Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Механизмы повреждения нейронов при ишемическом инсульте 12
Нарушение мозгового кровообращения и повреждение нейронов 12
Глутаматная эксайтотоксичность, роль ионов кальция в гибели клеток 15
Некротические и апоптотические процессы при ишемии головного мозга 21
Ацидоз 28
Окислительный стресс 33
Механизмы клеточной защиты от АФК и АФА в нервной ткани 40
Глава 2. Фармакологическая коррекция последствий ишемии головного мозга 44
Фармакологическая защита нейронов от деструктивного действия глутамата 44
Нейропептиды 50
Защита мозга от окислительного стресса 53
Глава 3. Модели экспериментальной ишемии головного мозга 61
Вид животных и их физиологическое состояние 61
Выбор модели 63
Модели, не требующие краниотомии 64
Эмболическая модель 64
Модель перекрытия средней мозговой артерии нитью 66
Модель фототромбоза 68 Инсульт, вызванный эндотелином -1 69
Модели, включающие краниотомию 70
Источники вариабельности 72
Факторы, связанные с видом животного 72
Факторы, связанные с видом модели 74
Анестезия 74
Глава 4. Поведенческие тесты для оценки неврологического дефицита после ишемии головного мозга 75
Сенсомоторные тесты 76
Когнитивные тесты 79
Материалы и методы исследования 80
Операция перекрытия средней мозговой артерии нитью 80
Окраска срезов мозга 2,3,5-трифенилтетразолия хлоридом 81
Магнитно-резонансная томография 82
Определение объема инфаркта 83
Изучаемые вещества 84
Тест «Цилиндр» 85
Тест «Стимулирования конечностей» 86
Тест «Сужающаяся дорожка» 87
Приготовление гомогенатов ткани 88
Определение концентрации белка 89
Вестерн-блоттинг 89
Статистическая обработка данных 91
Результаты 92
Часть 1. Моделирование фокальной ишемии головного мозга крысы перекрытием средней мозговой артерии нитью 92
1.1 Исследование формирования ишемического очага с помощью метода МРТ и окраской ТТС с анализом моторного дефицита в передних конечностях крыс 92
1.2 Исследование динамики формирования ишемического очага методом МРТ 97
Часть 2. Неиропротекторная коррекция последствий ишемии головного мозга 109
2.1 Исследование нейропротекторной активности ионов лития 109
2.2 Исследование нейропротекторной активности пептида ГК-2 112
2.3 Исследование нейропротекторной активности пептида PGP 121
2.4 Исследование нейропротекторной активности митохондриально направленных антиоксидантов 126
Обсуждение результатов исследования 144
Выводы 160
Список литературы
- Глутаматная эксайтотоксичность, роль ионов кальция в гибели клеток
- Модель фототромбоза 68 Инсульт, вызванный эндотелином
- Когнитивные тесты
- Определение объема инфаркта
Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди современных медико-социальных проблем инсульт занимает одно из ведущих мест. Рост числа инсультов головного мозга среди трудоспособного населения нашей страны является на данный момент одним из самых острых вопросов отечественного здравоохранения. В настоящее время в России инсульт ежегодно переносят свыше 450 тыс. человек. Среди причин смерти он занимает второе место. Показатели заболеваемости и смертности от инсульта среди лиц трудоспособного возраста в России увеличились за последние 10 лет более чем на 30%. Ранняя 30-дневная летальность после инсульта составляет 34,6%, а в течение года умирает примерно половина заболевших, что составляет более 200 тыс. человек (Гусев и др., 2007; Виленский и Яхно, 2006).
Однако на сегодняшний день все имеющиеся нейропротекторные препараты, испытанные в мультифокальных клинических исследованиях, недостаточно эффективны (Rother, 2008). Поэтому разработка новых подходов к терапии и профилактике инсульта является острейшей задачей медицины.
Так как в процессе ишемического повреждения мозга задействовано несколько различных патологических механизмов, то очевидно, что нейропротективная терапия должна быть направлена на различные мишени, принимающие участие в патологических процессах. Поэтому нами было выбрано три различных направления для нейропротекторной защиты: ингибиторы апоптоза, митохондриально-адресованные антиоксидант и регуляторные пептиды.
Целью данной работы было исследование динамики ишемического инфаркта у крыс на модели перекрытия средней мозговой артерии (СМА) с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ), а также изучения возможности коррекции нарушений, вызванных ишемией, при использовании новых фармакологических препаратов.
Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:
Исследовать динамику формирования фокального очага ишемического повреждения на модели перекрытия СМА с помощью метода МРТ.
Исследовать влияние внутрибрюшинного введения хлорида лития после индукции ишемии головного мозга на развитие ишемического очага и неврологического дефицита.
Изучить нейропротекторные свойства пептидов ГК-2 и PGP на модели фокальной ишемии головного мозга.
4. Оценить влияние митохондриально-адресованных антиоксидантов семейства SkQ на
развитие ишемического очага и неврологического дефицита.
Научная новизна и практическая значимость. В данной диссертационной работе впервые осуществлен широкий комплексный подход к исследованию процесса формирования ишемического повреждения головного мозга крыс с использованием метода МРТ и выполнен сравнительный анализ двух методов оценки области повреждения (МРТ и ТТС-окрашивание) в сопоставлении с данными об уровне неврологического дефицита, оцененного в поведенческих тестах.
Установлены сроки формирования ишемического очага в модели перекрытия СМА нитью. Проведен последовательный анализ на всех стадиях процесса формирования ишемического очага с использованием MP-изображений, начиная с первых минут ишемии и заканчивая двухнедельным сроком.
Впервые на модели фокальной ишемии мозга, вызванной перекрытием СМА, выявлено нейропротекторное действие пептидов PGP и ГК-2. Данные пептиды уменьшали развитие ишемического нейродеструктивного процесса и способствовали снижению неврологического дефицита в постишемическом периоде.
В исследовании влияния митохондриально-адресованных антиоксидантов семейства SkQ (SkQl, SkQRl и SkQRB) впервые показано, что SkQRl очень эффективно защищает ткань мозга от ишемии, снижает неврологический дефицит при введении до или после индукции ишемии методом перекрытия СМА. Также выявлены некоторые молекулярные механизмы защитного действия SkQRl.
Таким образом, полученные нами данные, а также примененные в исследованиях оригинальные методические разработки имеют важное научно-практическое значение для расширения существующих представлений о патоморфологических и патофизиологических процессах, происходящих в очаге ишемического повреждения головного мозга. Результаты исследования позволяют рекомендовать пептиды PGP и ГК-2, а также митохондриально-адресованный антиоксидант SkQRl для дальнейших доклинических испытаний с целью выявления наиболее эффективных доз, способов и сроков введения препаратов.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Перекрытие средней мозговой артерии вызывает образование инфаркта в области
коры, включая сенсомоторную область, и стриатума, что сопровождается стойким
нарушением сенсомоторных функций мозга. При этом процесс образования
инфаркта имеет динамический характер и его основное формирование у крыс происходит к 24-м часам после индукции ишемии.
Ионы лития, пептиды PGP и ГК-2 предотвращают негативные последствия ишемии головного мозга, снижая объем инфаркта и выраженность неврологического дефицита.
Митохондриально-адресованные антиоксидант семейства SkQ уменьшают объем ишемического повреждения и снижают неврологический дефицит.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на Kuopio Stroke Symposium 2007 (Куопио, Финляндия, 2007); III Российском симпозиуме "Белки и пептиды" (Пущино, 2007); XY Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008); Конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008); International Multidisciplinary Symposium "From experimental biology to preventive and integrative medicine" (Судак, Украина, 2008); открытом семинаре отдела биоэнергетики Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ (Москва, 2009) и на заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ (Москва, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в ведущих рецензируемых журналах и 5 тезисов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 206 страницах, содержит 48 рисунков и 1 таблицу. Список литературы включает 465 источников.
Глутаматная эксайтотоксичность, роль ионов кальция в гибели клеток
Помимо ионотроных глутаматных рецепторов, активное участие в патологических каскадах принимают метаботропные глутаматные рецепторы. Действие метаботропных рецепторов опосредовано G-белками, активация которых приводит к запуску или остановке каскадов вторичных мессенджеров. В мозге млекопитающих выделяют, по крайней мере, восемь различных типов рецепторов, разделенных на 3 группы (Schoepp et al., 1999). Рецепторы I группы (mGlui и mGlu5) активируют фосфолипазу С. Действие рецепторов группы II и III связано через субъединицу G,/0, которая ингибирует аденилатциклазу. Считается, что за клеточную гибель главным образом ответственны рецепторы I группы, а именно mGhi! (Pellegrini-Giampietro, 2003). Применение ингибиторов mGlu! приводило к снижению клеточной гибели в культуре клеток или к уменьшению объема ишемического повреждения в моделях in vivo (Meli et al., 2002; Moroni et al., 2002; Rauca et al., 1998; Moroni et al., 2002; Rauca et al., 1998). Активация фосфолипазы С рецепторами группы I приводит к гидролизу мембранных липидов с образованием двух молекул: инозитол-1,4,5-трифосфата (1Рз) и диацилглицерола. ГРз вызывает высвобождение кальция из эндоплазматического ретикулума, усугубляя Са2+ перегрузку нейрона (Berridge, 1998).
Концентрация свободного Са в цитоплазме нейрона, находящегося в состоянии покоя, составляет около 0,1 мкМ. После активации глутаматных рецепторов нейронов концентрация этого иона может достигать 8-16 мкМ (Brustovetsky and Dubinsky, 2000). Регуляция внутриклеточного кальция осуществляется следующими механизмами: поступлением внеклеточного Са2+ через лиганд-связанные рецепторы и потенциалзависимые Са2+ каналы; выходом Са из эндоплазматического ретикулума, опосредованного инозитол трифосфатом или из митохондрий через Na /Са обменник; выходом Са через Са2+-АТФазу или Na+/Ca2+ обменник в цитоплазматической мембране; связыванием Са2+ с белками-мишенями; депонирование Са2+ в эндоплазматическом ретикулуме с помощью Са2+-АТФазы или в митохондрии электрогенным транспортом (Gill et al., 1989; Gunter and Pfeiffer, 1990; Carafoli, 1991).
Несмотря на эффективное применение антагонистов кальциевых каналов в экспериментах in vitro и in vivo, проведенные клинические испытания не выявили их эффективности, что вызвало активное изучение ряда других механизмов проникновения Са"+ в клетку (Besancon et al., 2008). Кроме глутаматных рецепторов, поступление Са2+ и накопление его в клетке может происходить в результате вовлечения следующих механизмов: во-первых, через активированные каналы, проницаемые для ионов Са2+ и через поврежденную мембрану; во-вторых, вследствие нарушения удаления его из клеток в результате ослабления работы кальциевого насоса при энергетическом дефиците; в-третьих, посредством изменения направленности работы Na /Са -обменника. Рассмотрим эти механизмы подробнее.
Na+ /Са2+-обменник NCX (Na+ /Са2+ exchange) является белком, широко экспрессирующимся в мозге. Используя энергию концентрационного градиента ионов натрия, NCX производит перенос иона кальция из клетки и трех ионов натрия в клетку за один цикл. Однако может происходить реверсия направления работы NCX, возможность наступления которой регулируется изменением ионных градиентов Na и Са , внутриклеточным рН и АТФ (Jeffs et al., 2007). Данные о роли NCX при ишемии головного мозга являются противоречивыми. Пигнатаро с коллегами показал, что различные ингибиторы NCX увеличивали объем инфаркта в модели перманентного перекрытия СМА, тогда как активатор уменьшал объем повреждения (Pignataro et al., 2004). Однако, имеется работа, противоречащая выше1 изложенным данным, в которой селективный ингибитор
NCX уменьшал ишемическое повреждение (Matsuda et al., 2001). Эти противоречия в результатах можно объяснить разностью ответа NCX в зависимости от тяжести ишемического повреждения. В той области мозга, где ишемическое повреждение достаточно мягкое с сохранением функции Na+/K+-АТФазы, NCX работает прямо, а его ингибирование снижает выброс кальция из клетки, тем самым увеличивая нейрональную гибель. В противоположность этому, в области с сильным ишемическим повреждением с неактивной Na+/K+-АТФазой происходит реверсия направления работы NCX, соответственно ингибирование обменника вызывает нейропротекторный эффект (Besancon et al., 2008).
Помимо выше перечисленных механизмов поступления Са2+ в клетку, существуют и другие недавно открытые цитоплазматические ионные каналы, которые могут принимать участие в деполяризации нейронов и накопления внутриклеточного Са2+ во время ишемии. Это щелевые контакты (Farahani et al., 2005; de Pina-Benabou et al, 2005), объем-зависимые анионные каналы (Volume-regulated anion channels) (Kimelberg, 2005; Liu et al., 2006), transient receptor potential channels (Simard et al., 2007), а также кислоточувствительные ионные каналы (ASICs) (см. ниже). Однако, роль перечисленных каналов в ишемическом повреждении является пока недостаточно изученной и требует дальнейших исследований, включая поиск фармакологических антагонистов.
Однозначно можно сделать вывод, что нарушение энергетического метаболизма в результате ишемии приводит к накоплению внутриклеточного свободного Са" (Са перегрузка) в результате увеличения поступления и нарушения оттока Са2+ . из клетки. Продолжительное повышение уровня внутриклеточного Са2+ ведет к активации катаболических процессов и необратимой гибели нейронов через различные механизмы, сводящиеся к активации Са" -зависимых эффекторных белков.
Модель фототромбоза 68 Инсульт, вызванный эндотелином
В последние годы идет активное изучение нового класса антиоксидантов - митохондриально-адресованных. Разработка этого подхода основана на представлении, что митохондрия является основным местом, где образуется наибольшее количество АФК. Непосредственная и быстрая доставка антиоксиданта в митохондрию должна защищать ее от перекисного окисления липидов, окислительного повреждения белков дыхательной цепи и митохондриальную ДНК. Адресная доставка антиоксиданта в митохондрию осуществляется за счет конъюгации последнего с катионом, являющимся гидрофобной молекулой, обладающей делокализованным положительным зарядом. Катион, являясь «локомотивом», протаскивает антиоксидант через митохондриальные мембраны в отрицательно заряженный матрикс митохондрии (рис. 5).
Группой Мёрфи М.П. было синтезировано несколько митохондриально-адресованных антиоксидантов. Данные вещества представляют собой убихинон (убихинол в восстановленной форме), соединенный с трифенилфосфонием через С-10 линкерную группу - MitoQ и его варианты MitoQ5, MitoQ3 (С-5, С-3 соответственно) (Kelso et al., 2001). Данные антиоксиданты являются возобновляемыми, окисленная форма убихинона, возникающая в результате его антиоксидантной активности, может восстанавливаться до исходного состояния с помощью дыхательной цепи митохондрии.
Было показано, что MitoQ накапливается в энергизованных митохондриях за счет энергии трансмембранного митохондриального потенциала; он предотвращает окисление митохондриальньгх липидов радикалами ОН in vitro; увеличивает выживаемость клеток, гиперчувствительных к АФК, при концентрациях намного более низких, чем CoQ или а-токоферол; увеличивает продолжительность жизни фибробластов в культуре при повышенном содержании кислорода (Tauskela, 2007). Однако, в экспериментах на модели ишемии/гипоксии крысят применение MitoQ в концентрациях 17 или 51 мкМ не дало положительного результата (Hobbs et al., 2008).
Скулачевым В.П. и коллегами в институте Физико-химической Биологии им. А.Н. Белозерского МГУ была разработана группа митохондриально-направленных антиоксидантов на основе пластохинона, которые получили общее название SkQ, где «Sk» - проникающий катион («Скулачев-ион»), a Q-хинон (рис. 5) (Skulachev, 2007; Antonenko et al., 2008a).
На различных модельных системах было показано, что SkQl и SkQRl способны проникать через плоские бислойные мембраны, электрофоретически накапливаться в митохондриях с высокой избирательностью и восстанавливать дыхательную цепь (Antonenko et al., 2008b; Rokitskaya et al., 2008).
В исследованиях ex vivo по хроническому скармливанию SkQl в дозе 0,02 нмоль/кг в течение трех недель уменьшалась сердечная аритмия, вызванная перфузией изолированного сердца крысы раствором Н202 или ишемией/реперфузией. Применение более высокой дозы SkQl 125-250 нмоль/кг по той же схеме уменьшало размер инфарктной зоны, вызванной ишемией/реперфузии сердца in vivo. На модели ишемии/реперфузии почки однократная инъекция SkQl и SkQRl в дозе 1 мкмоль/кг за сутки до ишемии приводило к значительному повышению выживаемости животных по сравнению с контрольной группой. Но, в отличие от SkQl, применение SkQRl сопровождалось уменьшением АФК в клетках почек, нормализацией креатинина в крови. Также, на модели компрессионной ишемии мозга SkQRl при однократном введении в дозе 1 мкмоль/кг за день до операции уменьшал размер ишемического очага мозга (Bakeeva et al., 2008).
Заслуживает внимания рассмотрение митохондриально-адресованных пептидных антиоксидантов — пептида SS-31 и SS-20, которые представляют собой D-Arg-2 ,6 -dimethylyrosine-Lys-Phe-NH2 и Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2, соответственно. Эти небольшие пептиды способны проникать внутрь клетки и во внутреннюю мембрану митохондрии благодаря своему положительному заряду. С помощью конфокальной микроскопии на культуре клеток была показана колокализация флуоресцирующего аналога пептида SS-19 с митотрекером TMRE, а также возможность проникновения пептида внутрь митохондрий была подтверждена с помощью инкубации меченого тритием пептида с. выделенными митохондриями, уже через 2 минуты митохондрии содержали в 100 раз больше пептида. На разобщенных митохондриях с помощью FCCP было, показано, что деэнергизация только на 20% снижает внутримитохондриальное содержание SS-31 или SS-20. Эти данные подтверждают, что основная масса пептида содержится во внутренней мембране митохондрий, и только 20% пептида доставляется в матрикс за счет энергии трансмембранного митохондриального потенциала (Thomas et al., 2007; Zhao et al., 2005).
Пептид SS-31 был исследован на мышах линии G93A, моделирующих заболевание бокового амиотрофического склероза. Ежедневные интраперитонеальные инъекции пептида в дозе 5 мг/кг, начиная с 30-дневного возраста, приводили к значительному улучшению выживаемости мышей и двигательной активности (Petri et al., 2006). В модели ишемии/реперфузии головного мозга путем перекрытия СМА введение пептида SS-31 мышам сразу после начала реперфузии приводило к уменьшению объема ишемического очага и сохранению уровня глутатиона (Cho et al., 2007).
Когнитивные тесты
Поведенческие тесты
Тестирование всех животных проводили за 1 сутки до индукции ишемии для выявления наличия базового уровня неврологического дефицита, а также после операции в соответсвиии с протоколом эксперимента (см. результаты).
Тест «Цилиндр»
В тесте "Цилиндр" оценивается асимметрия использования животным передних конечностей в течение спонтанного исследования стенок цилиндра. (Schallert et al., 2000). Для тестирования крысу помещали в прозрачный цилиндр высотой 30см и диаметром 20см и проводили видеорегистрацию движений животного в течение 8-10 мин. Видеозапись проводилась видеокамерой, направленной в зеркало, расположенное под углом 45 градусов позади цилиндра. Просмотр видеозаписи для анализа поведенческих актов проводился в покадровом воспроизведении. Подсчитывали количество независимого использования поврежденной и неповрежденной передних конечностей во время исследования стенки цилиндра после подъема на задние лапы, а также одновременное (совместное) использование обеих лап. Использование передней конечности (левой или правой) учитывали в течение первого контакта со стенкой цилиндра и в течение латерального исследования стенки. После отрыва передних конечностей от пола и размещения конечности на стенке цилиндра с переносом центра тяжести на эту конечность данное движение оценивали как независимое использование этой конечности. Как одновременное перемещение двух передних конечностей считали такие факты, как: если животное размещало обе конечности одновременно на стену цилиндра; если после независимого размещения одной лапы размещалась вторая лапа, причем первая сохраняла свою позицию; если крыса исследовала стену латерально, попеременно переставляя лапы; если одна лапа оставалась неподвижной, а другая совершала несколько перемещений. Новый подсчет начинали только после того, как крыса убирала обе конечности с поверхности цилиндра. Данные представляли как процент использования для каждой передней конечности и их одновременного использования от общего числа поведенческих актов. Также рассчитывали частоту использования поврежденной конечности по формуле: (контр+1/2 одновр)/(ипси+одновр+контр) 100, где контр - контралатеральная конечность (поврежденная), одновр — одновременное использование передних конечностей, ипси — ипсилатеральная конечность.
Тест «Стимулирования конечностей»
Мы использовали модифицированную версию теста «Стимулирования конечностей» (De Ryck et al., 1989) для оценки сенсеромоторного восстановления конечностей крысы (Jolkkonen et al., 2000). Тест заключается в ответе задних и передних конечностей на тактильную и проприоцептивную стимуляцию. До начала эксперимента крысы были приучены к рукам. Тест состоял из семи различных испытаний для левой и правой стороны тела: 1) Крысу передними конечностями размещали на край стола, придерживая туловище животного. Каждую переднюю лапу поочередно аккуратно сталкивали с края стола, контролируя ее возвращение и размещение. В норме крыса сразу же возвращала свою конечность на место. 2) Выполнялось так же, как первое испытание, но за некоторым исключением. Голову крысы отводили вверх под углом 45 градусов, таким образом не давая ей возможность видеть поверхность стола или контактировать с ней вибриссами. 3) Крысу размещали параллельно краю стола и переднюю лапу отводили вбок. В норме крыса сразу же возвращала свою конечность на место. 4) Так,же как в 3-м испытании, но только для задней конечности. 5) Крысу задом ставили на край стола и каждую заднюю лапу поочередно отводили вниз. 6) Крысу размешали передними лапами у края стола и аккуратно подталкивали за туловище по направлению к краю стола. В норме крыса сопротивлялась толканию, перебирая и упираясь передними лапами, но у крыс с ишемией мозга поврежденная конечность соскальзывала. 7) Крысу держали за корень хвоста и медленно опускали на поверхность стола. В норме крыса вытягивала вперед передние конечности за 10 см до поверхности стола.
Для оценки нарушений в работе конечностей использовали следующую систему подсчета: 2 балла - крыса полностью выполняла испытание; 1 балл -крыса выполняла испытание с задержкой в более чем 2 сек и/или не полностью; 0 баллов - крыса не отвечала на стимулирование конечности. Максимально возможное суммарное количество баллов равно 14 для каждой стороны тела.
Тест «Сужающаяся дорожка» (Beam-walking test)
Тест «Сужающаяся дорожка» использовался для оценки сенсомоторной функции передних и задних конечностей в координации и интеграции во время движения животного по сужающейся доске (Schallert et al., 2002). Крыс обучали в течение трех дней пересекать «сужающуюся дорожку» перед индукцией ишемии. Животных тестировали на 7-й день после ишемии. Установка теста «Сужающаяся дорожка» (рис. 7) представляет собой две сужающиеся доски длиной 165 см и расположенные друг под другом, причем нижняя имеет борта для расположения конечностей животного во время соскальзывания с верхней доски. В конце установки располагалась черная коробка, являющаяся конечной целью перемещения животного. Точка старта освещалась ярким светом, мотивируя крыс бежать к концу доски в черную коробку. Движение крыс записывалось на видеокамеру. Анализ видео производили в покадровом режиме, подсчитывая количество соскальзываний с верхней доски на нижнюю и общее количество шагов для каждой конечности отдельно для контралатеральной стороны тела по отношению к полушарию головного мозга с ишемическим повреждением. Количество соскальзываний рассчитывали по формуле:
Определение объема инфаркта
Вопросы терапии острой фокальной ишемии головного мозга на сегодняшний день остаются до конца не решенными. Современная медицина обладает достаточно бедным набором фармакологических препаратов, направленных на предотвращение развития патологических каскадов во время ишемии головного мозга. Несмотря на большое количество проведенных клинических испытаний неііропротекторньїх препаратов, эффективность была доказана только для единиц. И насущной проблемой современной медицины и фармакологии является разработка новых антиишемических препаратов и адекватных моделей для их оценки. Поэтому основной задачей данной работы являлась отработка модели ишемии головного мозга с возможностью оценки биохимических, морфологических и функциональных последствий фокального ишемического повреждения головного мозга, а также исследование новых фармакологических препаратов, направленных на прерывание различных патологических процессов.
Одностороннее виутрпсосудистое перекрытие ветви средней мозговой артерии как модель ишемии головного мозга
Несмотря на то, что механизмы ишемического повреждения головного мозга в настоящее время интенсивно исследуются, проблема ишемического повреждения головного мозі а, а также фармакологической коррекции данной патологии продолжает являться в настоящее время одной из основных проблем экспериментальной и клинической неврологии, нейрохирургии, что требует создания адекватных моделей для исследования ишемии. Основные требования, предъявляемые к этим моделям, заключаются в том, чтобы очаг ишемического повреждения был стапдаршым по объему и локализации, а также легко воспроизводился из эксперимента в эксперимент. Следует отметить, что экспериментальные модели глобальной ишемии (перевязка, клипирование магистральных сосудов) не совсем соответствуют клиническим формам ишемического повреждения головного мозга, поэтому в настоящее время при выборе экспериментального метода более часто используют модели фокальной ишемии, воспроизводящие очаги локального повреждения. Большая часть зарубежных исследовании фокальной ишемии проводится на моделях одностороннего внутрисосудистого перекрытия ветви средней мозговой артерии с помощью капроновой нити, которая вводится через a. carotis communis до места отхождепия a. cerebri media от a.carotis interna (Longa et al., 1989; Hunter et al., 1995). Эпп меіод индукции фокальной ишемии в бассейне СМА позволяет получить стандартный по размерам и локализации очаг ишемического некроза. Вместе с тем, используемая модель дает возможность экспериментального обоснования способов фармакологической коррекции ишемического повреждения головного мозга. В связи с вышесказанным метод индукции фокальной ишемии в бассейне СМА широко применяется при исследовании различных фармакологических препаратов, обладающих неиропротекторными своисівами и предназначенных для стимуляции регенераторных процессов в пшемическом очаге (Kapinya et al., 2002; Prass et al., 2006). Таким образом, выбор экспериментальной модели ишемии головного мозга путем перекрытия средней мозговой артерии нитью был обусловлен выше приведенными аргументам 11.
. Нами была отработана модель воспроизведения фокального ишемического повреждения в бассейне средней мозговой артерии путем перекрытия кровотока в иен с помощью нити. Показана возможность успешного применения этой модели, позволившей воспроизводить из опыта в опыт постоянный по локализации и объему очаг ишемического повреждения в областях коры и подкорковых структурах головного мозга. Использование этой модели ишемии позволило провести комплексное исследование морфологических и функциональных последствий фокального ишемического повреждения головного мозга, оценить нейропротекторные свойства фармакологических препаратов, используемых для коррекции возникших нарушений деятельности ЦНС. ,
Магнитно-резонансная томография как метод исследования механизмов развития повреждения головного мозга при экспериментальной фокальной ишемии
Обычно оценку ишемических повреждений в модели перекрытия средней мозговой артерии производят по серийным срезам головного мозга, окрашенным 2,3,5-трифенилтетразолием хлоридом. Этот метод основан на восстановлении дегидрогеназами митохондрий красителя, в результате здоровая ткань окрашивается до розового цвета, а некротическая остается белой. Но применение этого метода накладывает ряд ограничений, связанных со значительными затратами времени и материальных ресурсов, а также необходимостью использования токсических агентов, опасных для здоровья человека и окружающей среды. В- .последние годы для исследования экспериментальной ишемии стали использовать магнитно-резонансную томографию, которая обладает целым рядом преимуществ перед гистологическим методом: неинвазивность, возможность исследования динамики процесса, быстрота оценки повреждений (van der Zijden et al., 2008; Chandra et al, ,1999; Lenhard et al., 2008). Однако в связи с относительно недавним началом использования метода MPT в экспериментальной ишемии головного; .мозга в настоящее время требуется детальное сравнение морфометрических результатов, полученных с помощью MPT,. с данными, полученными рутинными гистологическими; методами при параллельном сопоставлении с; поведенческими тестами, оценивающими неврологический дефицит у животных. К сожалению, работы, посвященные этому вопросу, единичны, а полученные в них данные фрагментарны. В связи с вышесказанным, в настоящей работе, используя модель одностороннего внутрисосудистого перекрытия ветви средней мозговой артерии, мы провели сопоставление результатов по оценке объемов очагов повреждения, полученных с помощью Т2-взвешенных МРТ изображений, и окрашенных ТТС срезов. Выраженность неврологического дефицита оценивали в поведенческих тестах. Таким образом, как полученные в поведенческих тестах результаты о неврологическом дефиците у ишемизированных животных, так и данные, полученные с использованием ТТС, соответствовали морфологическим данным о степени повреждения головного мозга, полученным при помощи МРТ. Хотя данные по объему инфаркта, полученные двумя методами, точно не совпали, они были близки по абсолютным значениям. Эти отклонения можно объяснить тем, что применяемые нами методы обладают разной степенью точности в определении объема инфаркта. Так, для ТТС-окраски срезы делаются из нативного охлажденного мозга, который в местах ишемического повреждения имеет текучую консистенцию в результате протеолитических процессов, вызываемых макрофагами. Срезы получаются деформированные и растянутые в области повреждения. Далее, после окраски срезы фиксируются в формалине, который оказывает дополнительное воздействие, уплотняя и сжимая их. Таким образом, после проведенных процедур полученные срезы перестают отражать истинную площадь повреждения. В свою очередь, MP-изображения строятся, исходя из линейных размеров мозга, не претерпевая каких-либо искажений. Однако необходимо учитывать, что область с гиперинтенсивным сигналом, измеряемая на Т2-взвешенных изображениях, и принимаемая как некротическая, в первую очередь отражает содержание воды в этой зоне (Hoehn-Berlage et al., 1995). В исследованиях, проведенных различными авторами, .было показано наличие корреляции между объемом инфаркта, измеренного на Т2-взвешенных магнитно-резонансных изображениях и на ТТС-изображениях, что подтверждает полученные нами данные (Li et al., 2000;
