Введение к работе
Актуальность проблемы. В работе представлены результаты исследования влияния перекисного окисления липидов ^изменения содержания холесте рина на.структуру и функционирование модельные, биологических мембран и липопротеидов. Интерес к этой проблеме обусловлен несколькими причинами:
-
Существует широкий круг патологий, возникновение и развитие которых взаимосвязано с изменением структуры, физического состояния липид-ного компонента мембран, нарушением регуляции мембраносвязашшх процессов: проницаемости для ионов и неэлектролитов, функционирования мембранных ферментов и рецепторов ( Лопухин и др. 1983).
-
Регуляция мембраносвязашшх процессов кроме химических механизмов известных для немембранных, водорастворимых систем, в значительной степени определяется уровнем физического состояния, микровязкостью ли-пвдной.фазы мембран или ее обратной величиной, текучестью (Kimelberger е.а.1972).
In vivo изменение кидкостного гомеостазе клеточных мембран и липопротеидов осуществляется за счет вклада нескольких факторов, среди которых наиболее важная роль принадлежит процессу перекисного окисления липидов (ПОЛ) и накоплению холестерина (Лопухин и др.1983).
Переписное окисление липидов является фундаментальным механизмом нарушения структуры и функции клеточных мембран (Владимиров 1972). Пе-роксидацил липидов мембран и липопротеидов, с одной стороны, обладает свойствам:* диффузионно-контролируемого процесса (Иванов, 1988), а с другой - одним из последствий свободнорадикального окисления может быть увеличение полярности и микровязкости лшщдной фазы (Dobretsov.1977).
При этом следует иметь в виду, что эффективность де" -твия ПОЛ на свойства мембран зависит от места локализации центров инициации процесса пероксидации. Все это позволяет,. выбирая различные способы инициации проследить как ПОЛ влияет на структуру, физическое состояние различных участков мембраны и как это взаимосвязано с изменениями барьерной и матричной функций мембран.
Другим способом модификации структурированности липидной фазы мембран и липопротеидов является изменение химического состава, в частности содеркагжя холестерина (Papahadjopoulos е.а.,1974).
Характерной особенностью патологических процессов, сопровождающихся гиперхолэстеринемией, является активация процесса перекисного окисления липидов (Ланкин и др.1980). В этой связи важно было выяснить является ли
модификация мембран, вызванная действием ПОЛ и накоплением холестерина, независимыми событиями или они могут оказывать друг на друга какое-то влияние.
Увеличение скорости реакции пероксидации лшидов, отмечаемое при холестеринозах, обусловлено вкладом несколыапс механизмов,среди которых значительная роль принадлежит активации фагоцитов , в частности, полиморфноядерных лейкоцитов крови, продуцирующих активные формы кислорода и другие прооксиданты, способные инициировать перекисное окисление липи-дов ( Weiss, 1986). Это позволяет предшшмсмь, что между перекислим окислением липидов и активацией ПМЛ, двумя свободнорадикальными процессами, существует определенная взаимосвязь, состоящая по-видимому в том, что:
а. стимуляция ПМЛ может вызывать при определенных условиях ПОЛ и
б. появляющиеся продукты ПОЛ могут увеличивать функциональный по
тенциал ПМЛ.
Все вышеизложенное и определило главнуїз цель и основные задачи работы.
Цель работы: изучить влияние перекисного окисления липидов и изменения содеркания холестерина на структуру, физическое состояние и функционирование мембран и липопротевдов.
Основные задачи:
I.Изучить влияние перекисного окисления липидов на структуру, физическое состояние липидного бислоя и функционирование модельных мембран, мембран саркоплазматического ретикулума, а также полиморфноядерных лейкоцитов крови.
2. С помощью флуоресцентного и спинового зондирования изучить влияние увеличения содержания xoj. стерина на структуру и физическое состояние лшшднои фазы модельних и биологических мембран.
т. Определить характер влияния постепенного увеличения содержания холестерина на особенности мембраносвязаншх, диффузионно-контролируе-мых процессов: активность мембранных ферментов, электрическую стабильность мембран липосом, перекисное окислении липидов. Изучить взаимосвязь между содержанием холестерина, микровязкостью мембран и функциональной активностью полиморфноядерных лейкоцитов крови в условиях атеросклероза и его осложнений.
4. Определить возможность и условия удаления стероида из липопроте идов, мебран липосом и эритроцитов с помощью холестерин-специфических
сорбентов.
-
Изучить динамику накопления холестерина и уровня процесса пере-, кислого окисления лшшдов в лшіопротеидах и клеточных мембранах при экспериментальной гиперхолестеринемии и у больных с патологиями, сопровок-давщимися увеличением содержания холестерина.
-
Полученные результаты и данные литературы обсудить с точки эре-, ния концепция о взаимосвязи процесса перекислого окисления липидов и накоплешія холестеріша в липопротеидах и клеточных мембранах.
На защиту выносятся следующие основные положения:
1. Перекисное окисление липидов мембран саркоплазматического рети-
кулума (МСР), инициированное ультрафиолетовым облучением (УФ-ПОЛ) и ио-'
нами дзухвалентиого келеза(]?е-П0Л) вызывав? структурно-функциональные
изменения в МСР, выразакциеся в:
а. увеличении пассивной проницаемости ионов Са2+ и уменьшении ак
тивности Са аккумулирующей способности везикул СР,
б. увеличении микровязкости ЛИПНДІЮЙ фазы МСР и уменьшении враща
тельной подвижности Са-АТФазы.
Эффективность повревдающего действия УФ-ПОЛ на функциональные параметры МСР и степень уменьшения подвижности белка оказалась в 10-20 раз большей по сравнению с Ре-ПОЛ, в то время как увеличение микровязкости липидной фазы было пропорциональным накоплению ТБК-активных продуктов независим) от способа шшциирования пероксидации лшшдов.
Ші основании полученных результатов высказывается предположение о том, что при УФ-ПОЛ происходит перекисное окисление пограничных или ану-лярных липидов, модификация которых определяет энер :ю активации Са -АТФазы и условия функционирования МСР.
Продукты перекисного окисления липидов, предпочтительно г^дропере-киси, способны вызывать Са2+-зависимую предстимуляцию полиморфноядерных лейкоцитов крови.
2, По мере постепенного увеличения относительного содержали в
мембранах холестерин способен формировать 2 пула молекул, различащихся ;
по своему влиянию па структуру и физическое состояние лишщной фазы
мембран» доступности для холестерин-специфических сорбентов, вл. опію на
ряд мемо'раносвязанных диффузионно-контролируемых функций. На первом эта
пе накопления холестерина до достижения определенного критического зна-
_4 -
чения индекса іхс/фл молекулы стероида формируют первый активный пул, в составе которого увеличение содержания холестерина сопровождается практически пропорциональным возрастанием микровязкости липидной фазы, инги-бированием активности мемОрашшх ферментов, увеличением потенциала электрического пробоя мембран липосом, в сосааве этого пула стероид оказывается недоступным для холестерин-специфического сорбента. Дальнейшее увеличение содеркашя холестерина приводит наряду с активной формой к образованию второго, не активного пула, в составе которого холестерин не оказывает сколько-нибудь значительного влишшя на структуру и функциональные свойства мембран, но эффективно удаляется из мембран при действии сорбентов.
3. Увеличение содержания холестерина в мембранах липосом приводило
к ингибированию реакций перекисного окисления липидов при іхс/фл <о,5 и
практически не изменяло состояния процесса ПОЛ при дальнейшем увеличе
нии содержания стероида ( іхс/фл > 0,5).
Совпадение характера влияния холестерина на микровязкость бислоя к перекисное окисление мембранных липидов поззоляет предположить, что холестерин тормозит развитие свободнорадикаль.чого окисления липидов мембран липосом за счет увеличения структурированности липидной фазы, т.е. его действия как "структурного антиоксидант a", in vivo в процессе развития алиментарной гиперхолестеринемии кроликов уже на ранних стадиях развития атеросклероза увеличение окисляємось: лшопротеидов совпадает і возрастанием содержания холестерина и штиокислительного потенциал! плазмы крови. Инкубация клеток Acholeplasma Laidlawii в среде с окисленными липидами сопровождалась значительным накоплением холестерина в клеточных мембранах на ранней логарифмической стадии роста клето: Acholeplasma Laidlawii. Все ій позволяет считать, что накопление хо лестерина, равно как увеличение синтеза и активности различных други инги"иторов пероксидации липидов, является адаптационной реакцией орга низма на перекисный стресс, направленной на торможение процесса ПОЛ.
4. Одним из механизмов инициации ПОЛ .In vivo в условиях холестери
ноза является активация полиморфноядерных лейкоцитов крови. В мембранах
ПЫЛ крови больных ИБО и ИМ несмотря на короткое время жизни в циркуляци
происходит увеличение содержания холестерина и соответственно этому уве
личение микровязкости липидной фазы мембран.Однако, в противоположной
другим видам мембраносвязанных , диффузионно-'-коитролирувмых процессе
Функциональная активность гранулоцитсв в этих условиях увеличилась, чі
ь -
может быть.следствием экспрессии рецепторного аппарата ПШІ. Полученные результаты позволили сформулировать основные положения механизма актива- -цш гранулоцитов в процессе возникновения и развития воспалительных заболеваний
НАУЧНАЯ НОВЮНА РАБОТЫ. Установлено, что как УФ-ПОЛ так и Ре-ПОЛ вызывает структурно-функциональные изменения в мембранах саркоплаэмати-ческого ретикулума.
Впервые показано, что при УФ-ПОЛ эффективность инактивации Са -ак-кумулирувдей способности везикул СР и увеличение пассивного транспорта Са а также степени уменьшения подвижности белка оказалась в 10-20 раз большей по сравнению с Fe-ІЮЛ, в то время как увеличений микровязкости липидной фазы было пропорциональным накоплению ТБК-активных продуктов' независимо от способа инициирования перекисного окисления мембранных ли-' пидов. Полученные результаты позволяют высказать предположение о том, что при УФ-ПОЛ происходит перекисное окисление пограничных или анулярных липидов:. модификация которых определяет' энергию активации Са2+-АТФазы и условия функционирования мембран саркошюзматического ретикулума.
Вшзрвые показано, что продукты перекисного окисления липидов, предпочтительно гидроперекиси, способны вызывать быструю предстимуляцию по-лиморфноядерных лейкоцитов крови, характеризующуюся экспрессией рецеп-\ торного аппарата клеток, в частности, увеличением количества Рс-рецепто-ров. Эффект предстимуляции гранулоцитов не зависел от действия ингибиторов синтеза белка в клетках.
Установлено, что по мере постепенного увеличения содержания холестерина із мембранах и липопротеидах стероид способен формировать 2 пула молекул', различающихся по своему влиянию на структуру и ф. оческов состояние липидной фазы. На первом этапе накопления холестерина в мембранах до достижения определенного критического значения индекса іхс/Дп молекулы стероида формируют первый активный пул, в составе которого увеличение содержания холестерина сопровождается возрастанием микровязкости липидной фазы мембран липосом. Дальнейшее увеличение содержания холе^тери-; на приводит наряду с активной формой к образованию второго не активного; пула холестерина, в составе которого стероид не оказывает сколько-ни-! будь суцественного влияния на структуру и физическое состяние ЛИПИДНОЙ) фазы мембран.
Впервые показано, что в составе активного пула А холестерин ингиби-!
рует функционирование мембранных ферментоп, увеличивает потенциал электрического пробоя мембран липосом и торюзит перекисное окисление лїшидов, оказывается недоступным для холестерин-специфических сорбентов. В составе не активного пула Б холестерин ве оказывает сколько-нибудь существенного влияния на изучаемые даффузионно-контролііруеше мембранные процессы, но эффективно удаляется из мембран при действии сорбентов.
Совпадение характера влияния холестерина на микровязкость бислоя п переісисное окисление липвдов позволяет считать, что холєстерші тормозит развитие свободнораддкального окисления липидов мембран лішосом за счет увеличения структурированности липидной фазь в качестве "структурного антиоксиданта", а накопление холестерина в ситуациях in vivo , равно как и увеличение синтеза и активности различных других ингибиторов перокис-ного окисления липидов, является адаптационной реакцией организма на пе-рекисный стресс, направленной на торможение процесса ПОЛ.
Впервые проведено систематическое исследование уровня функциональной активности полиморфноядерных лейкоцитов крови в _ условиях пшерхо-лестеринемии. Установлено, что в мембранах полиморфноядерных лейкоцитоз іфови больных ИБО и ИМ происходит увеличение активности эндогенной СОД, содержашш холестерина и соответственно этому, увеличение микровизкости липидной фазы мембран. Однако, в противопологиость другім видам мембра-носвязашшх доффузиошю-контролируемых процессов функциональная активность гранулоцитов крови в этих условиях увеличилась, что монет быть следствием экспрессии рецепторного аппарата ПМЛ. Получошшо результат позволили сформулировать основные положения двухстаднШюго механизма активации гранулоцитов в процессе возникновения и развития воспалительных заболеваний.
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Получешше результаты и сделашке В работе выводы расширяют наши представления о роли модификации структуры и физического состояния липидной фазы мембран и лшюпротеидов в регуляции их основных функций.
Обнаруженные эффекты действия продуктов перекислого окисления липидов на предстимуляцию полиморфноядерных лейкоцитов крови раскрывает особенности взаимосваязи двух свободнорадикальных механизмов патогенеза ряда заболеваний: перекисного окисления липидов и активации ПМЛ. Предсти-муляция ПМЛ продуктами ПОЛ являєтя звеном определенного порочного круга
-7 .
влений:продукты ПОЛ активируют ІМЛ, а последние инициируют пероксцдацию йпвдов. На асновашш этих и ряда других, экспериментальных данных сфор-улирован двухстадийвый механизм активации ПЫЛ в процессе возникновения : развития воспалительных заболевания.
Способность холестерина в зависимости от его содержания и физи-!
ю-химдческих свойств лшидной фазы мембран и липопротеидов распреде- I
іяться на 2 пула, различающихся по своему влиянию на структуру и микро- і
шзкость ляпидной фаги и регуляцию меыбраносвязанных, диффузионно-конт-
юлпруекых процессов, позволяет считать что накопление холестерина в
шпопротеидах п мембранах в процессе возникновения и развития атероск-
троза и других заболеваний, характеризующихся гиперхолестеринемией,
эавно как увеличение синтеза и активноссти других ингибиторов пероксида-
щи ляпидов, является адаптационной реакцией организма на перекисши!
пресс, направленной на тормонение процесса ГОЛ. !
Использованные в работе оригинальные флуоресцентные зонды ДЖ и МБА і іеили иирокоэ применение в исследованиях структурно-функциональных і зеойств липопротеидов, мембран и клеток.
Подхода и методы, разработанные для изучения пэрекисного окисления шшдов, активности гранулоцитов, защищенные соответсвуюпщми авторскими: звэдетельствами, нашли свое применение в лабораторной и клинической і практике для определения оішсляемости липопротеидов, антиокислительной эктпвности плазмы крови, функциональной активности ПУЛ с целью диффе-1 рэициальной диагностшш, контроля за эффективностью терапии, определе-' ния прогноза офтальмологических и сердечно-сосудистых заболеваний, а так аз определения Эффективности и достаточности лазерного облучения крови | больных ИБО и ИМ, предварительного отбора и определения активности и і механизма действия препаратов-ингибиторов перекисного окисления липидов и активности ПЫЛ.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы докладывались и обсукд: лись на меадународных и всесоюзных симпозиумах и конференциях:
"Структурная лабильность мембран и ее роль в регуляции функциональной активности клеток" (Минск, 1974), "Перспективы Оиоорганическсй химии в создании новых лекарственных препаратов" (Рига,1982), "Цитохром Р-450 и защита внутренней среды человека"(Москва,1985), "Иммунология атероскле-j роза и Ш^'СГомск, 1985), "Биохемилюминесценция в медицине и сельскомI хозяйстве"(Ташкент,1985), "Активные формы кислорода в биологических сис-темах",(Варна,НРБ,1986), "Международная конференция по профилактической'
кардиологии"(Москва,1987), "Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине" (Рига, 1988), "Перекисное окисление лшшдов и антиоксидантная терапия при ИБО"(Горький,1988), "III Всесоюзная конференция Еиоантиокси-дант (Москва,1989), "ш Всесоюзное совещание по хемилюминесценции"(Рига, 1990), Международный симпозиум "Мононуклварные фагощсты в норма і при патологии"(Новосибирск,1991), а также ка 4 Международном биофизическом конгрессе(Москва,1972), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва,1983), 4 Всесоюзном съезде патофизиологов (Кишинев,1988)
ПУБЛИКАЦИИ. Результаты исследования опубликованы в 71 работах і центральной отечественной и зарубежной научной печати, а также в материалах съездов и симпозиумов. Получено 7 авторских свидетельств на изобретения и 4 свидетельства на рационализаторсіше предложения отраслевогс значенния.
СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из 3 частей, 4 глав с ж жением результатов исследования, заключения, выводов по работе, библиографии. В приложении изложены материалы и методы исследования.
