Введение к работе
Актуальность работы.
Одной из важнейших особенностей живой природы на Земле является «хиральная чистота» аминокислот, углеводов, нуклеотидов и многих биологически активных веществ, составляющих все организмы На атомно-молекулярном уровне организации природной клетки данное свойство проявляется в том, что ее нуклеиновые кислоты включают исключительно D-изомеры (дезокгафибозы, а синтезируемые в рибосомах белки - L-изомеры аминокислот Отметим также, что все углеводы включают D-изомеры, а все фосфолипиды являются L-изомерами Относительно исключений из этого правила речь пойдет ниже
Хиральная асимметрия биосферы непосредственным образом связана с другой фундаментальной асимметрией - ионной асимметрией в содержании важнейших катионов во внутренней среде клеток относительно внешней среды Существуют близкие значения свободной энергии, необходимой для формирования хирально чистых биополимеров и ионной асимметрии клеток (Твердислов, Яковенко,2003) Возникновение таких асимметрий исходно связано с образованием предшественников живых клеток на неравновесной границе океан-атмосфера, где происходит фракционирование ионов и энантиомеров хиральных соединений Асимметричное и неравновесное распределение катионов между первичными клетками и средой, а также хиральная асимметрия аминокислот и углеводов, характерные для биологических систем, возникли при спонтанном замыкании линидных пузырьков-везикул в «первичном бульоне» древнего океана в ходе образования аэрозолей, включавших морскую воду поверхностной пленки В существующих живых системах эта связь опосредована через ион-транспортирующие системы мембран, в частности, ионные каналы и насосы
Следует отметить, что помимо Сахаров и аминокислот другие хиральные компоненты клетки в определенных случаях могут встречаться как в одной, так и в другой изомерной форме. В некоторых бактериях обнаружены L-caxapa и D-аминокислоты D-аминокислоты достаточно широко распространены в живой природе и, более того, входят в состав ряда биологически значимых коротких олигопептидов Встречаются бактерии, которые содержат D-глютаминовую кислоту и D-Ala в своих клеточных стенках, а в организме человека
вырабатывается в качестве нейромедиатора D-Ser Некоторые пептидные антибиотики, а также плазма крови высших организмов, имеют в своем составе D-аминокислоты Некоторые термофилы используют высокие концентрации D-Ala в качестве осморегулятора В нервных клетках высших организмов находят D-Ala, D-Asp и D-Ser, иногда в значительных концентрациях. Поэтому в целом биологический мир не обнаруживает хиральной чистоты, но все, что относится к матричному синтезу полипептидов, характеризуется абсолютной хиральной чистотой
Рассматривая общие структурные особенности природной клетки, целесообразно выделить два аспекта нарушения зеркальной симметрии живой природы Во-первых, это эволюпионно востребованная необходимость гомохиральности, во-вторых - эволюпионно закрепившийся знак хиральности
Физико-химические и биологические основы гомохиральности биополимеров в последнее время изучены достаточно разносторонне (Аветисов, Гольданский,1996, Чернавский,2000; Твердислов, Яковенко, 1992, 2007) Основы механизмов сопряжения ионной и хиральной асимметрий рассмотрены в работах Твердислова, Яковенко, Дмитриева (1988 - 2007)
Гомохиральность белков и нуклеиновых кислот в первую очередь определяет их стереоспецифичность - необходимое условие матричного синтеза. Существует связь между хиральностью (дезокеи)рибозы и требованием комплементарности двойной спирали ДНК Замена единичного природного D-нуклеотида в двунитевой структуре ДНК на зеркально сопряженный ему L-изомер приводит к образованию структуры с большей энергией, нарушению комплементарности хирально дефектной пары, причем данный дефект не является локальным, а разрушает значительную область двунитевой структуры
Во-вторых, гомохиральность белков и нуклеиновых кислот обусловливает стабильность их структур, обеспечивающих их функционирование
В-третьих, для биохимических преобразований гомохиральных соединений требуется гораздо меньший набор ферментов, чем для таких же преобразований гетерохиральных соединений Так, для катализа двух оптических изомеров необходимы два белка, а для работы с рацемической смесью необходим удвоенный набор белков
Несмотря на значительные успехи, достигнутые в области исследования гомохиральности биополимеров, физико-химическое и биологическое основы того, что белки-ферменты и нуклеиновые кислоты имеют строго определенный знак хиральности, остаются неизвестными Так, согласно гипотезе спонтанной дерацемизации (Гольданский,Кузьмин,1989), повторение всей совокупности событий, приведших к появлению хиральной чистоты, с равным успехом способно привести к такой биосфере, которая использует D-аминокислоты и L-caxapa К такому же результату приводит гипотеза решающей роли глобального фактора преимущества, усиленная учетом слабых нейтральных токов
Для объяснения выбора знака хиральности были проведены расчеты (Mason et al,1984), в которых было показано, что вклад слабых взаимодействий во взаимодействие электронов с ядром асимметрического центра хиральной молекулы приводит к относительному сдвигу энергий основных состояний энантиомеров Несмотря на то, что для достаточно простых молекул (аминокислот и Сахаров) величина данного сдвига исключительно мала (составляет 10"15-10"17 кТ), наиболее важным результатом таких расчетов было то, что энергия основного состояния L-аминокислот и D-сахаров оказалась ниже, чем энергия их зеркальных антиподов Кроме того, наблюдаются небольшие различия в кинетике реакций с участием L- и D-аминокислот (Фалсом,1982) Различие физико-химических свойств стереоизомеров некоторых аминокислот проявляется не только в кинетике реакций, но и термодинамически Так, например, для L-Ala температура плавления 315-316С, а для D-Ala - 291-293С (CRC Hanbook of Chem and Phys, 84 Ed, CRC Press, 2003-2004) Различие температур плавления в силу уравнения Вант-Гоффа приводит к различной зависимости растворимостей от температуры
Нам представляется наиболее рациональным искать ответ, хотя бы частичный, на вопрос о выборе строго определенного знака хиральности живой природы по результатам
- исследования структуры и механизмов функционирования хирально модифицированных модельных белков1, построенных из D-аминокислот,
1 Под хирально модифицированными белками мы понимаем белки, в которых проведена замена их L-аминокислот на соответствующие D-аминокислоты
- исследования изменений первичной структуры природных белков до
получения функционального соответствия их природным антиподам,
- исследования особенностей матричного синтеза неприродных антиподов
соответствующих белков
Вышесказанное объясняет перспективность построения хирально модифицированных модельных белков, включающих D-аминокислоты, а также исследования особенностей их матричного синтеза Изучение структурно-функциональных свойств хирально модифицированных белков, а также особенностей их матричного синтеза, позволят получить, по крайней мере, частичный ответ на вопрос о выборе строго определенного знака хиральности в ходе предбиологической эволюции
Очевидно, что при исследовании структуры и механизмов функционирования зеркальных антиподов биомолекул, практически невозможно охватить все их многообразие Так, в Банке белковых структур2 представлены более десятка тысяч белковых структур Поэтому имеет смысл ограничиться исследованием определенного класса белков, в качестве которого мы использовали ионные каналы мембран потенциал-независимый калиевый канал KcsA, потенциал-зависимый калиевый каналы KvAP, а/р, Kvl 2, а также NMDA-рецептор
Выбор ионных каналов в качестве объектов исследования не является случайным и обусловлен он тем, что, как ранее отмечалось, существует достоверно установленная сопряженность клеточной ионной и молекулярной хиральнои специфичности живых систем, реализуемая через различные ион-транспортнрующие системы - насосы, каналы, модификаторы
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось теоретическое исследование физико-химических механизмов переноса ионов в природных и хирально модифицированных модельных каналах с инвариантной и модифицированной аминокислотной последовательностью, а также гипотетических сценариев их матричного синтеза
Для достижения цели исследования решались следующие задачи
2 Protein Data Bank, Brookhaven National Laboratory, USA
1) Разработка метода расчета энергетических профилей ионов в мембранных
каналах, не требующего значительных затрат расчетного времени и
предсказывающего с хорошей точностью функциональные характеристики
каналов
2) Построение хирально модифицированных модельных каналов с
первичной структурой, инвариантной природным каналам, а также исследование
их структуры и механизмов функционирования
Исследование влияния изомеризации определенных аминокислотных остатков ионных каналов при старении организма на их структурные и функциональные характеристики
Разработка метода построения структуры хирально модифицированных модельных каналов с модифицированной первичной структурой и функциональными характеристиками, адекватными характеристикам природных каналов
Исследование гипотетических особенностей матричного синтеза хирально модифицированных модельных каналов, характеризующихся соответствием их функциональных характеристик аналогичным природным каналам
Объект и предмет исследования. Объектом исследования являлись
ионные каналы клетки (потенциал-независимый калиевый канал KcsA из Streptomyces hvidans, потенциал-зависимый калиевый канал KvAP из Аегоругит регшх, потенциал-зависимый калиевый канал Kvl 2 из Rattus norvegicus, комплекс а- и (3-субъединицы калиевого канала из Homo sapiens),
NR1 активный центр NMDA-рецептора из Rattus norvegicus в комплексе с Gly,D-SernD-cSer,
3) модельные D-аминокислотные каналы с модифицированной и
инвариантной природной первичной структурой
Четвертичную структуру природных белков брали из Банка белковых структур Выбор выше указанной группы каналов являлся не случайным, т к для них существуют надежные экспериментальные данные по структуре и функциональным характеристикам
Предметом исследования являлись механизмы функционирования и матричного синтеза гипотетических хирально модифицированных модельных ионных каналов
Предпосылки и направление исследования. Экспериментально обнаруженная и теоретически изучаемая изомеризация отдельных аминокислотных остатков каналов приведет не к ожидаемой инвариантности их третичной структуры, а к ее нарушению Последнее обстоятельство является причиной изменения функциональных характеристик каналов Для построения хирально модифицированных модельных каналов с природной функциональностью необходима модификация их первичной структуры Рассматривая гипотетический сценарий матричного синтеза, можно предположить, что модификация первичной структуры приведет либо к изменению нуклеотидной последовательности генов ДНК, кодирующих данные каналы, либо к изменению генетического кода Появление D-аминокислот в ионных каналах в процессе старения организма повлечет изменение их функциональных характеристик и в определенных случаях нарушение механизмов их функционирования
Методология и методы проведенного научного исследования. В работе использовались как традиционные методы расчета энергетических профилей ионов (молекулярная механика, квантовая химия) и функциональных характеристик каналов (теория абсолютных скоростей реакций Эйринга), так и разработанные нами методы
1) разделение дальних и ближних взаимодействий в расчетах энергетических
профилей ионов в поре каналов,
2) «энергетическое выравнивание» третичных структур белков как метод
построения хирально модифицированных модельных каналов с измененной
первичной структурой, структурно и функционально эквивалентных
соответствующим природным каналам
Научная новизна и значимость полученных результатов. В результате исследований впервые
1) Предложен расчетный метод, основанный на разделении ближних и дальних взаимодействий, позволяющий получать энергетические профили ионов в мембранных каналах В данном методе использовано сопряжение
квантовохимического расчета ближних взаимодействий и молекулярно-механического - дальних взаимодействий
2) Использование полученных энергетических профилей дает возможность
вычислять функциональные характеристики каналов с хорошей точностью, что
показано на примере ионной специфичности калиевых каналов клетки
3) Построены хирально модифицированные модельные каналы с
инвариантной природной аминокислотной последовательностью, которые
являются энергетически менее стабильными, чем их природные антиподы с
нарушенными механизмами функционирования и функциональными
характеристиками
Предложен метод, основанный на вариации первичной структуры и энергетическом выравнивании третичных структур, позволяющий моделировать атомную структуру хирально модифицированного модельного канала с природной функциональностью, а построенные D-аминокислотные каналы являются энергетически эквивалентными соответствующим природным каналам с аналогичными функциональными характеристиками
Предложена простейшая схема гипотетического сценария матричного синтеза D-изомеров каналов, участниками которого являются ДНК и РНК из L-сахаров, а также ферменты матричного синтеза из D-аминокислот Характерными особенностями данного синтеза являются либо модифицированная нуклеотидная последовательность экзонов, либо дублетная таблица универсального генетического кода (для построения хирально модифицированных модельных ионных каналов с природной функциональностью достаточно десяти D-аминокислот)
Появление D-аминокислот в ионных каналах, связанное со старением организма, приводит к нарушению функциональных характеристик каналов и ферментативных свойств NMDA-рецептора.
Практическая значимость полученных результатов. Разработанные подходы позволяют исследовать механизмы функционирования мембранных каналов, моделировать атомные структуры хирально модифицированных модельных белков с природной функциональностью
Установленные изменения в работе каналов, обусловленные изомеризацией некоторых аминокислот каналов в процессе старения организма или различного рода заболеваниями, позволяют наметить пути поиска эффективных лекарственных препаратов, в качестве активных центров которых служат рецепторы ионных каналов
Учитывая, что значительное число заболеваний связано с «каналопатологиями» - нарушениями функционирования ионных каналов, полученные результаты и разработанные подходы могут быть использованы при разработке стратегии и средств лечения этих заболеваний Полученные результаты могут применяться при исследовании биологического отклика организмов на изомеризацию каналов под воздействием антропогенных внешних факторов и для решения общих проблем хиральной безопасности биосферы
Полученные результаты расширяют представления о физических механизмах происхождения хиральной асимметрии биосферы, функционирования ионных каналов и могут быть использованы в курсах лекций по биофизике, биохимии и физиологии в университетах и вузах медико-биологического профиля
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
Обоснование метода разделения дальних и ближних взаимодействий в расчетах энергетических профилей, с помощью которого установлено, что в клетке с хирально модифицированными калиевыми каналами с природной первичной структурой будут нарушены многие биологические процессы, обусловленные функционированием калиевых ионных каналов (функциональные характеристики таких модельных каналов существенно отличаются от соответствующих характеристик природных каналов клетки), а также появление незначительного количества D-аминокислот в канале, связанное со старением организма, приводит к нарушению функциональных характеристик каналов
Если модельные L-дизоксирибозные ДНК были бы построены из четырех нуклеотидов, то для обеспечения матричного синтеза хирально модифицированных каналов с модифицированной первичной структурой и природной функциональностью была бы достаточна дублетная таблица генетического кода для десяти D-аминокислот G, A, S, С, D, N, К, Н, F, Р. Однако оптимальность реально существующего генетического кода и системы биосинтеза обусловлена
более широкой вариабельностью структурно-функциональных возможностей белков
Личный вклад соискателя. Выбор и обоснование научной тематики исследования, получение результатов, приведенных в диссертации, их анализ и интерпретация, как и основные публикации, сделаны при решающем участии соискателя
Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации представлены на 3-й Региональной научно-технической конференции «Проблемы экологии и экологической безопасности ЦЧ РФ» (Липецк, 1999), 7-й Международной конференции «Математика. Компьютер Образование» (Дубна, 2000), 3-м Всероссийском медицинском конгрессе (Ижевск, 2000), 3-м Сибирском конгрессе по прикладной и индустриальной математике (Новосибирск, 1998), 5-й Международной конференции «Физика в системе современного образования» (Санкт-Петербург, 1999), 3-й Всероссийский симпозиум «Математическое моделирование и компьютерные технологии» (Кисловодск, 1999), 4-м Сибирском конгрессе по прикладной и индустриальной математике (Новосибирск, 2000), 5-й Республиканской электронной научной конференции «Современные проблемы информатизации» (Воронеж, 2000), Международной конференции «Математика Образование Экология Тендерные проблемы» (Воронеж, 2000), 4-й Международной научно-технической конференции «Физика и радиоэлектроника в медицине и экологии» (Владимир, 2000), Международной конференции «Биохимическая физика на рубеже столетий» (Москва, 2000), 2-й Региональной научной конференции по органической химии «Органическая химия на пороге третьего тысячелетия - итоги и перспективы» (Липецк, 2000), 5-й Путинской конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2001), 8-й Международной конференции "Математика Компьютер Образование» (Пущино, 2001), 2-й Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2001), 3-й Всероссийской научной конференции «Молекулярная физика неравновесных систем» (Иваново, 2001), Международном симпозиуме «Компьютерное обеспечение химических исследований» (Москва, 2001), 7* Scandinavian Symposium on Chemometncs (Copenhagen, 2001), XVIII Съезде физиологического
общества им ИП Павлова (Казань, 2001), Школе-семинаре «Введение в многомерный анализ данных (проекционные методы)» (Москва, 2001), 3-й Всероссийской школе-конференции по квантовой и вычислительной химии им В А Фока (Великий Новгород, 2001), Международной школе-конференции «Введение в многомерный анализ данных (проекционные методы)» (Кострома, 2002), 13* International Congress on Molecular Biology (Toronto, 2002), 8-м Всероссийском симпозиуме «Биоинформатика и компьютерное конструирование лекарств» (Москва, 2002), 6-й Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущине, 2002), 3-й Всероссийской конференции «Молекулярное моделирование» (Москва, 2003), 4* Symposium on Multivariate Data Analysis (Moscow, 2003), 3-м Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), 4-й Всероссийской конференции «Молекулярное моделирование» (Москва, 2005), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, 2005), Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2006), 5-м Съезде Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, 2006), Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы естественных наук и их преподавания» (Липецк, 2006), 5-й Всероссийской конференции «Молекулярное моделирование» (Москва, 2007), 3-м Всероссийском съезде фармакологов (Санкт-Петербург, 2007), 5-м Международном семинаре «Компьютерное моделирование электромагнитных процессов в физических, химических и технических системах» (Воронеж, 2007)
Опубликованность результатов. По материалам диссертации опубликовано 72 печатные работы* 24 статьи в рецензируемых научных журналах по списку ВАК, в международных рецензируемых журналах - 3, статьи в других журналах, изданиях и тематических сборниках - 17, в материалах конференций -28. Список основных работ по теме диссертации приведен в конце автореферата
Структура и объем диссертации. Диссертация включает введение, основную часть, состоящую из 4 глав, заключение, основные выводы и список цитируемой литературы Диссертация изложена на 243 страницах, содержит 59 рисунков и 36 таблиц
