процента от исходного переменного тока (связанного в основном с перезарядкой емкости БЛМ с адсорбированными фрагментами), использовалась аналоговая электронная схема компенсации (Соколов и др., 1992). Принцип действия схемы основан на сложении тока, регистрируемого на БЛМ, с инвертированным током. Для получения инвертированного тока напряжение, подаваемое на мембрану (рис.3.26), инвертировалось и подавалось на RC-цепочку, имитирующую ячейку с БЛМ. На входе усилителя Keithley-427 токи от ячейки и RC-цепочки складывались, и регулируя переменные сопротивления RC-цепочки добивались того, чтобы суммарный переменный ток, регистрируемый усилителем до вспышки УФ света, был близок к нулю (рис. 3.2а). С выхода усилителя сигнал подавался на вход аналого-цифрового преобразователя (АЦП) платы. Полное вычитание исходного переменного тока и вычисление вызванных вспышкой изменений адмиттанса проводилось компьютером с помощью разработанной Соколовым B.C. программы (рис. 3.2в).
Электрогенный транспорт в системе БЛМ - МФ. Частотные зависимости изменения приращения емкости и проводимости
Ранее были проведены измерения частотных зависимостей приращения емкости и проводимости, вызванных функционированием Ыа+,К+-АТФазы при высокой концентрации ионов натрия, и показано, что транспорт состоит из нескольких стадий (Sokolov et al, 2001). В настоящей работе проведены измерения частотных зависимостей для широкого диапазона концентраций ионов натрия (от 1 мМ до 1 М), в более широком диапазоне частот и с большей точностью по сравнению с ранними работами, что позволило разделить различные электрогенные стадии транспорта и определить их количественные характеристики. Аналогично работе (Sokolov et al., 2001), частотная зависимость нормировалась на величину заряда, перенесенного через мембрану Ыа+,К+-АТФазой, который определяли как максимальное значение интеграла тока короткого замыкания. Это позволило уменьшить разброс измерений на нескольких мембранах и усреднить результаты многих экспериментов. Прежде чем перейти к описанию полученных данных, необходимо поподробнее остановится на том, как проводился анализ частотных зависимостей.
Характерные особенности зависимости изменений емкости и проводимости от частоты наиболее четко видны на рис. 4.2.1, который отвечает концентрации натрия 152 мМ. Эти зависимости согласуются с измеренными нами ранее (Sokolov et al., 2001). В настоящей работе, благодаря улучшенному соотношению сигнал-шум и применению электродов, обладающих меньшим сопротивлением, они измерены с большей точностью и в более широком интервале частот. На кривой Ср(ш) проявляются две точки перегиба при частотах (йт;п и ютах, соответственно. При низких частотах проявляется тенденция к насыщению, а между tomin и сотах имеется промежуточное плато. На правой g(w) также заметны точки перегиба на фоне монотонного роста проводимости с частотой. Именно эти кривые были использованы для выбора тех значений кинетических параметров, при которых наблюдается наилучшее совпадение теории (сплошные кривые на рис. 4.2.1) и эксперимента. Эти значения таковы: кц — 20 с1, к2] = 40 с 1, Kf = к21/ к]2 = 2, к2с=3х103 с"!, к 2=4х103 М-1, Nai = 0,19, N -10ш см"2. Теоретические кривые строились по формулам (2.40 ) и (2.4Г), но емкость нормировалась на полный перенесенный заряд, т.е. по оси ординат откладывали Ср =Cp/eV(0l+e2) = Cp[\ + Ke(\ + Ki)]/eN. Используя выбранные выше значения параметров КиК«, можно найти равновесное заполнение ям 1 и 2 (рис. 2.1,2) ионами натрия и их отношение; вЦв = \jK{ = 1/2.
4.2.2-3 показаны теоретические кривые для концентраций ионов натрия 52 мМ и 300 мМ. Они построены по тем же формулам и при тех же значениях кинетических параметров, которые были найдены для случая [Na+] = 152 мМ. Согласие экспериментальных точек с теоретическими кривыми здесь заметно хуже. Это вызвано тем, что модель не учитывала ряд побочных факторов, влияющих на поведение Ка+,К+-АТФазы.
В частности, модель предсказывает зависимость амплитуды изменения емкости и проводимости в зависимости от концентрации ионов натрия, но не может объяснить сдвиг частотной зависимости в область низких частот, наблюдаемый в области высоких концентраций. Это приводит к расхождению теории и экспериментальных данных, которое видно уже при 300 мМ NaCl (рис. 4.2.3). Сдвиг экспериментальной частотной зависимости при высоких концентрациях NaCl в область низких частот можно объяснить солевым эффектом, замедляющим скорость конформационного перехода белка. Он был подробно изучен ранее (Sokolov et al., 2001), где было показано, что при увеличении концентрации ионов хлора происходит замедление кинетики тока короткого замыкания, вызванного освобождением АТФ, и сдвиг частотной зависимости адмиттанса в область низких частот.
Из рис. 4.2.1-3 видно, что амплитуда изменения емкости на низких частотах увеличивается при уменьшении концентрации ионов натрия с 300 мМ до 52 mM NaCl. Это увеличение предсказывают и теоретические кривые, построенные по уравнениям (2.44), где параметры С0 и Сі зависят от концентрации ионов натрия. Однако, теория предсказывает более сильное увеличение емкости по сравнению с наблюдаемым в эксперименте. Возможно, это связано с тем, что модель не учитывает постоянную составляющую напряжения на фрагменте, которая не контролируется в процессе измерения, а устанавливается самопроизвольно. Ее величина может зависеть от условий эксперимента и изменяться в ходе работы Na+,K+-АТФазы из-за заряжения мембраны фрагмента ионами натрия, закачиваемыми в щель между фрагментом БЛМ. При дальнейшем уменьшении концентрации ионов натрия в экспериментальных частотных зависимостях появляется отрицательное приращение емкости, которое связано с транспортом ионов натрия в канале с внутриклеточной стороны белка. Теоретическая модель такого транспорта также была разработана (см. выше Главу 2). В дальнейшем при всех остальных концентрациях NaCl анализ экспериментальных частотных зависимостей проводили с помощью их аппроксимации суммой лоренцианов (3.3), подбирая их характерные частоты и амплитуды методом наименьших квадратов. Это позволило количественно охарактеризовать эти частотные зависимости и влияние на них концентрации ионов натрия в широком диапазоне концентраций.
