Введение к работе
Актуальность исследования
Исследование молекулярных механизмов процессов передачи возбуждения в синапсе является одним из перспективных подходов для понимания способов обеспечения пластичности нервной системы, лежащих в основе таких фундаментальных физиологических процессов как обучение, память, управление движением, патогенез ряда заболеваний центральной и периферической нервной системы, а также для создания фармакологических препаратов, избирательно действующих на разные этапы процесса передачи информации в синапсе. Традиционно в качестве ведущих пресинаптических факторов обеспечения синаптической пластичности рассматриваются изменение количества квантов медиатора, освобождающихся в ответ на нервный импульс (Zucker R.S. and Regehr W.G., 2002) и размера кванта (Van der Kloot W., 1991). Вместе с тем, в последние годы показано существование еще одного, ранее не учитываемого эффективного механизма пресинаптической модуляции передачи возбуждения, связанного с изменением временного хода (кинетики) секреции выделения квантов, формирующих многоквантовый ответ (Bukharaeva Е. et al., 1999, 2002; Nikolsky Е. et al., 2004). Ранее проведенные экспериментальные исследования дают основания полагать, что механизмы, контролирующие кинетику секреторного процесса, являются кальций-зависимыми, однако отличными от механизмов, определяющих количество освобождаемых квантов медиатора (Bukharaeva Е. et al., 1999; Parnas I. et al., 1999; Neher E., 2005; Bukharaeva E. et al., 2007), что ставит задачу более тщательного изучения путей кальциевой регуляции кинетики выделения квантов.
Вход ионов кальция в нервное окончание через потенциал-зависимые кальциевые каналы инициирует цепь событий, приводящих к экзоцитозу синаптических везикул (для обзора: Зефиров А.Л. и Ситдикова Г.Ф., 2010; Catterall W.A. and Few А.Р., 2008). Принято считать, что в отличие от синапсов центральной нервной системы, где в запуске процесса секреции участвуют потенциал-зависимые кальциевые каналы разных типов, в синапсах периферической нервной системы взрослых животных экзоцитоз опосредован преимущественно одним типом кальциевых каналов. Для нервно-мышечного соединения теплокровных это P/Q каналы (по современной классификации Сау2.1), а для синапсов лягушки - N (Сау2.2) каналы (Uchitel O.D. et al., 1992; Wright СЕ. and Angus J.A., 1996; Katz E. et al., 1995, 1996). Тем не менее, современные данные, полученные методами иммуногистохимии, свидетельствуют о наличие на двигательных нервных
4 окончаниях каналов других типов (Robitaille R. et al., 1996; Day N.C. et al., 1997; Sand 0. et al., 2001; Pagani R. et al., 2004). Однако вопрос о том, какую роль играют разные каналы в регуляции таких параметров секреторного процесса как кинетика и количество освобождаемых квантов, остается открытым. В связи с многообразием пресинаптических потенциал-зависимых кальциевых каналов, разным представительством в нервно-мышечных синапсах теплокровных и холоднокровных, для понимания механизмов регуляции интенсивности и кинетики секреции и поиска эффективных способов избирательного воздействия на эти механизмы, актуальным является сопоставление роли потенциал-зависимых кальциевых каналов, участвующих в регуляции вызванной секреции ацетилхолина в нервно-мышечных синапсах позвоночных.
Цель и задачи исследования
Целью исследования является изучение роли потенциал-зависимых кальциевых каналов разных типов в регуляции количества и кинетики секреции квантов, освобождаемых из двигательных нервных окончаний лягушки и мыши.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
Исследовать зависимость количества освобождаемых квантов и кинетики их секреции в синапсах лягушки и мыши от содержания ионов кальция во внеклеточной среде.
Изучить влияние неспецифических блокаторов потенциал-зависимых кальциевых каналов магния и кадмия на параметры квантовой секреции медиатора в синапсах лягушки и мыши.
Определить влияние специфических блокаторов потенциал-зависимых кальциевых каналов разных типов (N, P/Q и L) на параметры квантовой секреции медиатора в синапсах лягушки и мыши.
Оценить эффекты совместной блокады потенциал-зависимых кальциевых каналов разных типов на параметры квантовой секреции в синапсах лягушки и мыши.
Положения, выносимые на защиту
В нервно-мышечном синапсе холоднокровных (лягушка) N, P/Q и L потенциал-зависимые кальциевые каналы участвуют в регуляции как
количества квантов ацетилхолина, освобождаемых в ответ на нервный импульс, так и кинетики их секреции. В нервно-мышечном синапсе теплокровных (мышь) P/Q потенциал-зависимые кальциевые каналы контролируют только количество выделившихся квантов медиатора, а каналы L-типа участвуют в модуляции числа выделяемых квантов и кинетики их секреции в условиях высокой степеии асинхронности освобождения, каналы N-типа не принимают участия в регуляции вызванной секреции квантов.
Научная новизна
В ходе проведенных исследований сопоставлена кальциевая регуляция параметров вызванной квантовой секреции ацетилхолина в традиционных для классической нейрофизиологии объектах - синапсах лягушки и мыши. Впервые выявлено, что в исследованном диапазоне концентраций кальция, который позволяет оценить кинетику секреции отдельных квантов, при качественно одинаковой кальциевой зависимости количества выделяемых квантов в этих синапсах наблюдается разная кинетика их освобождения. Кинетика секреции квантов в синапсах мыши проявляет более выраженную зависимость от внеклеточной концентрации ионов кальция, чем в синапсах лягушки, и освобождение становится более синхронным при насыщающей концентрации кальция. Впервые на основании сопоставления коэффициентов Хилла для концентрационных зависимостей квантового состава и кинетики секреции в синапсах лягушки и мыши сделан вывод о том, что количество освобождаемых квантов и кинетика их выделения находятся под контролем разных механизмов с отличающейся чувствительностью к ионам кальция. Несмотря на то, что при уменьшении концентрации кальция степень асинхронности секреции возрастает в обоих типах синапсов, уменьшение входа кальция при использовании неспецифических блокаторов кальциевых каналов сопровождается разнонаправленным изменением степени синхронности секреции. Впервые показано, что в синапсах лягушки кальциевые каналы N, P/Q и L типов участвуют в регуляции как квантового состава, так и кинетики секреции. В синапсах мыши проявляются различия в функциональной роли этих каналов: каналы P/Q-типа регулируют только квантовый состав, не затрагивая кинетику секреции, а каналы L-типа могут принимать участие в регуляции как количества секретируемых квантов, так и их кинетики в условиях исходно высокой степени асинхронности секреции.
Научно-практическая значимость
Основное значение результатов проведенного исследования состоит в
получении данных о функционально различной роли потенциал-зависимых кальциевых каналов разных типов в синапсах теплокровных и холоднокровных, о разном характере зависимости кинетики секреции квантов от концентрации кальция в этих синапсах, что необходимо учитывать при анализе эффектов различных фармакологических агентов, обладающих каналоблокирующими свойствами. Выявленная способность блокатора P/Q каналов в синапсах мыши избирательно модулировать квантовый состав, не затрагивая кинетику секреции, дает дополнительное доказательство того, что разные механизмы участвуют в регуляции квантового состава и кинетики секреции медиатора. Полученные данные важны для сравнительной физиологии, а также для понимания механизмов развития каналопатий и фармакологических исследований, направленных на тестирование новых лекарственных препаратов, обладающих каналоблокирующими свойствами.
Апробация работы
Материалы работы доложены на VIII East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology (Kazan, 2006); Всероссийских научно-практических конференциях «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007,2008,2009); Международной школе PENS Summer course «Contemporary Problems of Neurobiology: Molecular Mechanisms of Synaptic Plasticity» (Kazan, 2007); международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2008,2010); ГУ и V международных междисциплинарных конгрессах «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2008, 2009); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пушино, 2009).
Работа выполнена при поддержке грантами РФФИ № 08-04-00923, Президента РФ «Ведущая научная школа» НШ-4177.2008.4 и Американского Фонда Гражданских исследований (CRDF RUB1-2823-KA06).
Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 107 страницах., иллюстрирована 38 рисунками и 2 таблицами. Список цитируемой литературы содержит 165 источников, из них 154 иностранных авторов.
Эксперименты выполнялись на изолированном френико-диафрагмальном препарате белых лабораторных мышей обоего пола весом 20-25 г и на изолированном нервно-мышечном препарате кожно-грудинной
мышцы озерных лягушек (R. ridibunda) в осенне-зимний период. Приготовление изолированных нервно-мышечных препаратов производили в условиях эфирного наркоза.
Выделенные мышцы с фрагментом нерва закрепляли на подложке из смолы Sylgard в экспериментальной ванночке, объемом 5 мл, через которую со скоростью 5 мл/мин протекал физиологический раствор следующего состава: а) для теплокровных (ммоль/л): NaCl - 115.0; КО - 5; Hepes 5.0; глюкоза 11.0; б) для холоднокровных: NaCl 113.0; КС1 2.5; NaHC03 3.0. Концентрацию СаС12 изменяли в диапазоне 0.2 - 0.6 ммоль/л, a MgCb 4.0 — 8.0 ммоль/л. Для сохранения изоосмотичности растворов, изменение содержания двухвалентных катионов корректировали соответствующим изменением концентрации NaCl. рН растворов поддерживали на уровне 7.2 — 7.4. Все эксперименты проводили при температуре 20.0±0.3С, стабилизацию которой осуществляли при помощи встроенных в дно ванночки элементов Пельтье и отслеживали с помощью миниатюрного датчика, расположенного в ванночке в непосредственной близости от микроэлекгрода.
В экспериментах были использованы следующие вещества (все фирмы Sigma): со -конотоксин GVIA, со -агатоксин IVA, нитрендипин, ДМСО (диметилсульфоксид). Поскольку нитрендипин растворялся в ДМСО, конечная концентрация которого в растворе не превышала 0.1%, то предварительно были проведены эксперименты по анализу эффектов растворителя на исследуемые процессы.
Одновременная регистрация токов действия нервного окончания и одпоквантовых токов концевой пластинки
Для одновременной регистрации токов действия нервного окончания и токов концевой пластинки (ТКП) под визуальным контролем к области синапса подводился микроэлектрод, заполненный физиологическим раствором, с оплавленным кончиком и диаметром 2.5-3.5 мкм, (сопротивление 2.0-4.0 Мом). Для визуализации синаптической области использовали микроскоп Olympus BW-51, оснащенный водоимерсионным объективом LUMPPlan FI 40х фирмы Olympus. Микроэлектрод подводили таким образом, чтобы была возможна одновременная регистрация токов действия нервного окончания и постсинаптического ТКП в проксимальной области синаптического контакта на расстоянии 5-Ю мкм от последнего перехвата Ранвье.
Стимуляцию двигательного нерва осуществляли с помощью «всасывающего» электрода прямоугольными электрическими импульсами длительностью 0.1 мс супрамаксимальной величины с частотой 0.5 имп/с.
Зарегистрированные сигналы после фильтрации до 10 кГц усиливали и подавали на вход 16 разрядного аналого-цифрового преобразователя, квантуя с интервалом 3-5 мкс. Анализ вызванных сигналов в «окне» регистрации длительностью 10 мс осуществляли с помощью персонального компьютера и созданной в нашей лаборатории программы.
Так как при попадании в «окно» регистрации спонтанно возникающих миниатюрных ТКП возможны искажения результатов измерения, в каждом опыте на основании измерений средней частоты спонтанных сигналов рассчитывали вероятность их попадания в окно регистрации. Если эта вероятность превышала значение 0.005 (то есть 5 сигналов на 1000 стимулов), то такой эксперимент не принимался в расчет.
Анализ параметров токов действия нервного окончания и одноквантовых ТКП
Для оценки параметров тока действия нервного окончания измеряли максимальное значение амплитуды натриевой компоненты и ее длительность на уровне 50% от максимальной амплитуды. Для оценки одноквантовых токов концевой пластинки (ТКП) анализировали максимальную амплитуду, время нарастания переднего фронта от 20 до 80% максимального значения амплитуды и постоянную времени спада ТКП. Амплитуду зарегистрированных экстраклеточных сигналов выражали в мВ.
Средний квантовый состав (т) определяли, используя прямой метод подсчета количества выделившихся квантов или метод «выпадений» (Del Castillo J. and Katz В., 1954; Katz В. and Miledi R., 1965; Martin A., 1955), no формуле: m=ln N/n0, где N - общее число импульсов, n0 - число выпадений. Количество зарегистрированных одноквантовых ответов в каждом опыте варьировало в пределах 300-500.
Оценка параметров временного хода вызванной секреции квантов медиатора
Величину истинной синаптической задержки определяли как временной интервал от пика натриевой компоненты тока нервного окончания до начала ТКП на уровне 20% от максимального значения его амплитуды. Для анализа временного хода квантовой секреции медиатора строили гистограммы и кумулятивные кривые распределения истинных синаптических задержек одноквантовых ТКП.
Анализировали следующие характеристики временного хода секреции:
1) величину минимальной синаптической задержки. С этой целью зарегистрированные величины истинных синаптических задержек
одноквантовых ТКП ранжировали по возрастанию и усредняли первые 5% значений от общего количества сигналов в контрольных условиях или после подачи вещества.
2) главную моду гистограммы распределения синаптических задержек.
3) степень асинхронности секреции квантов медиатора. Исходя из
результатов измерения истинных синаптических задержек для отобранных
одноквантовых ТКП (соответствующих первому пику на гистограмме
амплитуд всех зарегистрированных ТКП) строили кумулятивные кривые и
анализировали значение квантиля на уровне 90% (Бронштейн И..Н. и
Семендяев К.А., 1986; Van der Kloot W., 1991). Параметр P90 характеризовал
временной интервал, в который попадало 90% измеренных значений
истинных синаптических задержек одноквантовых ТКП. Чем выше значение
параметра Р90, тем более выражена асинхронность секреции медиатора.
Статистическая обработка результатов
Для статистической обработки использовали программу Microcal Origin 7.5. Использовали стандартные методы определения средних величин, стандартных ошибок, а также параметрический t-критерий Стьюдента для попарно связанных вариант. Достоверность различия двух кумулятивных кривых определяли по критерию Колмогорова-Смирнова (Бронштейн И.Н. и Семендяев К.А., 1986; Van der Kloot W., 1991) на уровне значимости 0.05.
