Содержание к диссертации
Введение
Понятие феномена прекондиционирования 5
Типы прекондиционирования 5
Гипоксическое прекондиционирование 5
Ишемическое прекондиционирование 7
Дистантное прекондиционирование 8
«Перекрестная устойчивость» (cross-tolerance) 9
Фазы развития прекондиционирования 10
Механизмы прекондиционирования 11
Увеличение локального мозгового кровотока 11
Уменьшение эксайтотоксичности глутамата 12
Роль системы оксида азота в реализации защитных эффектов прекондиционирования 13
Участие белков теплового шока 14
Влияние прекондиционирования на апоптоз 15
Транскрипционные факторы, активирующиеся в процессе прекондиционирования 16
Регуляторний фактор, индуцируемый гипоксией — HIF-1 16
Транскритщонный фактор NF-KB 17
Другие транскрипционные факторы 18
АТФ-зависимые К+-каналы и их роль в реализации защитного эффекта прекондиционирования 19
Физиологическая роль АТФ-зависимых К+-каналов 19
Строение АТФ-зависимых К+-каналов 20г
Регуляция АТФ-зависимых К+-каналов 21
Роль АТФ-зависимых К+-каналов при метаболическом стрессе 22
АТФ-зависимые К*-каналы плазматической мембраны клеток 22
АТФ-зависимые К+-каналы внутренней мембраны митохондрий 23
Механизмы реализации защитного эффекта АТФ-зависимых К+-каналов 25
Связь с протеинкиназой С (РКС) 25
Взаимодействие с системой оксида азота (NO) 27
Взаимодействие с системой апоптоза 29
CLASS Экспериментальная часть 3 CLASS 2
Материалы и методы исследования 32
Моделирование локального ишемического инсульта 32
Методы оценки размера очага поражения коры головного мозга крыс 33
Гистохимический метод оценки размера очага поражения 33
Оценка размера зоны инфаркта методом магниторезонансной томографии (МРТ) 34
Сравнение методов оценки размера области поражения левого полушария: гистохимическй метод окраски ТТХиМРТ 36
Морфологический метод оценки нейроглиального показателя в перифокальной зоне очага поражения 37
Измерение концентрации нейроспецифического кальций-связывающего белка S100P в сыворотке крови крыс 38
Измерение концентрации глюкозы в крови экспериментальных животных... 39
Метод регистрации и расчета гемодинамических параметров работы сердечно сосудистой системы крыс 39
Оценка поведенческой активности крыс 40
Тест «Приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) 40
Тест «Открытое поле» (ОП) 41
Тест «Y-образный лабиринт» 42
Тест «Условныйрефлекс пассивного избегания» (УРПИ) 43
Статистическая обработка данных 43
Протоколы эксперимента по изучению сравнительной эффективности различных типов прекондиционирования у крыс с моделью ишемического инсульта и роли К+лтФ-каналов в феномене прекондиционирования 44
Общая схема исследования 44
Используемые в исследовании модели прекондиционирования 45
Режим нормобарического гипоксического прекондиционирования (НГП) 45
Моделирование ишемического прекондиционирования (ИП) 45
Моделирование дистантного прекондиционирования (ДП) 45
Серия I: изучение влияния острой и отсроченной фаз различных типов прекондиционирования на размер очага поражения коры левого полушарияАб Серия II: исследование влияния отсроченной фазы (24 ч) НГП или ИП на
последствия моделируемого ишемического инсульта 47.
Протокол эксперимента по изучению влияния глибенкламида на параметры работы сердечно-сосудистой системы 49
Протокол эксперимента по изучению роли АТФ-зависимых К+-каналов в процессе прекондиционирования 50'-
Протокол эксперимента по изучению влияния прекондиционирования и блокады АТФ-зависимых К+-каналов на выработку УРПИ 51
Результаты исследования 53
Влияние острой и отсроченной фаз различных типов прекондиционирования на размер инфаркта коры левого полушария 53
Изменение размера очага поражения под действием прекондиционирования, проведенного за 1 час до ОЄМА 53
Изменение размера очага поражения под действием прекондиционирования, проведенного за 24 часа до ОСМА 53
Изменение размера очага поражения под действием прекондиционирования, проведенного за 72 часа до ОСМА 54
Динамика изменения концентрации белка S100P в сыворотке крови крыс после фокального ишемического инсульта 55
Исследование роли АТФ-зависимых К+-каналов в реализации защитного эффекта гипоксического и ишемического типов прекондиционирования 57
Влияние глибенкламида на концентрацию глюкозы в сыворотке крови и гемодинамические параметры работы сердечно-сосудистой системы крыс 57
Динамика изменения концентрации глюкозы в крови экспериментальных животных 60
Результаты, полученные в эксперименте с использованием нормобарического гипоксического прекондиционирования 61
Оценка размера области поражения коры левого полушария мозга 61
Оценка нейроглиального показателя в перифокальной области очага поражения левого полушария мозга 62
CLASS Результаты, полученные в эксперименте с использованием ишемического прекондиционировани CLASS я 65
Оценка размера области поражения коры левого полушария мозга 65
Оценка нейроглиального показателя в перифокальной области очага поражения левого полушария мозга 66
Результаты тестов для оценки поведения, проведенных в разные сроки после моделирования фокального инсульта 71
Оценка неврологического статуса и поведенческих реакций крыс на поздних сроках (26-32 сутки) после моделирования инсульта 71
Оценка неврологического статуса и поведенческих реакций крыс на 7-8 сутки после моделирования инсульта 73
Результат, полученный в эксперименте с использованием нормобарического гипоксического прекондиционирования 73
Результат, полученный в эксперименте с использованием ишемического прекондиционирования 75
Выработка условного рефлекса пассивного избегания на 3 сутки после моделирования инсульта 77
Результат, полученный в эксперименте с использованием нормобарического гипоксического прекондиционирования 77
Результат, полученный в эксперименте с использованием ишемического прекондиционирования 79
Обсуждение результатов 80
Заключение 94
Выводы 96
Список литературы 98
Список сокращений 114
- Гипоксическое прекондиционирование
- Уменьшение эксайтотоксичности глутамата
- Моделирование локального ишемического инсульта
- Оценка размера области поражения коры левого полушария мозга
Введение к работе
Ишемический инсульт - одна из наиболее тяжелых форм сосудистых поражений мозга, занимающая в России второе место в структуре общей смертности и первое место как причина стойкой утраты трудоспособности. Высокая заболеваемость, частые неблагоприятные исходы делают инсульт проблемой медицинской и социальной значимости [Верещагин Н.В., Суслина З.А., 2003].
В последние годы значительно расширился фронт исследований, направленных на изучение патогенеза ишемического поражения головного мозга, поиск фармакологических препаратов, предназначенных для стимуляции регенераторных процессов при данной патологии, а также немедикаментозных методов профилактики и лечения, основывающихся на активизации функциональных резервов организма, так называемого прекондиционирования.. [Чижов А.Я., Потиевская В.И., 2002; Романова Г.А., Шакова Ф.М., 2006].
Прекондиционирование является одним из потенциальных саногенетических подходов к защите мозга в клинической неврологии у больных, подверженных гипертоническим кризам, эпилептическим припадкам, инфарктам миокарда, у входящих в группу риска новорожденных, а также при подготовке к операциям на, сердце и мозге. Некоторые из способов прекондиционирования, такие как различные виды гипоксических тренировок, уже успешно применяются в некоторых областях медицины и в спорте [Чижов А.Я., Потиевская В.И., 2002]. Однако в клинической неврологии они пока не нашли широкого распространения.
Понимание молекулярных механизмов, принимающих участие в реализации нейропротекторных свойств прекондиционирования, может дать основу для создания методик защиты пациентов нейрохирургических клиник, а также для разработки фармакологических препаратов, способных предупредить последствия ишемического поражения мозга и улучшить прогноз для больных, входящих в группу риска по развитию инсульта.
Гипоксическое прекондиционирование
В качестве прекондиционирования может выступать практически любой повреждающий стимул подпороговой силы [Dirnagl U. et al., 2003]. Установлено, что прекондиционирование вызывает устойчивость к последующей ишемии во многих системах органов: в мозге, сердце, печени, тонком кишечнике, скелетной мускулатуре, почках и легких [Nandagopal К. et al., 2001]. Мы рассмотрим некоторые из подходов, которые нашли широкое применение в экспериментальных исследованиях, в частности, для создания «ишемической толерантности» мозга.
Гипоксическое прекондиционирование
Хорошо известно, что адаптация к дефициту кислорода неспецифически повышает устойчивость организма к неблагоприятным воздействиям путем формирования компенсаторных реакций в ответ на умеренную экзогенную гипоксию [Проблемы гипоксии, 2004]. Еще в 70-х годах прошлого столетия отечественными исследователями был выявлен защитный эффект адаптации к гипоксии при развитии острых нарушений мозгового кровообращения [Агаджанян Н.А. и др., 1973]. Позднее было установлено, что даже кратковременная умеренная экзогенная гипоксия оказывает протекторное действие при острых нарушениях церебральной гемодинамики [Кошелев В.Б. и др., 1987].
Одним из видов гипокситерапии является барокамерная тренировка. Гипобарическая гипоксия обладает антиаритмическим эффектом при стрессе, инфаркте миокарда, постинфарктном кардиосклерозе, что объясняется активацией стресс-лимитирующих систем: опиатной, серотонинергической, антиоксидантной [Чижов А.Я., Потиевская В.И., 2002]. В экспериментальных работах на животных установлено протекторное влияние гипобарической гипоксии на головной мозг, опосредованное активацией генов раннего реагирования, антиоксидантной системы, регуляцией гипоталамо-гипофизарно-адреналовой оси [Samoilov М.О. et al., 2001; Stroev S.A. et al., 2004; Rybnikova E. et al., 2007]. Однако недостатком условий гипобарии является пониженная переносимость гипоксического воздействия, поэтому более перспективно применение газовых гипоксических смесей в нормобарических условиях.
Суть этого типа прекондиционирования заключается в том, что дыхание газовой смесью, умеренно обедненной по кислороду (8-11%), оказывает в последующем нейропротекторный эффект на переживающих срезах мозга и при ишемическом экспериментальном инсульте in vivo [Самойлов М.О. и др., 2001; Bernaudin М. et al., 2002]. Защитное действие нормобарической гипоксии связывают, главным образом, с активацией индуцируемого гипоксией фактора-1 (HIF-1), но в нем принимают участие и многие другие механизмы, которые будут описаны ниже [Sharp F.R. et al., 2004]. Во многих работах в качестве прекондиционирования используют непрерывную нормобарическую гипоксию в течение длительного времени [Bernaudin М. et al., 2002; Ran R. et ah, 2005]. Несмотря на то, что она достаточно эффективна в защите мозга от ишемического повреждения, отмечают преимущество интервальной гипокситерапии. Подчеркивается значение чередования гипоксических воздействий с нормоксическими интервалами, способствующими процессу восстановления [Колчинская А.З. и др., 1993]. Именно поэтому такой вид гипоксической тренировки находит широкое применение и в спорте, и в медицине [Чижов А.Я., Потиевская В.И., 2002]. Ишемическое прекондиционирование
Не только экзогенная гипоксия, но и циркуляторная, так называемое ишемическое прекондиционирование, оказывает нейропротекторное действие. Этот тип прекондиционирования подразумевает направленное воздействие на орган, который в дальнейшем подвергнется ишемии и представляет собой один или несколько кратковременных эпизодов ишемии/реперфузии [Власов Т.Д. и др., 2004]. Впервые этот феномен обнаружили в работе на сердце, в которой 5-минутные пережатия коронарной артерии, чередующиеся с реперфузией, оказывали кардиопротекторное действие, повышая устойчивость миоцитов к последующей летальной ишемии [Murry СЕ. et al., 1986].
Феномен «ишемической толерантности» мозга in vivo был впервые описан в начале 90-х годов прошлого столетия коллективом японских исследователей [Kitagawa К. et al., 1990]. В опытах на песчанках с незамкнутым виллизиевым кругом они обнаружили нейропротекторный эффект на нейроны гиппокампа двукратного двухминутного одновременного пережатия обеих общих сонных артерий, предшествующего более длительной глобальной ишемии мозга. При этом было отмечено, что защитным действием обладала отсроченная фаза прекондиционирования, эффект проявлялся при моделировании летальной ишемии не ранее, чем через 24 часа после прекондиционирования [Kitagawa К. et al., 1990; Kirino Т., 2002]. Позднее феномен «ишемической толерантности» был обнаружен не только на песчанках, но и на крысах и на мышах, а также не только в гиппокампе, но и в таламусе, базальных ганглиях и неокортексе [Kirino Т., 2002].
Одной из распространенных моделей ишемического прекондиционирования мозга является кратковременная окклюзия средней мозговой артерии. Было показано, что такой подход способен оказывать нейропротекторный эффект на головной мозг, подвергающийся впоследствии фокальной ишемии [Barone F.C. et al., 1998; Zhao J. etal., 2006].
Феномен ишемического прекондиционирования установлен и на людях. Существуют данные, демонстрирующие, что у пациентов, у которых наблюдались множественные транзиторные ишемические атаки, восстановление после инсульта происходило лучше, чем у тех, у кого предварительное временное нарушение мозгового кровообращения отсутствовало [Moncayo J. et al., 2000].
Уменьшение эксайтотоксичности глутамата
Практически сразу после ишемического стимула происходит высвобождение различных нейротрансмиттеров, среди которых особое внимание уделяется глутамату, обладающему цитотоксическим действием. Его избыточный выброс в очаге ишемии посредством активации NMDA-рецепторов вызывает входящий кальциевый ток, приводя к кальциевой перегрузке митохондрий и некротической гибели нейронов [Hossmann К.А., 2006]. В то же время для реализации защитного эффекта различных типов прекондиционирования требуется умеренная активация NMDA-рецепторов [Dimagl U. et al., 2003; Marini A.M. et al., 2007]. Она приводит к увеличению внутриклеточной концентрации ионов Са и фосфорилированию таких транскрипционных факторов, как. CREB и NF-кВї, ЧТО В СВОЮ очередь активирует синтез и высвобождение BDNF. Этот нейротрофический фактор обладает нейропротекторным действием, защищая нейроны от NMDA-рецептор-опосредованной эксайтотоксичности [Marini A.M. et al., 2007].
В недавнем исследовании на культуре корковых нейронов было установлено, что 30-минутное гипоксическое прекондиционирование увеличивало экспрессию 5-опиоидных рецепторов и вызывало нейропротекцию, препятствуя гибели нервных клеток под воздействием токсических доз глутамата [Zhang J. et al., 2006].
Одним из ключевых участников процесса прекондиционирования является оксид азота (N0). Однако окажет он токсическое или защитное действие зависит от уровня его продукции, локализации и состояния окружающей ткани. Так, гиперпродукция N0 в нейронах может приводить к образованию пероксинитрита и вызывать тяжелые повреждения нервной ткани при ишемическом инсульте [Hossmann К.А., 2006; Jung К.Н. et al., 2006]. В то же время умеренная активация системы NO во время прекондиционирования оказывает нейропротекторное действие, активируя ферменты антиоксидантной системы, запуская антиапоптотические механизмы, и вазодилататорный эффект, увеличивая уровень мозгового кровотока [Hossmann К.А., 2006; Manukhina Е.В. et al., 2006].
На модели гипоксического прекондиционирования у новорожденных крыс было показано, что защитный эффект зависит от активности эндотелиальной изоформы NO-синтазы (eNOS), но не индуцибельной, и нейрональной изоформ фермента, поскольку их блокирование не отменяло протекторного действия гипоксии [Gidday J.M. et al., 1999]. Однако на культуре корковых нейронов на модели кратковременной депривации кислорода и глюкозы участие нейрональной NO-синтазы было установлено [Nandagopal К. et al., 2001]. О первостепенной роли оксида азота в реализации защитных эффектов ишемического прекондиционирования свидетельствует тот факт, что у мышей, нокаутных как по нейрональной NO-синтазе, так и по ее эндотелиальной изоформе, защитный эффект прекондиционирования не наблюдался [Atochin D.N. et al., 2003].
Путь, через который NO реализует свои защитные свойства, в значительной степени изучен. Так, NO способен активировать мономерный растворимый G-белок Ras, причем для этого необходима умеренная стимуляция NMDA-рецепторов [Nandagopal К. et al., 2001]. Активация Ras оксидом азота происходит напрямую, путем нитрозилирования белка по цистеиновому остатку [Lander Н.М. et al., 1995]. При фармакологическом ингибировании Ras и у животных с доминантно-негативной мутацией по гену к этому белку протекторное действие NO во время прекондиционирования не проявлялось. Экспрессии конститутивно активной формы Ras достаточно для обеспечения защиты от летальной депривации кислорода и глюкозы [Nandagopal К. et al., 2001]. В свою очередь Ras как начальное звено способен активировать 2 каскада: РІЗК/Akt и Raf/Erk. Было показано, что первый из них (РІЗК/Akt) принимает участие в антиапоптотических механизмах, однако его блокирование не оказывало влияния на развитие толерантности, свидетельствуя о незначительной роли этого пути в реализации защитных эффектов ишемического прекондиционирования [Gonzalez-Zulueta М. et al., 2000].
Таким образом, протекторное действие NO опосредуется активацией Ras/Raf/Erk-каскада, приводящего к синтезу ростовых факторов, белков теплового шока, снижению экспрессии проапоптотических белков и, как следствие, к нейропротекции [Nandagopal К. et al., 2001; Kirino Т., 2002; Manukhina Е.В. et al., 2006].
Участие белков теплового шока
Развитие ишемической устойчивости в ответ на прекондиционирование может объясняться реакцией мозговой ткани на стресс. В ответ на умеренное повреждающее воздействие в клетках активируются факторы теплового шока (HSF, heat-shock factor), увеличивающие экспрессию генов различных белков теплового шока (Hsp). Такая реакция на стресс необходима для выживания клеток, поскольку предотвращает накопление белков, денатурированных в результате аноксии, оксидативного стресса и т.п. [Kirino Т., 2002].
Одним из членов семейства белков теплового шока является Hsp70, обладающий нейропротекторными свойствами. Увеличение его экспрессии наблюдается в ответ на хроническую гипоперфузию, аноксическое и гипоксическое прекондиционирование мозга [Ohtsuki Т. et al., 1993; Renshaw G.M. et al., 2004; Lu N. et al., 2007]. Ингибирование Hsp70 нивелирует протекторное действие прекондиционирования. В то же время некоторые исследования свидетельствуют об отсутствии необходимости его экспрессии для развития «ишемической толерантности» [Kobayashi S. et al., 1995; Abe H., Nowak T.S., 2000]. Тем не менее, принято считать, что Hsp70 вызывает устойчивость нейронов к повреждающим стимулам, если экспрессируется в достаточном количестве [Kirino Т., 2002].
Моделирование локального ишемического инсульта
Для моделирования ишемии головного мозга использовали модификацию методики, разработанной Chen et al. в 1986 году. Ишемическое повреждение, создавали окклюзией левой ветви средней мозговой артерии (ОСМА) и подходящей к ней вены (рис.4) с одновременной перевязкой ипсилатеральной сонной артерии для стабилизации объема поражения.
Операцию проводили под общей анестезией (хлоралгидрат, 400 мг/кг внутрибрюшинно). На шее животных по срединной линии! делали, надрез, отпрепаровывали левую сонную артерию и подводили под нее лигатуру. Трепанацию осуществляли на латеральной стороне лобной кости с левой стороны в зоне расположения центрального ствола средней мозговой артерии. Под бинокулярной лупой Olympus при помощи электрокоагуляции прибором «Фотек Е-80» проводили необратимую окклюзию левой ветви средней мозговой артерии проксимальнее места ее бифуркации на фронтальную и париетальную ветви, а таюке рядом расположенной мозговой вены до ее пересечения с артерией. Сразу после коагуляции перевязывали лигатуру, на которой находилась сонная артерия, поскольку лишь ОСМА не позволяет получить внутри группы область некроза, стабильную по своему размеру.
Место коагуляции сосудов было выбрано таким образом, чтобы поражение не затрагивало подкорковые структуры, а преимущественно локализовалось в лобно-теменной части коры.
Рисунок 4. Внешний вид поверхности мозга крысы до и после необратимой окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА) и расположенной рядом с ней мозговой вены. Стрелками указаны сосуды и места их коагуляции.
Методы оценки размера очага поражения коры головного мозга крыс
Размер области поражения коры головного мозга, полученной в результате необратимой ОСМА, определяли через 72 часа после операции, когда сформировался очаг некроза [Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001], при помощи одного из двух методов: гистохимического метода на выявление общей дегидрогеназной активности или магниторезонансной томографии (МРТ).
Гистохимический метод оценки размера очага поражения
Метод основан на выявлении общей дегидрогеназной активности в срезах ткани при помощи 2,3,5-трифенилтетразолий хлорида (ТТХ). Участки ткани мозга, сохраняющие жизнеспособные структуры, окрашиваются в красный цвет (продукт реакции - трифенилформазан), нежизнеспособные имеют бледную окраску или не окрашиваются (рис.5).
Экспериментальных животных декапитировали через 72 часа после ОСМА. Извлеченный мозг замораживали при -70С и скальпелем раскладывали на срезы толщиной 1,5-2 мм. Срезы мозга инкубировали в 1% растворе ТТХ (Sigma) в фосфатно-солевом буфере (рН=7,3-7,4) при температуре 37С в течение 30 минут.
Реакцию останавливали в течение 30 секунд в 10% растворе формалина, приготовленном на фосфатном буфере. Затем срезы распластывали между предметными стёклами и сканировали с обеих сторон на планшетном сканере при вертикальном и горизонтальном разрешении 600 dpi. Размер инфаркта измеряли планиметрически при помощи программы Аис7, оценивали процентное отношение суммы площадей поражённой ткани к сумме общей площади коры левого полушария мозга. Рисунок 5. Пример окрашенных 2,3,5-трифенилтетразолий хлоридом (ТТХ) срезов мозга, на которых производился подсчет размера области поражения. Оценка размера зоны инфаркта методом магниторезонансной томографии (МРТ)
Определение степени поражения коры головного мозга методом магниторезонансной томографии проводили с помощью ЯМР спектрометра BioSpec 70/30 USR (Bruker), напряженность магнитного поля в котором составляет 7 Тесла, что соответствует резонансной частоте протонов 300 МГц. Метод основан на том, что под влиянием сильного магнитного поля, создаваемого в приборе для МРТ, атомы и молекулы организма (в данном случае протоны) приходят в движение, выстраиваясь вдоль линий внешнего магнитного поля, а после прекращения воздействия возвращаются в свое обычное состояние. Это вызывает резонансное поглощение излучения с энергией квантов, равной величине расщепления энергетических уровней, сопровождающего этот процесс. Сигналы эти разные по характеру и силе в различных органах. Компьютер улавливает их и преобразует в изображения. МРТ позволяет отследить изменения активности отдельных областей мозга (в основном по изменению интенсивности кровоснабжения) непосредственно в ходе опыта.
Рисунок 6. Пример изображения для оценки размера области поражения, полученного методом магниторезонансной томографии (МРТ). Животных, находящихся под общей анестезией (хлоралгидрат, 400 мг/кг в/б), помещали в прибор. Для получения изображения использовали два режима. Первый из них tripilot предназначен для быстрого измерения объекта и получения первоначального изображения, которое используется в качестве ориентира при установке геометрических параметров срезов последующих измерений. Он основан на быстром томографическом методе градиентного эха FLASH. Основное изображение (рис.6) получали, используя режим, основанный на томографическом быстром методе спинового эха RARE (период повторения сканов (TR) = 2113,5 мс, эффективное время эха (Eff.TE) = 50,0 мс). В результате измерения с мозга крысы получали 14 срезов толщиной 1,5 мм, их периодичность составляла 2 мм. Подсчет размера области поражения осуществляли в программе ImageJ. Как и в первом случае, оценивали процентное отношение суммы площадей поражённой ткани к сумме общей площади коры левого полушария мозга.
Оценка размера области поражения коры левого полушария мозга
На этапе изучения роли АТФ-зависимых К+-каналов в защитном эффекте ишемического прекондиционирования размер зоны некроза коры головного мозга, оцененный через 72 часа после моделирования инсульта, составил в группе ОСМА (п=10) 15,0+2,4% от общего объема коры левого полушария (рис. 18).
Кратковременная попеременная окклюзия сонных артерий за 24 часа до моделирования фокальной ишемии значимо снизила (р 0,01) значение этого параметра до 8,2+3,9% (п=9) по сравнению с группой ОСМА (рис.18), подтверждая протекторный эффект отсроченной фазы ИП.
Защитное действие ишемии-реперфузии сонных артерий на головной мозг перенесших инсульт крыс было нивелировано блокадой АТФ-зависимых К+-каналов посредством введения 5-HD или Glib (р 0,01). Область поражения в группах ИП+5-HD (п=11) и ИП+Glib (п=11) составила 15,7+4,0% и 13,1+2,5% соответственно (рис.18). От результата, полученного в группе ОСМА, эти показатели не отличались. В группе ИП+инсулин (п=7) сформировалась зона инфаркта размером 12,0+3,2% от общего объема коры левого полушария. Полученное значение размера области поражения значимо выше (р 0,05), чем в группе ИП, и меньше (р 0,05), чем у крыс из группы ОСМА (рис.18), что указывает лишь на частичную отмену защитного эффекта прекондиционирования.
Оценка нейроглиального показателя в трифокальной области очага поражения левого полушария мозга
Морфологические изменения, наблюдаемые на границе сформированного к 21 суткам после инсульта глиального рубца (рис.21), в этой серии эксперимента имеют ту же направленность, что и в предыдущей. Нейроглиальный показатель в области пятого слоя коры в группе интактных животных составил 0,9+0,08 глиальных клеток на один нейрон (рис.19). Фокальная ишемия привела к его значимому увеличению (р 0,01) до 1,8+0,3 глиальных клеток на нейрон (рис.19).
Предварительная ишемия-реперфузия сонных артерий уменьшила нейроглиальное соотношение в 1,3 раза по сравнению с группой ОСМА (р 0,01). Оно составило 1,4+0,3 глиальные клетки на один нейрон в группе ИП (рис.19). Однако, как и в первой серии, это больше, чем у интактных животных (р 0,01).
Использование блокаторов АТФ-зависимых К+-каналов привело к значимому увеличению (р 0,01) нейроглиального показателя в группах ИП+5-HD и ИП+Glib по сравнению с группой ИП до 1,8+0,3 и 2,3+0,5 глиальные клетки на один нейрон соответственно (рис.19), т.е. нивелировало нейропротекторный эффект ишемического прекондиционирования, возвращая величину нейроглиального соотношения к значениям, характерным для группы ОСМА. Инъекция инсулина также повысила этот параметр по сравнению с группой ИП (р 0,01) до 1,6+0,2 глиальные клетки на нейрон, но снизила (р 0,05) его по сравнению с крысами из группы ОСМА (рис.19).
Наблюдаемые изменения в значениях нейроглиального показателя объясняются теми же причинами, что и в серии с использованием в качестве прекондиционирования нормобарической гипоксии. Как было описано выше, в результате моделирования инсульта количество нейронов уменьшилось по сравнению с группой интактных животных в 1,4 раза - с 58,8+5,3 до 41,6+11,0 клетки (р 0,01), а количество нейроглии увеличилось в 1,4 раза - с 54,3+7,2 до 74,7+20,5 клеток (р 0,05) (рис.20). Предварительная ишемия-реперфузия сонных артерий способствует большей сохранности нейронов в перифокальной зоне очага поражения по сравнению с группой ОСМА. Их количество составило 58,2+12,3 клеток и превысило значение, полученное в группе ОСМА, в 1,4 раза (р 0,01), при этом отличий от интактного контроля не наблюдали (рис.20). Число нейроглиальных клеток на границе глиального рубца в группе ИП по сравнению с группой ОСМА не изменилось, оно было равно 78,5+17,0 клеток (рис.20).
