Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Общие сведения об ионных каналах 11
1.2. Общие сведения о натриевых каналах 13
1.3. Модель Ходжкина-Хаксли 16
1.4. Описание воротного процесса 24
1.5. Молекулярная архитектура натриевых каналов 29
1.5.1. Субъединицы и фрагменты 29
1.5.2. Изоформы натриевого канала 31
1.5.3. Пространственная организация натриевого канала 32
1.5.4. Воротные структуры 33
1.5.4.1. Активационные ворота 33
1.5.4.2. Инактивационные ворота 34
1.6. Модуляция активности натриевых каналов 36
1.6.1. Блокаторы натриевых каналов 36
1.6.2. Модификаторы натриевых каналов 38
1.7. Натриевые каналы мембраны сенсорных нейронов 40
1.8. Мембранные механизмы ноцицепции 42
1.8.1. Общие сведения о формировании болевого ощущения. Виды боли 42
1.8.2. Рецепторы и каналы, участвующие в кодировании ноцицептивных сигналов 47
1.8.3. Фармакологические подходы к купированию боли 52
1.8.4. Роль медленных натриевых каналов Nav1.8 в кодировании ноцицептивных сигналов 54
Глава 2. Материалы и методы исследования 58
2.1. Получение культуры изолированных нейронов 58
2.2. Метод фиксации потенциала на целой клетке 59
2.3. Обработка экспериментальных данных 62
2.4. Метод математического моделирования 64
Глава 3. Результаты исследования 69
3.1. Основные типы ионных каналов в мембране ноцицептивного нейрона 70
3.2. Экспериментальное исследование воротных характеристик каналов Nav1.8 и характеристик импульсной активности, генерируемой мембраной ноцицептивного нейрона 73
3.2.1. Исследование воротных характеристик каналов Nav1.8 73
3.2.1.1. Характеристики активационной воротной системы 76
3.2.1.2. Характеристики инактивационной воротной системы 80
3.2.2. Измерение величины плотности медленных натриевых каналов 90
3.2.3. Импульсная активность ноцицептивного нейрона: результаты экспериментов в режиме фиксации тока 92
3.3. Построение модели мембраны ноцицептивного нейрона 94
3.4. Экспериментальное исследование влияния коменовои кислоты на медленные натриевые каналы 97
3.5. Модулирование активности каналов Nav1.8: исследование на модели 102
3.5.1. Изменение характеристик активационной воротной системы каналов Nayl.8 под воздействием коменовои кислоты и их роль в формировании рисунка импульсной активности мембраны ноцицептивного нейрона 1 102
3.5.2. Изменение характеристик инактивационной воротной системы каналов Nav1.8 под воздействием коменовои кислоты и их роль в формировании рисунка импульсной активности мембраны ноцицептивного нейрона ПО
3.5.3. Влияние изменения величины плотности каналов Navl.8 на частоту повторных ответов 114
Заключение 118
Выводы 120
Список литературы
- Общие сведения о натриевых каналах
- Мембранные механизмы ноцицепции
- Обработка экспериментальных данных
- Измерение величины плотности медленных натриевых каналов
Введение к работе
Задачи исследования молекулярных механизмов кодирования болевого сигнала и участия в этом процессе мембранных ионных каналов представляются актуальными в связи с отсутствием в арсенале лекарственных препаратов таких аналгетиков, которые могли бы эффективно купировать боль, не вызывая негативных побочных эффектов. Новый подход к решению этой проблемы может быть осуществлен благодаря выяснению биофизических механизмов модуляции потенциалочувствительности медленных тетродотоксин-устойчивых (ТТХ-устойчивых) натриевых каналов Nav1.8, ответственных за кодирование ноцицептивной информации. Поэтому в нашей работе объектом исследования стали каналы Nav1.8. Выяснение их роли в процессе генерации повторных ответов мембраной ноцицептивного нейрона явилось целью настоящей работы.
Термин боль обозначает субъективное переживание, которое служит симптомом ряда заболеваний человека. Около 90% всех заболеваний связано с болью. По мнению Международной ассоциации изучения боли, следует разделять понятия боли и ноцицепции. Ноцицепция — это нейрофизиологическое понятие, обозначающее восприятие, проведение и обработку сигналов о повреждающих воздействиях и (или) патологических процессах. Начальным звеном ноцицептивной системы являются болевые рецепторы (ноцицепторы), расположенные практически во всех тканях организма. Сигналы различных модальностей преобразовываются
рецепторной мембраной ноцицепторов в аналоговый сигнал, рецепторный ток, а затем электровозбудимой мембраной - в универсальный для нервной системы дискретный код нервных импульсов. Низкая частота нервных импульсов несет информацию, например, о тактильных или температурных воздействиях, а ее повышение при усилении стимула является сигналом о возможном повреждении. Именно эта высокочастотная посылка нервных импульсов и воспринимается нами как болевое ощущение. Частотная граница, отделяющая ноцицептивные,разряды (более высокочастотные) от адекватных, возникающих в ответ на температурные или' тактильные стимулы, составляет единицы импульсов в секунду (Borovikova et al., 1997; Ревенко, Гаврилова, 2007). Потенциалозависимые медленные' натриевые каналы являются важнейшей молекулярной структурой, определяющей генерацию потенциалов действия и частоту повторных ответов в сенсорных нейронах (Kostyuk et al., 1981; Gold et al., 1996). В ноцицептивных нейронах, главную роль в кодировании ноцицептивных сигналов играют тетродотоксин-устойчивые натриевые каналы (Веселовский и др., 1979). При механических повреждениях, воспалительных процессах или действии гипералгезических агентов происходит увеличение плотности или потенциалочувствительности медленных натриевых каналов в мембране ноцицептивного нейрона (Akopian et al., 1996; Gold.et al., 1996, Lai et al., 2004), что ведет к повышению частоты импульсной активности. Напротив, снижение частоты повторных ответов должно вызывать аналгетический эффект. Так^ местные анестетики блокируют ионные каналы, но их действие
7 не является избирательным (Brau et al., 1998). Помимо блокирования
ноцицептивных сигналов, нарушается, например, и моторная активность
(Denac et al., 2000). Антиноцицептивный эффект может быть реализован
благодаря другому, более специфическому, ионному механизму. Этот
механизм заключается в модуляции -воротных характеристик каналов
Nav1.8.
Для того чтобы на системном уровне выявить физиологическую роль изменения параметров указанных воротных систем, необходимо исследовать импульсную активность в условиях максимально приближенных к адекватным. В методе локальной фиксации потенциала мы исследуем изолированные нейроны, ограниченное время жизни которых, как и ряд других неконтролируемых процессов в данных экспериментальных условиях, являются принципиальным ограничением. Математическая модель позволяет не только устранить ряд этих ограничений, но и выяснить функциональную роль отдельных молекулярных параметров, поскольку возможно изменять их в широком диапазоне значений независимо друг от друга.
С помощью метода математического моделирования создатели мембранной ионной теории (Hodgkin, Huxley, 1952, a-d) выяснили роль ионных каналов в генерации нервных импульсов на примере мембраны гигантского аксона кальмара. В дальнейшем, основные принципы ионной теории Ходжкина-Хаксли были с успехом использованы рядом других авторов для выяснения ионных механизмов формирования импульсной
8 активности, генерируемой различными электровозбудимыми мембранами
(Ходоров, 1969; Krylov, Makovsky, 1978; Миронов, 1984; Read, Siegel, 1999;
Herzog et al., 2001; Shield, Kunze, 1997).
В нашей работе с помощью методов математического моделирования
и локальной фиксации напряжения была предпринята попытка выяснить
роль каналов Nav1.8 в процессе импульсного кодирования ноцицептивной
информации. В качестве агента, модулирующего
потенциалочувствительность этих каналов, была использована коменовая
кислота, являющаяся лекарственной субстанцией неопиоидного аналгетика
«Аноцептин», разработанного в Институте физиологии
им. И. П. Павлова РАН.
Цель и задачи исследования. Целью работы явилось исследование биофизических механизмов кодирования ноцицептивного сигнала и роли медленных натриевых каналов в этом процессе.
Задачи настоящего исследования заключались в следующем:
На основании собственных экспериментальных данных разработать математическую модель типа Ходжкина-Хаксли мембраны ноцицептивного нейрона для выяснения механизмов импульсного кодирования информации мембраной указанного нейрона.
Выяснить механизмы модуляции коменовой кислотой возбудимости медленных натриевых каналов и роли этого процесса в кодировании ноцицептивной информации на основании собственных экспериментальных данных и в расчетах на модели.
3. Выяснить роль медленных натриевых каналов в процессах частотного
кодирования и адаптации мембраны ноцицептивного нейрона к действию постоянного стимула. Исследовать роль медленной натриевой инактивации каналов Nav1.8 в указанных процессах. Основные положения, выносимые на защиту. Положения, выносимые на защиту, заключаются в следующем.
На основании собственных экспериментальных данных, полученных методом локальной фиксации потенциала, построена модель типа Ходжкина-Хаксли мембраны ноцицептивного нейрона, с помощью которой исследованы ионные механизмы кодирования ноцицептивной информации.
Снижение потенциалочувствительности активационной воротной системы медленных натриевых каналов приводит к уменьшению частоты повторных ответов мембраны ноцицептивного нейрона. Благодаря этому механизму при воздействии коменовой кислоты может происходить купирование патологической боли периферического происхождения.
Модификация математической модели мембраны ноцицептивного нейрона учетом экспериментально обнаруженных характеристик медленной инактивации каналов Nav1.8 также приводит к снижению частоты повторных ответов. Важной особенностью этого эффекта
10 является возникновение адаптации мембраны к действию постоянного
стимула.
4. Снижение плотности каналов N^1.8 приводит к снижению частоты
импульсной активности.
Общие сведения о натриевых каналах
Потенциалозависимые натриевые каналы присутствуют в клетках многих тканей, но особую роль они играют в генерации и проведении возбуждения в электровозбудимых тканях (нервная и мышечная). Основные представления о принципах функционирования ионных каналов сложились к концу 70-х годов прошлого столетия в результате многочисленных исследований с использованием метода фиксации потенциала на мембране клеток нервной и мышечной тканей различной природы (НШе, 2001).
На рисунке 1.1 представлена функциональная схема потенциалозависимого ионного канала, впервые предложенная В. НШе (НШе, 2001). Эта схема отражает два принципиальных свойства ионных каналов, рассматриваемого типа:
а) существование особой воротной системы, в результате функционирования которой канал способен совершать переходы между дискретными состояниями проводимости: непроводящим (закрытым) и проводящим (открытым). Проводимость одиночных натриевых каналов в разных объектах колеблется от 4 до 24 пСм.
б) второе принципиальное свойство - избирательная проницаемость для определенного вида ионов, которая обеспечивается геометрическими и электростатическими параметрами всей ионопроводящей поры.
Входные (более широкие) участки, называемые наружным и внутренним устьями канала, имеют размеры, позволяющие ионам входить в них в полной гидратной оболочке. Ионы несут определенный электрический заряд, благодаря чему осуществляется избирательность между ионами разного знака (катионами и анионами). Особый участок канала, наиболее узкий, это селективный фильтр, который определяет избирательность по отношению к ионам данного знака. Зависимость тока от мембранного потенциала через популяцию данного типа каналов можно описать уравнением:
КЕт)= ЩЕт) у (Ет - Ет), где Ет — потенциал на мембране; N— число каналов данной популяции в открытом состоянии; у - проводимость одиночного канала данной популяции; Erev - потенциал реверсии, который зависит от ионного состава с обеих сторон мембраны и избирательности каналов данного типа. Он может быть оценен с использованием уравнения Ходжкина-Гольдмана-Каца [1.1]. Для случая натриевых каналов в физиологически адекватных ионных условиях это выражение имеет вид: а=( 77 )1п{( а[На]0+Рк[К]0)/(Р№[Ма]г+Рк[К],) [1.1] Плотность натриевых каналов в клетках различных электровозбудимых тканей варьирует в пределах 50-500 каналов на мкм2, а в перехватах Ранвье плотность достигает 2000 каналов на мкм2".
Фундаментальной основой современных представлений о структурно-функциональной организации ионных каналов являются классические работы А. Ходжкина и Э. Хаксли (Hodgkin, Huxley, 1952a-d). Именно Ходжкин и Хаксли ввели понятие потенциалозависимого ионного канала.
Они впервые успешно использовали новый экспериментальный метод - метод фиксации потенциала (voltage-clamp method) — для изучения процессов, лежащих в основе генерации и проведения нервного импульса в гигантском аксоне кальмара. Суть этого метода заключается в использовании усилителя с отрицательной обратной связью, что позволяет быстро смещать и поддерживать на заданном уровне мембранный потенциал (МП). Данный метод позволил зарегистрировать ионные токи, а так же осуществить их разделение на компоненты, соответствующие различным типам каналов (рис. 1.2).
Мембранные механизмы ноцицепции
Международная ассоциация по изучению боли (IASP) дает следующее определение понятию боль: "Боль это неприятное сенсорное и эмоциональное переживание, связанное с истинным или потенциальным повреждением ткани или описываемое в терминах такого повреждения". Согласно IASP необходимо проводить различия между болью и ноцицепцией. Боль - субъективное переживание, которое служит симптомом большинства острых и хронических заболеваний человека. Ноцицепция (от лат. посео — вредить) — это нейрофизиологическое понятие, обозначающее восприятие, проведение и обработку сигналов о повреждающих воздействиях и (или) патологических процессах.
Первая стадия формирования болевого ощущения связана с активацией тканевых периферических рецепторов, ноцицепторов, кодирующих не только информацию о болевом воздействии, но и сигналы других модальностей. Ноцицептивные сигналы передаются в спинной мозг по афферентным волокнам групп С и А5. Низкая частота нервных импульсов несет информацию об адекватном, например, тактильном или температурном воздействии. Повышение частоты при резком усилении стимула является сигналом о возможном повреждении. Именно эта более высокочастотная посылка нервных импульсов и воспринимается как болевое ощущение. Точная частотная граница ноцицептивного сигнала сегодня остается не определенной. В различных объектах она может варьировать. Так, по данным Ревенко С. В. и соавторов, для кожных ноцицепторов кошки это частота составляет 2 имп/с (Ревенко, Гаврилова, 2007).
Процесс преобразования генераторного тока рецепторов в код нервных импульсов, т.е. своеобразное аналого-импульсное преобразование, осуществляется кодирующей мембраной ноцицепторов. Указанный процесс является базисным механизмом кодирования болевого ощущения. Особая роль в генерации импульсной активности принадлежит медленным тетродотоксин-устоичивым натриевым каналам Nav1.8 ноцицептивных нейронов. Возможность специфического модулирования возбудимости медленных натриевых каналов представляет большой практический интерес с точки зрения разработки аналгетиков нового поколения.
Различают три типа рецепторов боли: мономодальные А8-ноцицепторы, реагирующие на механическое и термическое раздражение; полимодальные С-ноцицепторы, раздражаемые механическими, тепловыми и химическими стимулами, и так называемые "спящие" ноцицепторы. Эти ноцицепторы активизируются только во время воспаления. Анатомически первый тип ноцицепторов представлен свободными разветвленными нервными окончаниями, лишенными миелина. Они представляют собой быстрые А8-волокна, проводящие раздражение со скоростью 630 м/с. Полимодальными «молчащие» и С-ноцицепторы представлены плотными некапсулированными гломерулярными тельцами. Немиелинизированные афферентные С-волокна проводят раздражение со скоростью 0,52 м/с и распределяются во всех тканях организма, за исключением центральной нервной системы. Рецепторы кожи связаны с обоими видами нервных волокон, а глубокие ткани внутренних органов в основном иннервируются наиболее медленно проводящими безмиелиновыми С-волокнами.
Тела ноцицептивных нейронов локализованы в дорзальных ганглиях спинного мозга и морфологически характеризуются небольшим диаметром (до 20 мкм) и более темной окраской. Отличительной особенностью данных нейронов является преобладание медленных тетрордотоксин-устойчивых натриевых каналов Nav1.8.
Боль — понятие и клинически, и патогенетически сложное и неоднородное. Она различается по интенсивности, локализации и по своим субъективным проявлениям. Боль может быть стреляющей, давящей, пульсирующей, режущей, а также постоянной или периодической. Все существующее многообразие очень важно для определения причин боли и последующего лечения.
Обработка экспериментальных данных
Для построения вольт-амперных характеристик для максимальных (пиковых, /пик) значений токов как функции величины тестирующего потенциала (/Пик(Д-ест)) на мембрану подавали последовательность деполяризующих ступенек напряжения (Егест). Далее на основании вольт-амперной характеристики строилась кривая хордовой проводимости G a(E) = 1ПШ(Е)/(Е-Е , которая затем нормировалась к ее максимальным значениям. Функции нормированной хордовой проводимости является функцией распределения каналов в открытом состоянии в зависимости от потенциала и вычисляется следующим образом GNa()HOpM = GNa()/ ОкГХЕ), где Na - величина потенциала реверсии натриевого тока, 1тк(Е) - пиковое значение тока при деполяризующем потенциале Егсст, G iE) — ее максимальное значение.
Для оценки функции G a(E) обычно применяется уравнение распределения Больцмана G(E) = Gmax()/(1 + ехр{( - E05)/k}), которое позволяет только качественно оценить изменение характера потенциалозависимости. Для количественной оценки потенциалозависимости активационного воротного устройства медленных натриевых каналов мы воспользовались подходом, предложенным Алмерсом (Алмерс, 1981). Более подробно этот подход описан в главе «Обзор литературы».
Предположим, что число открытых каналов (N0) пропорционально величине хордовой проводимости Gm(E), а число закрытых каналов (Nc) соответствует { 3шшах - GNa(E) с, где GNamax — максимальная хордовая проводимость, соответствующая состоянию, при котором все каналы открыты по активационному механизму. Тогда: Hm(iV0/7Vc) = \іт[ а(Е)/{ GNamax - GNa() У] - Cexp[ZefeE/kT], [2.1] E- - oo E— - oo E— - oo где С - константа, Zgj - эффективный заряд, выраженный в единицах заряда электрона е, к - постоянная Больцмана, Т - абсолютная температура. Очевидно, что при Е— - со указанная функция представляет собой одну экспоненту (правая часть выражения [2.1]), которая может быть наглядно представлена с удовлетворительной точностью с помощью регрессионной прямой, проходящей через начальные точки логарифмической чувствительности (средняя часть выражения [1.2]). Тангенс угла наклона этой прямой определяется предельной пороговой логарифмической чувствительностью к потенциалу исследуемого активационного воротного устройства ТТХ-устойчивых натриевых каналов (Алмерс, 1981).
Для изучения механизмов первичного сенсорного кодирования ноцицептивной информации, а также для оценки роли воротных характеристик медленных натриевых каналов в импульсном кодировании был применен метод математического моделирования (Hodgkin, Huxley, 1952a-d; Krylov, Makovsky, 1978; Миронов, 1984). В мембране ноцицептивного нейрона млекопитающих при генерации импульсной активности основную роль играют следующие ионные токи: Imj— быстрый тетродотоксин-чувствительный натриевый, /Na_j_ медленный тетродотоксин-устойчивый натриевый, 1к-задержанный калиевый ток, а также ток утечки II-При учете всех этих токов временная зависимость потенциала мембраны описывается следующей системой уравнений: С ш- = I -1 -I -I -Т ) at — = ax(l-x)-psx, at где Im — мембранный ток, Ст — емкость мембраны, х — переменная, которая описывает процесс активации или инактивации соответствующей популяции ионных каналов. Она соответствует общепринятым значениям переменных Ходжкина-Хаксли (т, h или п). Натриевый ток рассчитывается по формуле 1 оуИ(Е-Еш), [2.2] где Gj - проводимость для j-ro тока мембраны (/ соответствует обозначениям Na s или NajO Na - равновесный потенциал для соответствующей популяции ионов, т и h - переменные активации и инактивации соответственно, а — показатель степени переменной активации.
Измерение величины плотности медленных натриевых каналов
В отдельной серии экспериментов с использованием режима фиксации тока была исследована импульсная активность ноцицептивных нейронов (рис. 3.13). Установлено, что непосредственно после образования плотного контакта потенциал покоя большинства исследованных нейронов находился в пределах от -45 до —57 мВ. Для устранения инактивации всех типов токов уровень потенциала покоя мог быть задан в диапазоне от - 70 до - 100 мВ, что осуществлялось за счет приложения постоянного гиперполяризующего тока. При подаче ступеньки деполяризующего тока, начиная с некоторого порогового значения, наблюдалась генерация одиночного ответа (рис. 3.13, А) или серии импульсов (рис. 3.13, Б). При выключении быстрого натриевого тока (с помощью добавления ТТХ в концентрации 0.0001 ммоль/л) способность генерации потенциала действия сохранялась. В данном эксперименте при этом наблюдалось уменьшение амплитуды регистрируемого ПД и увеличение его длительности.
Таким образом, серия экспериментов в режиме фиксации тока показала, что генерация мембраной нейрона импульсной активности (как одиночного ПД, так и серии импульсов) возможна за счет функционирования следующих популяций ионных каналов: быстрых и медленных натриевых каналов, калиевых, и каналов тока утечки. Специфичность мембраны ноцицептивного нейрона структурно обусловлена высокой плотностью каналов Nav1.8, а также особым соотношением плотностей других типов натриевых и калиевых каналов. Функционально это специфичность проявляется в способности генерировать импульсную активность в широком диапазоне стимулирующих токов. В связи с отмеченным выше базовая модель ноцицептивного нейрона должна удовлетворять следующим требованиям. Она должна включать в себя популяцию медленных натриевых каналов, плотность которых может варьировать в широких пределах, а соотношение плотностей калиевых каналов и других популяций натриевых каналов должно быть строго детерминировано требованиями эксперимента. Другими словами, необходимо экспериментально определить границы варьирования параметров GNa smax, GNa y-max, GKmax, GLmax, описывающих максимальные проводимости натриевых каналов, калиевых и каналов тока утечки, соответственно. Базовая модель мембраны ноцицептивного нейрона должна обеспечивать генерацию импульсной активности в широком диапазоне стимулирующих токов. При выполнении этих условий появляется возможность модификации воротных устройств медленных натриевых каналов с целью выяснения их роли в кодировании ноцицептивной информации. Возникающее при этом снижение частоты повторных ответов может быть интерпретировано как молекулярный механизм модуляции этого процесса. В предварительной серии экспериментов в режиме фиксации потенциала были определены границы варьирования интегральных проводимостей калиевых, быстрых натриевых каналов. Для клеток, емкость мембраны которых была от 20 до 25 пФ, диапазон проводимостей составил: GNa/max = 30-100 нСм, Gxmax = 30 - 150 нСм. Проводимость утечки варьировала в широких пределах: от 1 до 3 нС.
В исследуемых нами нейронах величина потенциала реверсии для ионов натрия и калия была близка к равновесному потенциалу, рассчитанному по уравнению Нернста. Необходимо учесть, что точность оценки потенциала реверсии зависела от точности компенсации электродного потенциала в начале эксперимента. Так, для ионов натрия она составляла от 45 до 55 мВ, для ионов калия - от - 90 до - 80 мВ.
С учетом отличия свойств мембраны в условиях длительного эксперимента в режиме фиксации потенциала и свойств нативной мембраны, в модели были использованы следующие значения численных параметров: GNa/max = 50 нСм, GKmax = 40 нСм, См = 20пФ, Ка = 55мВ, к = -85мВ. Потенциал покоя и потенциал реверсии токов утечки были выбраны равными - 70 мВ. Здесь Ст - емкость мембраны; Е а Ек — равновесный потенциал для ионов натрия и калия, соответственно. Величина проводимости каналов тока утечки (Gx) с учетом полученных нами экспериментальных данных была выбрана равной 5 нСм. Здесь мы учли также кабельные свойства интактного нейрона (Тимин, 1979), которые проявляются в физиологически адекватных условиях.
Для построения базовой модели типа Ходжкина-Хаксли мембраны ноцицептивного нейрона был разработан полный набор уравнений и зависимостей от потенциала констант скоростей для каналов с использованием как литературных (Read, 1996; Chevrier et al., 2004), так и собственных экспериментальных данных (уравнения [2.4], [2.5], [3.1]). Базовая система включает в себя шесть линейных дифференциальных уравнений и позволяет описывать изменения во времени мембранного потенциала как функцию состояния воротных механизмов всех типов каналов.
