Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о структурной организации биологических мембран и липопротеидов. Исследование их пространственной организации с помощью флуоресцентных зондов 9
1.1. Методы исследования структуры мембран и липопротеидов 9
1.2. Липидная фаза мембран 13
1.2.1. Модельные липидные мембраны 14
1.2.2. Биологические мембраны 16
1.3. Упаковка липидов в липопротеидах плазмы крови 25
1.4. Использование синглет-синглетного переноса энергии между флуоресцентными зондами для изучения конструкции белок-липидных ансамблей 29
1.4.1. Теория переноса энергии Фёрстера-Галанина 29
1.4.2. Применение переноса энергии в изучении мембран и липопротеидов 30
1.4.3. Геометрические параметры белок-липидных ансамблей: определение с помощью безызлу-чательного переноса энергии 32
1.4.4. Флуоресцентные зонды - доноры и акцепторы безызлучательного переноса энергии 40
Глава 2. Материалы и методы исследований 43
2.1. Модельные фосфолипидные мембраны (липосомы) 43
2.2. Модельные сферические частицы (липидные шары) 44
2.3. Биологические мембраны 45
2.3.1. "Тени" эритроцитов 45
2.3.2. Оаркоплазматический ретикулум 46
2.3.3. Микросомы печени крыс 46
2.4. Липопротеиды плазмы крови 47
2.5. Измерение концентрации мембран и липопротеидов 48
2.6. Флуоресцентные зонды 48
2.7. Регистрация спектров поглощения и флуоресценции 49
2.8. Измерение эффективности безызлучательного переноса энергии 52
Глава 3. Новые флуоресцентные зонды: оптические свойства и взаимодействие с липосомами 53
3.1. Флуоресцентные зонды - производные пиридина - для исследования структуры мембран и липопротеидов 53
3.1.1. Структурные формулы, растворимость, спектральные характеристики 54
3.1.2. Взаимодействие с липосомами 56
3.1.3. Безызлучательный перенос энергии между зондами 59
3.2. Холеста-5,7,9(И)-триен-3^-ол: оптические свойства и поведение в липидном бислое 74
3.3. Антрацен 81
3.4. п-Терфенил 82
3.5. Обсуждение и выводы 89
Глава 4. Измерение геометрических параметров липидного слоя модельных и биологических мембран с помощью флуоресцентных зондов 92
4.1. Модельные мембраны (липосомы) 92
4.1.1. Измерение площади поверхности и толщины липидного бислоя 93
4.1.2. Влияние холестерина на геометрические параметры липидного бислоя 97
4.1.2.1. "Конденсирующий" и "деконденсирующий" эффекты холестерина 97
4.1.2.2. Влияние состава фосфолипидов на "конденсирующий эффект холестерина 105
4.1.2.3. Влияние В-холестатриена на площадь поверхности липидного бислоя 107
4.2. Геометрические параметры белково-липидных мембран 112
4.2.1. Определение площади поверхности и толщины мембраны эритроцитов 113
4.2.2. Определение площади поверхности и толщины мембраны саркоплазматического ретикулума 118
4.2.3. Ассоциация белков в биологических мембранах 121
4.3. Обсуждение и выводы 125
Глава 5. Упаковка липидов в липопротеидах плазмы крови и в липидных частицах, моделирующих липопротеиды 129
5.1. Принципы формирования и размеры липидных частиц 129
5.2. Геометрические параметры липопротеидов плазмы крови: радиус, объем и площадь поверхности 133
5.3. Локализация и упаковка холестерина в липидных шарах и липопротеидах плазмы крови 139
5.4. обнаружение "твердых" ядер в липидных шарах и липопротеидах низкой и очень низкой плотности 144
5.5. Обсуждение и выводы 148
Заключение 152
Выводы 156
Список литературы 158
- Использование синглет-синглетного переноса энергии между флуоресцентными зондами для изучения конструкции белок-липидных ансамблей
- Измерение концентрации мембран и липопротеидов
- Холеста-5,7,9(И)-триен-3^-ол: оптические свойства и поведение в липидном бислое
- Геометрические параметры белково-липидных мембран
Введение к работе
В жизнедеятельности организма участвует много разнообразных белково-липидных комплексов, которые представлены в основном мембранами и липопротеидами.
Мембраны выполняют функцию не только полупроницаемого барьера между внутренним пространством клетки и внешней средой, но и матрицы, где локализуется значительная часть ферментативных реакций. Сывороточные липопротеиды являются основными переносчиками не растворимых в водной среде крови липидов, в том числе холестерина, и играют важную роль в процессах липидного обмена.
Различные функциональные и патологические состояния мембран и липопротеидов характеризуются определенными структурными параметрами: расположением интегральных белков в мембране; размерами липопро-теидных частиц; топографией их поверхности и т.д. Поэтому, для того, чтобы понять функциональное поведение и молекулярные механизмы патологических изменений этих сложных систем, важно довольно точно знать их пространственную организацию. Кроме того, для проведения большого числа измерений (например, в целях диагностики) требуется, чтобы используемые методы исследования были доступны и просты в обращении .
В последние годы была разработана теория, которая позволяет в достаточно полной мере решить перечисленные проблемы. В основе этой теории лежит метод безызлучательного переноса энергии между флуоресцентными зондами - донорами и акцепторами энергии.
К настоящему моменту некоторые возможности этой теории уже реализованы. В частности, получены оригинальные данные о структуре различных биологических мембран, о мембранах живых лимфоцитов, липо-протеидах плазмы крови. Однако эксперименты только начались, и поэтому полученные результаты носят отрывочный характер. Причинами
этого, тем не менее, были не только недостаток времени, но и другие ррудности. Во-первых, отсутствовали флуоресцентные зонды, оптические і физико-химические свойства которых удовлетворяли бы всем требова-таям, предъявляемым к донорам и акцепторам энергии. Во-вторых, не 5ыло методических приемов, удобных и простых в обращении. Другими зловами, необходимо было создать технологичную систему измерений переноса энергии, которая позволила бы последовательно и целенаправленно получать необходимую информацию о структуре мембран и липопроте-едов плазмы крови.
В связи с этим в начале настоящей работы были изучены и описаны звойства группы новых флуоресцентных зондов, которые были синтезированы в Институте органического синтеза АН ДатвССР специально для решения стоящих перед нами задач.
На основе новых и описанных ранее флуоресцентных зондов были разработаны методические приемы, позволяющие определять толщину и їлощадь поверхности биологических мембран; радиус, объем и площадь юверхности липопротеидов плазмы крови.
Эти приемы были испытаны на системах, моделирующих мембраны и пипиопротеиды, и применены для изучения пространственной организации некоторых биомембран и сывороточных липопротеидов.
Использование синглет-синглетного переноса энергии между флуоресцентными зондами для изучения конструкции белок-липидных ансамблей
Основы теории переноса энергии в случае однородного раствора доноров и акцепторов были разработаны Т.Фёрстером и М.Д.Галаниным /9,90/. Согласно этим работам константа скорости переноса энергии от донора к акцептору равна: где: - время жизни возбужденного состояния донора QA - квантовый выход флуоресценции донора в отсутствие акцептора А/А - число Авогадро П - показатель преломления среды Z - расстояние между донором и акцептором энергии \) - волновое число FA - спектр флуоресценции донора 4/ - спектр поглощения акцептора р К - фактор взаимной ориентации направлений векторов моментов переходов в доноре и акцепторе (для случайно ориентированных диполей К6 = 2/3). Расстояние, на котором происходит перенос энергии возбуждения донора с вероятностью 0,5, называется критическим радиусом переноса, или радиусом Фёрстера, и равно:
Однако эта теория была применима только для.растворов и для случаев, когда все расстояния между донорами и акцепторами энергии в изучаемой системе имеют определенную величину. Тем не менее, её необоснованно применяли и для других случаев. Первыми теоретическими разработками, которые учитывали геометрию мембран, были работы К и кн. /112,205/. Авторы разработали теорию переноса энергии между слоями донора и акцептора, разделенными пленками различной толщины. С помощью такого подхода была оценена толщина "сухих" мембран эритроцитов /140/: она составляет 6,5 нм. Акцептором в этом случае служил напыленный слой золота. Дальнейшее развитие теория переноса энергии получила в работах /87,93/. Был рассмотрен случай плоских мембран и показано, что кривизна поверхности не оказывает влияния на эффективность переноса энергии. Оказалось, что тушение флуоресценции доноров в зависимости от концентрации акцептора можно приближенно описать простым экспоненциальным выражением. Кривые тушения флуоресценции, рассчитанные по этим уравнениям, находились в хорошем соответствии с данными работы /190/.
Авторы этой работы обобщили уравнения Ферстера-Галани-на в объеме для случая переноса в мономолекулярных плёнках. Наряду с этим, в работе /87/ было показано, что тушение флуоресценции не зависит от концентрации доноров, и диффузия зондов не влияет на эффективность переноса энергии. Такие же результаты были получены в работах /95,187/. Основным недостатком этих работ было пренебрежение переносом энергии на акцепторы, расположенные на противоположной стороне мембраны. Как показали дальнейшие разработки /25/, при реальных величинах EQ и толщины мембраны вклад от этого переноса может быть довольно значителен. Что же касается изучения липопротеидов с помощью переноса энергии, то работы в этой области появились только в последние 3-5 лет. В работе /158/ без разработки специальной количественной теории измеряли перенос энергии в ЛПОНП с дифенилгексатриена и/-па-ринариевой кислоты на непроникающий зонд тринитрофенил-глицин. Полученные результаты свидетельствуют о монослойном расположении фосфолипидов на поверхности ЛП и о том, что внутреннее ядро находится в "жидком" состоянии. В 1979-1980 г.г. были опубликованы работы Скляра с соавт. /82,171,172/. Специально были синтезированы флуоресцентные аналоги различных липидных компонентов ЛП. Базируясь на теоретических разработках предыдущих авторов /93,200/, Скляр с соавт. применили эффект переноса энергии для определения локализации флуоресцентных зондов в сферических липопротеидах. Однако перечисленные работы обладают рядом ограничений: 1) перенос рассмотрен только для случая сферических липопротеидов 2) в теории не учтено присутствие апопротеинов в липидной фазе 3) не доказано наличие переноса энергии с донора на акцептор по безызлучательному механизму. Как видно из обзора этих результатов, все авторы шли по одному и тому же пути. Для решения той или иной проблемы рассматривали конкретную ситуацию распределения доноров и акцепторов энергии (мономолекулярные пленки, сферические частицы); в теоретических разработках не было универсальности. Это резко ограничивало применение теории и метода флуоресцентных зондов в изучении большого разнообразия белково-липидных комплексов. В более общем виде теория переноса энергии была рассмотрена в работах /24-26/. Тщательно проанализированы различные ситуации распределения зондов, доказано наличие переноса энергии с белков на зонды и между флуоресцентными зондами, получены экспериментальные результаты. Оказалось, что такой подход обладает необходимой универсальностью и является эффективным для описания конструкции биологических мембран и липопротеидов плазмы крови /14/.
Измерение концентрации мембран и липопротеидов
С развитием метода безызлучательного переноса энергии между флуоресцентными зондами обнаружился дефицит донорно-акцепторных пар, необходимых для решения проблем структурной организации бел-ково-липидных комплексов. Это привело исследователей к целенаправленному синтезу флуоресцентных зондов, которые отвечали бы поставленным требованиям. Так, была синтезирована и охарактеризована группа новых зондов - производных пиридина. Их свойства рассмотрены в главе 3. Для изучения поведения и локализации холестерина в мембранах и липопротеидах сотрудником Института экспериментальной медицины (Ленинград) Иоффе Д.В. был синтезирован холеста-5,7,9(П)-триен--«ite-ол. Его оптические свойства охарактеризованы в разделе 3.2. Впервые для исследования мембран и липопротеидов были широко применены зонды антрацен и п-терфенил (разделы 3.3. и 3.4.). Свойства зондов пирена и ДМХ подробно обсуждены в работе /8/. Зонд АбК и его аналоги уже нашли широкое применение в исследовании мембран и липопротеидов /14,22,48/. Структурные формулы всех используемых зондов представлены на рис.7, и 9. Рабочие растворы зондов готовили в концентрации І мМ в этаноле, ДМХ и ПТФ - в диметилформамиде. Концентрацию растворов контролировали спектрофотометрически. Зонды хранили в темноте, при +4С. Изменение спектров поглощения проводили на спектрофотометре "Specor d t/V-VIS " (ГДР) в I см кварцевых кюветах, спектров флуоресценции - на спектрофлуориметре "Hilachi-MPF-4" в I мм кварцевой кювете, расположенной под углом 45 к оптическим осям монохромато-ров. Для некоторых зондов есть свои особенности при регистрации спектров флуоресценции. Так, например, непрерывное облучение возбуждающим светом зондов ДМХ и 0СП-І4 приводит к снижению интенсивности их флуоресценции. Однако форма спектра флуоресценции ДМХ при этом не изменяется (рис.8). Тем не менее, зависимость квантового выхода флуоресценции от содержания холестерина и воды не позволяет использовать его в качестве донора в опытах по переносу энергии. Интенсивность флуоресценции зонда 0СП-І4 следует измерять в первые 5-Ю секунд после включения возбуждающего света.
В работе приведены только спектры, корректированные в соответствии со спектральной чувствительностью флуориметра. Квантовый выход флуоресценции новых зондов измеряли общепринятыми способами с помощью известных стандартов. Квантовый выход флуоресценции антрацена в этаноле составляет 0,28; 3-метоксибен-зантрона (МБА) в диметилформамиде - 0,62 и родамина 6Б в этаноле 0,97 /8,стр.65/. Время затухания флуоресценции измеряли на спектрофлуориметре "SLM-4800" (США) совместно с Н.К.Куреком (кафедра биофизики 2-М0ЛГМИ) и В.П.Зволинским (Университет Дружбы народов им. П.Лу-мумбы). Флуореметрическое титрование проводили следующим образом. К известному объему (0,5 или I мл) донор-содержащих мембран или ли-попротеидов добавляли зонд-акцептор не более одной молекулы на 300-400 молекул фосфолипида. После очередной добавки зонда-акцептора регистрировали интенсивность флуоресценции донора (F). Зонды добавляли так, чтобы конечная его концентрация в суспензии мембран увеличивалась не быстрее чем на 6 мкМ/мин. Данные титрования обычно представляли в полулогарифмических координатах, где по горизонтальной оси откладывали концентрацию акцептора (мкМ), а по вертикальной величину к (F0/F) 0 интенсивность флуоресценции донора в отсутствие акцептора. Поскольку тушение стационарной флуоресценции доноров в зависимости от концентрации акцепторов приближенно описывается экспоненциальным законом, то в таких координатах кривые тушения близки к прямым линиям.
Использование имеющегося набора флуоресцентных зондов для измерения безызлучательного переноса энергии в мембранах и ЛП выявило недостаток соединений, удовлетворяющих всем требованиям, предъявляемым к донорам иакцепторам энергии. Сложилась ситуация, требующая целенаправленного синтеза и поиска новых мембранных флуоресцентных зондов. Настоящая глава посвящена изучению оптических свойств и взаимодействия с мебранами как вновь синтезированных соединений (производные пиридина, В-холестатриен), так и известных зондов, которые до сих пор не нашли широкого применения в изучении структуры мембран и липопротеидов (антрацен и п-терфенил). Впервые этот класс соединений испытывался в качестве потен-циалчувствительных зондов в работе /70/. Затем было обнаружено, что 2-(п-диметиламиностирил)-1-метилпиридиний йодистый (ДАСПМИ) может служить зондом для исследования энергизованного состояния митохондрий в живых клетках, причем клетки после окрашиваний не утрачивали жизнеспособности, а интенсивность флуоресценции ДАСПМИ при энергизации митохондрий возростала в 8-12 раз /55/. Такого эффекта ранее не наблюдали ни с одним известным флуоресцентным зондом, тем не менее он остался незамеченным и не получил своего логического развития.
Холеста-5,7,9(И)-триен-3^-ол: оптические свойства и поведение в липидном бислое
Для изучения молекулярной организации мембран и липопротеидов в последние годы всё шире применяются флуоресцирующие производные фосфолипидов и холестерина (см./8/). В частности, был синтезирован флуоресцентный аналог холестерина - холеста-5,7,9(Н)-триен-3 ол (сокращенно В-ХГЕ) путем введения двух двойных связей в В-кольцо молекулы холестерина /175/. Структура молекулы В-ХГЕ представлена на рис.7. Несмотря на то, что это соединение использовалось в ряде работ /56,57,174,198/, в нашей стране оно синтезировано впервые. В связи с этим необходимо было изучить его оптические свойства и взаимодействие с мембранами. Кроме того, оставалось неясным можно ли В-ХГЕ использовать в качестве донора безызлучательного переноса энергии. Оптические свойства. Спектры поглощения, возбуждения флуоресценции и флуоресценции В-ХГЕ в этаноле и в липосомах приведены на рис.22. Спектр поглощения имеет колебательную структуру с максимумом при 326 нм. Спектр возбуждения близок к спектру поглощения, а спектр флуоресценции зеркально симметричен им. Квантовый выход флуоресценции В-ХГЕ в этаноле составляет 0,05 0,01. При встраивании зонда в мембрану спектры практически не изменяются, но квантовый выход возрастает в 1,6 раза. Взаимодействие с липосомами. По мере увеличения количества В-ХГЕ в липосомах, приготовленных из смеси В-ХГЕ с ФХ, светопогло-щение суспензии возрастает линейно с ростом количества В-ХГЕ (рис. 23).
Вероятно, в мембранах не происходит образования кластеров В-ХГЕ, в которых В-кольца соседних молекул тесно контактировали бы между собой. Вместе с тем, интенсивность флуоресценции липосом, в которые встроен В-ХГЕ, нарастает нелинейно с ростом молярной доли Спектры поглощения (I), возбуждения флуоресценции (2,пунктир) и флуоресценции (3) В-ХТЕ в этаноле (а) и в липосомах (б). Спектр возбуждения флуоресценции измерен при длине волны флуоресценции 370 нм, спектр флуоресценции -при возбуждении 325 нм. Щели возбуждения и флуоресценции 5 и 3 нм, соответственно. Концентрация липосом - 0,5 г/л, В-ХТЕ - 50 мкМ (а) и 9 мкМ (б) В-ХТЕ (рис.23). Возможной причиной нелинейного роста флуоресценции В-ХТЕ в мембране может быть "выпадение" части молекул В-ХГЕ в отдельные, не связанные с мембраной мицеллы. В настоящее время имеется способ проверки того, все ли флуоресцирующие молекулы связаны с мембраной /14/. С этой целью в суспензию липосом добавляют зонд-акцептор 0СП-І4, на который может происходить перенос энергии с В-ХТЕ. Согласно спектрам на рис. 24, критическое расстояние переноса в этой паре равно R = 2,88 нм. Данные, представленные на рис.25, показывают, что в липосомах перенос энергии между этими зондами действительно происходит. Откладывая степень тушения флуоресценции донора против концентрации акцептора в двойных обратных координатах, получаем кривую, имеющую прямолинейный участок (рис. 26). Продолжение его до пересечения с вертикальной осью отсекает отрезок [F0/(FQ- F)]mirL , который связан с долей флуоресценции В-ХТЕ, которая может быть потушена зондом ОСП-14 /14/: Согласно рис.26, й= I, то-есть вся флуоресценция В-ХТЕ локализуется там же, где локализуется зонд-акцептор 0СП-І4. Если 0СП-І4 локализуется в бислое, а не в предполагаемых кристаллах В-ХТЕ, то и флуоресцирующие молекулы В-ХТЕ тоже располагаются в бислое. Таким образом, В-холестатриен имеет оптические свойства, удобные для его использования в качестве мембранного флуоресцентного зонда: он может служить донором безызлучательного переноса энергии (акцептор - 0СП-І4). Некоторые особенности флуоресценции В-ХТЕ остаются пока неясными: в частности, отсутствие гомопереноса энергии между молекулами зонда /146/ и неполное совпадение спектров возбуждения его флуоресценции и спектров переноса энергии с него на 0СП-І4 (кривые 5 и 6 на рис.25).
Геометрические параметры белково-липидных мембран
Поверхность биологических мембран, контактирующая с водным окружением, формируется фосфолипидами, холестерином и гидрофильными участками интегральных белков, то-есть полная площадь поверхности мембраны равна S= $л+ 5 . Если белок - глобулярный, то его форму можно охарактеризовать радиусом глобулы (). Оказалось /14,15,51/, что при условии Rg -3R перенос энергии по-прежнему подчиняется уравнению (5) и измеряемая площадь точно равна 5л+5 . По мере роста Kg измеряемая площадь асимптотически приближается к 5 . Поэтому, можно предположить, что измерение площади поверхности биологических мембран с помощью переноса энергии и сравнение полученных результатов с площадью эквивалентного количества мембранных липидов (5Л) позволит: во-первых, выявить наличие в мембране крупных белковых агрегатов (73RQ) и, во-вторых, точно определить величину площади поверхности, занимаемую встроенными в мембрану интегральными белками, если Rg 3RQ. Согласно жидко-мозаичной модели Сингера /169/, биомембрана представляет собой "море" липидов, в котором "плавают" белковые глобулы. В последнее время накоплен целый ряд фактов, которые свидетельствуют о существовании в мембране крупных белковых ассоциа-тов диаметром 10-15 нм /28,33,49/. Эти данные получены с помощью электронной микроскопии в сочетании с фрагментированием мембран. Однако при такой обработке мембран возможно появление артефактов, которые могут быть обусловлены образованием гибридных фрагментов; не исключена возможность повторной агрегации мембранных ферментов после разрушения /168/.
Поэтому, с этой точки зрения, более "щадящим" является метод безызлучательного переноса энергии, который, наряду с выявлением крупных ассоциатов белков одновременно позволяет определить площадь поверхности мембраны, её толщину и долю поверхности, занимаемую белками и липидами. Площадь поверхности исследуемых биомембран можно приближенно оценить, сравнивая эффективности переноса энергии между различными зондами в этих мембранах и в липосомах с известным содержанием фос-фолипида. Тогда площадь поверхности мембран SM можно определить из соотношения $шс/$и = )Ї/ ЛПС где 5лпс плоЩадь поверхности известного количества липосом, а к) Ц) - тангенс угла наклона кривой эффективности тушения флуоресценции доноров от концентрации акцепторов (A(FQ/F) «- Сакц). Соответствующие данные по переносу энергии в мембранах эритроцитов человека представлены на рис.43. Видно, что перенос энергии в липосомах из фосфатидилхолина (0,25 г/л) происходит в среднем в 2,7 0,2 раза лучше, чем в мембранах эритроцитов (концентрация фосфолипида - 0,35 г/л). Это означает, что при равном количестве фосфолипидов площадь поверхности мембран эритроцитов примерно в 1,9 = 2,740,25/0,35) раза больше площади липосом, что составляет 1,9 5 10 см = 9,5 10 см на I г фосфолипида.(I г фосфолипидов по нашим данным /раздел 4.I.I./ занимает площадь равную 5"10 см ). Для того, чтобы точно измерить величины $ и Д мембраны эритроцитов, мы применили методический прием, разработанный и описанный в разделе 4.I.I. Результаты переноса энергии между зондами 0СП-І4 - ДСП-І2 и Антрацен(АбК) - 0OI-I4 в "тенях" эритроцитов представлены на рис.43.
Согласно уравнениям (5) и (б) и калибровочной кривой на рис.5 величины площади поверхности и толщины мембраны эритроцитов составляют соответственно $ = (9,2 Т 0,3) 10 см на I г фосфолипида и Д = 4,8 Т 0,2 нм. Таким образом, толщина липидного слоя мембраны эритроцитов соответствует толщине липидного бислоя липосом из яичного фосфати-дилхолина (см.раздел 4.I.I.). Эти данные свидетельствуют о бислой-ной организации липидов в мембране эритроцитов человека. Некоторое утолщение мембраны эритроцитов по сравнению с бислоем из ФХ (4,5 нм) обусловлено, по-видимому, встраиванием холестерина /131/. Наконец, остановимся на обсуждении данных по измерению площади поверхности. Площадь поверхности мембраны эритроцитов формируется фосфоли-пидами, холестерином и белками: где f - коэффициент, учитывающий изменение (50)хол при его встраивании в фосфолипидную По нашим данным (см.раздел 4.1.2.1) величина коэффициента зависит от фосфолипидного состава мембраны и составляет: Положим, что молярное отношение холестерин/фосфолипид в мембране эритроцитов равно 0,9 /79/. Если холестерин оказывает на би-слой эритроцитарных фосфолипидов "конденсирующее" действие, то это означает, что площадь эквивалентного количества липидов составила бы величину
