Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
1. Виды памяти и их функционально-анатомические основы 8
2. Экспериментальные модели эпилепсии и нарушения памяти у животных, вызванные судорожной активностью мозга 20
3. Роль липидов и липидных мессенджеров в нормальном и патологическом функционировании мозга 37
Постановка цели и задач исследования 49
Материалы и методы исследования
1. Животные и их содержание. Контроль веса 50
2. Поведенческие тесты изучения процессов памяти 50
2.1 Выработка пищедобыватеяъного навыкав экспериментальной камере
2.2 Воспроизведения навыка
2.3 Экспериментальное угашениия ранее выученного навыка
2.4 Обучение аналогичному навыку
3. Эпилептогенкое воздействие 51
3.1 Внутрибрюшиныое введение каиновой кислоты
3.2 Внутримозговые инъекции каиновой кислоты
3.3 Определение силы вызванных судорожных событий
4. Фармакологические воздействия 52
4.1 Применение противосудорожного препарата вальпроата натрия
4.2 Применение нестероидного противовоспалительного препарата индометацина
5. Определение липидного состава 52
5.1 Экстракция липидов
5.2 Хроматографическое разделение липидов
5.3 Определение количества нейтральных липидов
5.4 Определение липидного фосфора
5.5 Определение белка я перерасчет содержания липидов на содержание белка
6. Статистическая обработка результатов 53
Изучение динамики и характера нарушений памяти, вызванных каиновой кислотой.
1. Влияние субконвульсивной дозы (8 мг/кг) каиновой кислоты при системном введении
1.1 Оценка тяжести вызванных судорог 54
1.2 Воспроизведению выработанного навыка в разные сроки после введения каиновой кислоты 55
1.3 Экспериментальное угашение навыка в разные сроки после введения каиновой кислоты 58
1.4. Повторное обучение пищедобывательному навыку 61
2. Влияние конвульсивной дозы (10 мг/кг) каиновой кислоты при системном введении
2.1 Оценка тяжести вызванных судорог 63
2.2 Воспроизведение выработанного навыка 64
2.3 Повторное обучение пищедобывательному навыку 65
3. Эффекты каиновой кислоты при интрагиппокампальном введении
3.1 Оценка тяжести вызванных судорог 68
3.2 Воспроизведение выработанного навыка 68
3.3 Экспериментальное угашение навыка 71
3.4 Повторное обучение пищедобывательному навыку 74
4. Сравнение паттерна когнитивных нарушений при разных способах и дозах
введения каиновой кислоты 74
Изучение возможности компенсации отставленных нарушений памяти, вызванных каиновой кислотой
1. Влияние противосудорожного агента вальпроата натрия на вьвванные нарушения памяти
1.1 Воспроизведению выработанного навыка после совместного применения каиновой кислоты и вальпроата натрия 79
1.2 Экспериментальное угашение навыка после совместного применения каиновой кислоты и вальпроата натрия 80
1.3 Повторное обучение пищедобывательному навыку 83
3. Влияние нестероидного противовоспалительного препарата индометацина на вызванные нарушения памяти
2.1 Воспроизведению выработанного навыка после совместного применения каиновой кислоты и индометацина 84
2.2 Угашение навыка после совместного применения каиновой кислоты и индометацина 86
2.3 Повторная обучение пищедобывательному навыку 87
3. Влияние нембуталового наркоза на вызванные нарушения памяти
3.1 Оценка тяжести вызванных судорог 90
3.1 Воспроизведение выработанного навыка после интрагиппокампального введения каиновой кислоты на фоне нембуталового наркоза и без него 91
3.2 Экспериментальное угашение навыка после и нтрагиппокампального введения каиновой кислоты на фоне нембуталового наркоза и без него 92
Изучение липидного состава мозга при действии каиновой кислоты
1. Содержание нейтральных липидов и фосфолипидов в гомогенате неокортекса и гиппокампа головного мозга контрольных крыс 95
2. Содержание нейтральных липидов и фосфолипидов в гомогенате неокортекса и гиппокампа головного мозга крыс после применения каиновой кислоты 96
3. Обсуждение результатов изучения липидного состава мозга при действии каиновой кислоты 99
Заключительное обсуждение 107
Выводы 116
Список цитируемой литературы 117
- Экспериментальные модели эпилепсии и нарушения памяти у животных, вызванные судорожной активностью мозга
- Воспроизведению выработанного навыка в разные сроки после введения каиновой кислоты
- Экспериментальное угашение навыка после совместного применения каиновой кислоты и вальпроата натрия
- Содержание нейтральных липидов и фосфолипидов в гомогенате неокортекса и гиппокампа головного мозга крыс после применения каиновой кислоты
Введение к работе
. Актуальность темы.
Эпилепсия представляет собой хроническое заболевание головного мозга, проявляющееся внезапными повторяющимися нарушениями двигательных, сенсорных, вегетативных и психических функций, чаще всего с частичной или полной утратой сознания. Одной из наиболее распространенных форм эпилепсии среди взрослого населения является височная эпилепсия, первичный очаг возбудимости которой локализован преимущественно в структурах лимбической системы [Fisher R.S., 1989]. Височная эпилепсия нередко характеризуется злокачественным течением с полиморфными припадками, устойчивыми к действию антиконвульсантов, и быстро прогрессирующими нарушениями интеллектуально-мнестических функций [Калинин В.В., 2004]. Нарушения памяти, касаются, в основном декларативной формы долговременной памяти, которая, в отличие от недекларативной, требует осознания поступающей информации и в большей степени зависит от функционирования гиппокампальной системы. Существенные нарушения когнитивных функций обычно выявляются на поздних этапах эпилепсии, когда имеют место значительные и необратимые морфо-функциональные дефекты структур мозга. Однако, принимая во внимание интегративный характер процессов памяти и внимания, можно предположить, что их нарушения могут быть выявлены и в более ранние сроки эпилептогенеза.
Исследование механизмов судорожной активности, способных изменить протекание информационных процессов в мозге, в последние годы получили развитие благодаря созданию новых экспериментальных моделей эпилепсии. Одной из наиболее распространенных моделей височной формы эпилепсии является введение каиновой кислоты - агониста каинатного типа глутаматных рецепторов, наибольшей чувствительностью к которому обладает гиппокамп [Ben-Ari Y., 1985]. Действие каиновой кислоты не ограничивается несколькими часами после введения, а имеет четко выраженный отсроченный компонент, проявляющийся в постепенном снижении порога судорожной активности и развитии эпилептического статуса. Такая особенность каинатной модели эпилепсии дает возможность исследовать изменения памяти в процессе развивающейся патологии при отсутствии значительных органических повреждений мозга.
Изучение когнитивных функций на ранних этапах развитая височной эпилепсии несомненно дополнит знания как о природе и механизмах нейродегенеративных заболеваний, так и о физиологических основах памяти. Кроме того, выявление механизмов
i'LiC. НАЦИОНАЛЬНА»! БИБЛИОТЕКА І
і ^""wfy'QX'A
развития нарушений памяти на ранних этапах заболевания может дать прогностическую ценность, обеспечивая дополнительные возможности его эффективного лечения.
Цель и задачи исследования.
Целью диссертационной работы является изучение характера и механизмов нарушений процессов долговременной памяти, вызванных судорожной активностью при каинатной модели эпилепсии, а также исследование возможности их предотвращения.
Конкретные задачи исследования: 1. С использованием каинатной модели височной эпилепсии описать динамику развития
когнитивных нарушений у крыс. Подобрать наиболее адекватный поведенческий тест для
регистрации отсроченных когнитивных нарушений, вызванных судорожной
активностью.
-
Охарактеризовать роль гиппокампа в механизмах нарушений памяти при каинатной модели эпилептогенеза.
-
Исследовать возможность использования противосудорожных и нестероидных противовоспалительных препаратов для предотвращения когнитивных нарушений в ходе эпилептогенеза.
-
Изучить липидный состав гиппокампа и неокортекса при действии каиновой кислоты.
Научная новизна.
В ходе работы описаны прогрессирующие нарушения долговременной памяти, вызванные каиновой кислотой. Впервые показано, что экспериментальное угашение навыка является адекватным и наиболее чувствительным тестом, позволяющим выявить нарушения памяти на раннем этапе эпилептогенеза, предшествующем возникновению спонтанных судорог.
Показано, что причиной нарушений памяти при каинатной модели эпилептогенеза является дисфункция гиппокампа. Вьывлены особенности комплексного характера нарушения воспроизведения навыка, сопровождающегося дефектами процессов консолидации у животных при действии каиновой кислоты, что является одним из элементов гиппокампального синдрома.
Впервые сделан анализ липидного состава гомогената неокортекса и гиппокампа крыс при действии вальпроата натрия в каинатной модели эпилептогенеза.
Впервые подобраны условия применения противосудорожного препарата вальпроата натрия и нестероидного противовоспалительного средства индометацина для
предотвращения дефектов когнитивных функций на ранних этапах экспериментального
эпилептогенеза.
Практическое значение.
Исследование памяти позволяет говорить о возможной прогностической ценности контроля когнитивных функций для выявления эпилепсии на ранних стадиях её развития, что дает возможность эффективного предотвращения и коррекции патологии. Результаты работы делают вклад в разработку терапевтических стратегий, направленных на защиту когнитивных функций при различных патологиях мозга. Полученные данные могут быть полезны для понимания клеточно-молекулярных механизмов процессов нейродегенерации.
Апробация работы.
Результаты работы были представлены на заседании секции «Клеточная инженерия»
ученого совета ИТЭБ РАН (Пущино, 2004), на конференции «От современной
фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям» (Пущино, 2002), на XIX
съезде физиологического общества им. Павлова (Екатеринбург, 2004), а также в материалах
других конференций.
Публикации. По материалам работы опубликовано 5 статей, в том числе 4 в рецензируемых
журналах, 6 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из разделов «Введение»,
Экспериментальные модели эпилепсии и нарушения памяти у животных, вызванные судорожной активностью мозга
Эпилепсия - хроническое, склонное к прогрессированию нервно-психическое заболевание, проявляющееся пароксизмальньтми расстройствами (припадками) и более или менее выраженными психическими нарушениями. Эпилепсия является одним из наиболее распространенных нервно-психических заболеваний, поражающим, по различным данным, 0.3-1.2% общей популяции (в среднем 0.5%) [Fisher R.S., 1989].
Основными понятиями, систематически используемыми в клинической и экспериментальной эпилептологии, являются понятия эпилептической активности, эпилептического очага и процесса генерализации. Эпилептической активностью называют патологические формы колебаний биопотенциалов, наблюдаемые в электроэнцефалограмме (ЭЭГ), электрокортикограмме (ЭКоГ) либо при регистрации множественной нейронной активности с глубинного электрода, возникающие на фоне обычной спонтанной активности в виде групп высокоамплитудных волн и комплексов, амплитуда которых внезапно нарастает и спадает [Гусельников В.И., 1976]. Основными компонентами такой активности являются острые волны (треугольные с острой вершиной колебания длительностью 80-200 мс), пики (быстрые высокоамплитудные иглоподобные колебания длительностью менее 80 мс), а также различные комплексы: острая волна-медленная волна (длительность компонентов 80-200 мс и 250-1000 мс, соответственно), пик-волна (менее 80 мс и 250-500 мс), комплекс медленных волн (две и более волны длительностью 500-1000 мс). Повторяющиеся стереотипные колебания или комплексы образуют вспышки соответствующей активности, или ритм (пилообразная активность; ритм пик-волна) [Бехтерева Н.П., 1966; Гусельников В.И., 1976].
Эпилептическим очагом называют ограниченную зону мозга, в которой генерируется эпилептическая активность. Под первичным эпилептическим очагом понимают зону, в которой эпилептические разряды возникают спонтанно и независимо от других зон. Активность первичного очага может распространяться и вызывать появление вторичных очагов, в том числе в гомологичных структурах контралатерального полушария («зеркальные очаги»). Вторичные очаги поначалу зависят от активности первичного и не способны к автономной генерации эпилептических разрядов, однако со временем они становятся стабильными и не затухают даже при выключении первичного очага [Гусельников В.И., 1976]. В случае, когда разряды возникают сразу во всех областях, и не удается выявить первичного очага, говорят о первичной генерализации. Когда же первоначально активность возникает в одной зоне, и лишь потом постепенно захватывает другие структуры, речь идет о вторичной генерализации. Грань между первичной и вторичной генерализацией довольно условна, поскольку даже при первично-генерализованных пароксизмах удается зарегистрировать в период непосредственно перед началом приступа множественные очаги эпилептической активности в различных областях мозга [Гусельников В.И., 1976]. На основе этих понятий строится классификация эпилептических припадков, являющихся, в сущности, ведущим проявлением заболевания. Прежде всего, выделяют группу генерализованных припадков, в которую входят большие судорожные припадки (grand mal) и малые бессудорожные припадки (petit mal).
Височная эпилепсия является наиболее часто встречающейся формой эпилепсии среди взрослого населения. Она проявляется сложными парциальными припадками, первичный очаг при которых чаще всего расположен в структурах лимбической системы. Височная эпилепсия нередко характеризуется злокачественным течением с полиморфными припадками, устойчивыми к действию антиконвульсантов, быстро прогрессирующими нарушениями интеллектуально-мнестических функций и развитием эпилептических психозов [Калинин В.В., 2004].
В настоящее время в лабораторных условиях разработан целый ряд экспериментальных моделей эпилептогенеза, позволяющих изучать эпилептический процесс, его механизмы и последствия на разных уровнях организации. Существуют модели таких патологических процессов, как височная эпилепсия, эпилепсия, вызванная травматическим повреждением мозга, возрастные модели фебрильных судорог и неонатальных судорог вследствие родовой гипоксии [Fisher R.S., 1989]. Безусловно, эти модели не могут в полной мере отразить все характерные свойства заболеваний, являющиеся их прототипами, а также не могут учесть всего разнообразия их происхождения. Тем не менее, использование моделей имеет бесспорное значение при изучении механизмов эпилептогенеза и разработки новых терапевтических стратегий [White S.H., 2002]. Экспериментальные модели in vivo обеспечивают возможность изучения не только молекул яр но-клеточных процессов, сопровождающих судорожную активность или являющихся ее следствием, но и функциональных изменений, проявляющихся в нарушениях когнитивной деятельности, в частности, обучения и памяти. По природе конвульсивного воздействия можно выделить электрическую и химическую стимуляцию мозга. Эти воздействия могут быть как однократными, так и хроническими. Кроме того, в некоторых случаях, конвульсии могут быть спровоцированы временной ишемией, а также температурным воздействием. Разработан также ряд генетических моделей эпилептогенеза. Одной из таких моделей являются крысы, у которых судороги провоцируются предъявлением звукового стимула, так, на базе крыс линии Вистар были выведены животные, отвечающие судорожной реакцией на звуковые стимулы (линия Крушинского-Молодкина) [Крушинский Л.В., 1960].
Височная эпилепсия, является одной из наиболее распространенных форм эпилепсии у человека. Одной из наиболее адекватных, и получивших широкое распространение моделей этого заболевания является модель киндлинга (от англ. kindle - разжигать, раздувать). Эта модель была впервые предложенная Годдардом в 1967 году [Goddard G.V., 1967]. Процедура киндлинга состоит в повторном применении исходно под порогового судорожного воздействия (электрического стимула или фармакологического препарата). При этом происходит постепенное снижение судорожного порога, и воздействие, первоначально не приводившее к каким-либо наблюдаемым судорожным реакциям, начинает вызывать нарастающую судорожную активность [см. Шандра А.А. и др., 1990; Архипов В.И. и др., 2001]. В первых работах киндлинг проводили путем электрической стимуляции амигдалы одно- или двухсекундными сериями разрядов прямоугольных импульсов 100 мкА - 1мА, 1мс, 25-250 Гц [Goddard G.V., 1969; Racine R.J., 1972]. В этих работах были выявлены две важные закономерности киндлинга. Во-первых, используемое раздражение должно вызывать локальный послеразряд в стимулируемой структуре, при этом замечено, что динамика развития киндлинга не коррелирует с интенсивностью стимула.
Воспроизведению выработанного навыка в разные сроки после введения каиновой кислоты
Таким образом, показано, что однократное введение каиновой кислоты в субконвульсивной дозе (8 мг/кг) оказывает отсроченное влияние на способность воспроизведения пищедобывательного навыка. Навык успешно выполняется в течение первых дней, но затем в поведении животных наблюдаются явные дефекты. Для объяснения этих данных необходимо обратиться к механизмам действия каиновой кислоты. Этот нейротоксин давно используется в нейрофизиологических экспериментах [Сытинский И.А., Туровский B.C., 1982; Ben-Ari Y., 1985], и процессы его непосредственного и отсроченного действия на мозг хорошо изучены. Оказалось, что наиболее чувствительными к действию каиновой кислоты являются пирамидные нейроны поля САЗ гиппокампа, содержащие наибольшее количество высокоаффинных каинатных рецепторов. Гиппокамп имеет особенно низкий порог судорожной активности даже при парентеральном введении каиновой кислоты [OIney J. W.et al, 1974]. После интрагиппокампального или системного введения каиновой кислоты начальный период судорожной активности сменяется нормализацией поведения и прекращением эпилептиформной активности. Однако через нескольких недель (иногда месяцев) у животных возникает спонтанные судорожные припадки и развивается эпилептический статус. В "молчащий" период в гиппокампе и непосредственно связанных с ним структурах происходит ряд морфологических изменений: гибель пирамидных нейронов, глиоз, появление аберрантных связей (спрутинг мшистых волокон) [Ben-Ari Y., 2001]. Так, системное введение каиновой кислоты через 2-3 недели приводит к изменению эффективности синаптической передачи и образованию аберрантных синапсов в гиппокампе [Ben-Ari Y., 2001]. В каскаде событий от кратковременного эпизода гиперактивации до длительной модификации организации нейрональных сетей идентифицировано несколько ключевых стадий. Они включают активацию генов немедленного реагирования, активацию генов ростовых факторов в течение нескольких часов, изменения в глутаматных рецепторах, глиальную гипертрофию, изменения в цитоскелетных белках. Этот каскад активируется увеличением внутриклеточного кальция и приводит к росту аксонов и образованию новых синапсов, которые в свою очередь, участвуют в этиологии синдрома, снижая судорожный порог [Farooqui A.A.et al, 2001], Характерной чертой последствий каинатного эпилептогенеза является склероз гиппокампа, что усиливает сходство модели с височной эпилепсией у людей. Однако отсроченные изменения в поведении могут наблюдаться и при отсутствии грубых структурных нарушений в мозге [Архипов В.И. и др., 2001, Reid I.C., Stewart С.А, 1997]. Возможно, поведение нарушено вследствие процессов, изменяющих эффективность синаптических связей (возникновение эпилептической долговременной потенциации [Ben-Ari Y., 2001, Stewart С et al, 1994]), в результате чего меняются функциональные характеристики нервных сетей. Таким образом, нарушения памяти процессов сохранения/воспроизведения навыка, выявленные в нашем исследовании через месяц после применения каиновой кислоты, по всей видимости, объясняются морфологическими и пластическими перестройками в гиппокампе и других лимбических структурах, подверженных влиянию судорожной активности, вызванной каиновой кислотой. Результаты влияния каиновой кислоты на процессы памяти, полученные в настоящей работе, дополняют и уточняют данные других авторов. Так, эксперименты с применением водного лабиринта Морриса, который, как полагают, специфичен в отношении нарушения гиппокампа, показали, что каиновая кислота в конвульсивной дозе нарушает, хотя полностью и.не препятствует, формированию навыка через 5 дней [Brown-Croyts L.M. et al, 2000]. Есть работы, рассматривающие и долговременные влияния судорожной активности на процессы памяти. Например, Mikati М.А. с соавторами проводили эксперименты в лабиринте Морриса и выявили нарушения пространственной памяти и через 10 и через 40 дней после воздействия каиновой кислотой [Mikati М.А. et al, 2001]. Тем не менее, подавляющее большинство подобных работ основываются на данных, полученных с использованием таких доз каиновой кислоты, которые вызывают сильные и продолжительные судороги, нередко с летальным исходом. Mikulecka А с соавторами исследовали память крыс в приподнятом крестообразном лабиринте во время и через 24 часа после субконвульсивной дозы 6 мг/кг каиновой кислоты. Увеличение времени исполнения задания было отмечено как через час после воздействия, когда в ЭЭГ еще регистрировались эпилептогенные элементы, так и через 24 часа, когда уже не было никаких проявлений судорожной активности [Mikulecka A. etal, 2000]. В нашем случае заметное нарушение
воспроизведения/сохранения навыка выявилось лишь через месяц после применения каиновой кислоты. Такие различия в сроках, по всей видимости, обусловлены характером постановки эксперимента и самого теста.
Таким образом, системное введение каиновой кислоты в субконвульсивной дозе 8 мг/кг приводит к отсроченным нарушениям воспроизведения пищедобывательного навыка, проявляющимся через месяц после воздействия. Причиной этого нарушения, по всей видимости, являются морфологические и пластические перестройки гиппокампа и других компонентов лимбическои системы, постепенно развивающихся после первоначального эпизода гипервозбудимости, вызванной применением нейротоксина.
Тест экспериментального угашения ранее выработанного навыка проводили после проверки его воспроизведения у животных, убедившись в том, что они уверенно выполняли навык. Рисунок 3 отображает динамику угашения навыка неподкреплением у разных групп животных через 1 день или через 1 неделю после действия каиновой кислоты.
Достоверное отличие от контроля в скорости угашения навыка проявили крысы, тестированные через неделю после применения конвульсанта. Проверка угашения навыка не выявила отличий от контрольного уровня через день после введения каиновой кислоты. Следует напомнить, что наиболее отсроченный период тестирования - 1 месяц - характеризуется нарушением способности животных к воспроизведению навыка, поэтому тест экспериментального угашения у этих животных не проводили. Через неделю после применения субконвульсивной дозы каиновой кислоты животным опытной группы потребовалось гораздо большее количество пробежек до прекращения выполнения навыка при отсутствии подкрепления (табл. 1) по сравнению с контрольной группой.
Экспериментальное угашение навыка после совместного применения каиновой кислоты и вальпроата натрия
Экспериментальное угашение навыка проводили после проверки способности к его воспроизведению. Отсутствие подкрепления условной реакции приводит к ее постепенному угасанию. Во время теста на экспериментальное угашение навыка животные не получали пищевого подкрепления после совершения пробежки, поэтому время реакции в среднем увеличивалось. Как видно из Рисунка 11, в первый день динамика угашения отличалась в разных группах. Действие каиновой кислоты выразилось в увеличении (по сравнению с контролем) числа реакций, совершаемых животными первой группы. Крысы демонстрировали усиленную ориентировочную реакцию, активно передвигались по экспериментальной камере. Животным этой группы понадобилось большее число пробежек, чтобы выработанный навык оказался заторможенным. Кроме того, снижение способности у угашению навыка сопровождалось почти двукратным увеличением количества персевераций (табл. 4), выразившихся в быстром повторении реакции, утратившей свою актуальность в отсутствии подкрепления. Крысам Группы 2 вводили вальпроат натрия в течение 4-х дней после каиновой кислоты. Действие антиконвульсанта оказалось эффективным в предотвращении развития выявленных нарушений памяти. Выполнение теста в этой группе не отличалось от контроля ни по показателям персеверации и количеству пробежек до прекращения выполнения реакции (табл. 4), ни по динамике у гашения (рис. 11),
Таким образом, применение противосудорожного препарата вальпроата натрия предотвратило нарушение эксприментального угашения навыка, вызванного воздействием субконвульсивной дозы каиновой кислоты.
Экспериментальное угашение представляет собой снижение частоты или интенсивности выработанной реакции после удаления подкрепления. Такое снижение не отражает забывания вследствие нарушения следа памяти, оно представляет собой дополнительное обучение, при котором образуется новая ассоциация условного сигнала с отсутствием первоначального подкрепления.
Влияние антиэпилептических препаратов на когнитивные свойств неоднозначно и противоречиво, и зависит, по видимому, от многих факторов. Так, например стимуляция ГАМК-ергической системы с помощью таких агонистов как диазепам, баклофен, мусцимол, а также применение противосудорожных препаратов, например вальпроата и фенитоина, на здоровых крысах приводит к возникновению дисфункций долговременной памяти, что было выявлено в тесте пассивного избегания, спонтанной альтерации, при обучении в водном лабиринте Морриса [Myhrer Т., 2003; Pandhi P., Balakrishnan S., 1999]. Имеются также клинические данные об ухудшении когнитивных свойств у детей на фоне приема вальпроата натрия. Исследование проводили на группе детей с выявленными на ЭЭГ эпилептиформными разрядами, но без судорожных проявлений. После терапии с использованием вальпроата натрия дети стали более рассеянными, замедленными в ответах на вопросы, появились проблемы с памятью [Ronen G,M, et al, 2000]. Другим примером негативного воздействия этого препарата является развитие значительных интеллектуальных расстройств, которые были выявлены у 8-летней девочки при лечении вальпроатом натрия фибрильных судорог. При уменьшении дозы препарата наблюдалось улучшение когнитивных свойств, и полное их восстановление при отмене такой терапии [Vaquerizo J. et al. 1995].
Однако, есть ряд работ, экспериментальных и клинических, указывающих на благоприяное влияние вальпроата натрия, проявляющееся не только в снятии судорог, но и предотвращении развития когнитивных дисфункций [Stores G. et al, 1992; Gordon К. et al, 1996]. Одним из возможных объяснений такого улучшение когнитивных свойств при использовании вальпроата натрия может быть уменьшением эпилептиформных разрядов. Так, например, использование вальпроата натрия нормализовало ЭЭГ и улучшило способности детей к обучению [Gordon К. et al, 1996]. Однако, не все противосудорожные средства способны предотвращать или компенсировать нарушения памяти, вызванных судорожной активностью. Bolanos A.R. с соавторами, исследуя долговременные эффекты антиэпилептических препаратов, так же как и в нашей работе, в качестве повреждающего воздействия использовал каинатную модель эпилептогенеза. Тестирование памяти у крыс проводили в водном лабиринте Морриса. Длительное применение вальпроата натрия (в течение 40 дней) предотвратило нарушение обучения в водном лабиринте и возникновение спонтанных судорог, вызванных применением конвульсивной дозы каиновой кислоты. Фенобарбатал, который также является широкораспространенным противосудорожным препаратом, не проявил подобной эффективности [Bolanos A.R. et al, 1998].
Механизм противосудорожного действия вальпроата натрия сложен. Он связан с увеличением концентрации в мозге основного тормозного медиатора ГАМК, так как вальпроат натрия тормозит его биотрансформацию (ингибирует ГАМК-транеаминазу) и стимулирует ее синтез (активирует глутаматдекарбоксилазу). Кроме того, показано, что вальпроат угнетает натриевые каналы и в небольшой степени блокирует кальциевые каналы t-типа [Owens MJ, Nemeroff СВ., 2003]. Поскольку угашение выработанного навыка при отсутствии подкрепления является проявлением ингибиторной формы обучения, то сила тормозных процессов играет здесь решающее значение. Эпилепсия связана с изменением нейротрансмиссии ГАМК, основного ингибиторного медиатора в мозга. Каиновая кислота через 6-12 часов после применения приводит к снижению уровня мРНК GABA(B)-2R, -1R субъединиц в гиппокампе [Furtinger S., 2003]. Даже через 40 дней после однократного введения каиновой кислоты (10 мг/кг, внутрибрюшинно) были обнаружены изменения в связывании бензодиазепиновых рецепторов [RochaL., Ondarza-Rovira R., 1999].
Содержание нейтральных липидов и фосфолипидов в гомогенате неокортекса и гиппокампа головного мозга крыс после применения каиновой кислоты
Фосфолипиды могут оказывать существенное влияние на особенности функционирования отдельных структур мозга. Так, для активации многих ферментов головного мозга требуется присутствие фосфолипидов, причем некоторые из этих ферментов обладают высокой специфичностью к каким-то определенным липидам. Например, фосфатидилсерин принимает участие в стимуляции протеинкйназы С, фермента, вовлеченного в ряд жизненно важных процессов клетки, таких как деление, экзоцитоз, передача межклеточного сигнала. На первом этапе стимуляции протеинкиназа С связывается с мембранным фосфотидилсерином в присутствии кальция, а затем встраивается в мембрану, где окончательно активируется диацилглицеролом. Модулируя активность протеинкйназы С, фосфатидилсерин может индуцировать изменения в связывании AMP А- рецепторов [Gagne J., 1996]. Кроме того, фосфатидилсерин вовлечен в регуляцию ацеталхолиновых рецепторов, Na+,K+- АТФазы и многих других ферментов [Farooqui A.A.et al, 2000]. Как уже отмечалось, мы обнаружили, что содержание фосфатидилсерина в гиппокампе головного мозга крыс выше, чем в неокортексе тех же животных (см. Табл. 7). Подобное различие в содержании фосфатидилсерина обнаружено в синаптических мембранах неокортекса крыс, селектированных по уровню возбудимости нервной системы [Герасимова И.А. и др., 2001]. На основании имеющихся данных о роли фосфатидилсерина в регуляции ферментов авторы предположили, что сниженное содержание этого липида в синаптосомальных мембранах коры животных с высоким порогом возбуждения способствует изменению свойств рецепторов, делая животных менее восприимчивыми к стрессовым воздействиям [Герасимова И.А. и др., 2001], Выявленные нами различия в содержании фосфатидилсерина в неокортексе и гиппокампе мозга крыс также, возможно, оказывают влияние на активность ферментов и обеспечивают тем самым разный уровень возбудимости этих структур. Таким образом, повышенное содержание фосфатидилсерина в гомогенате гиппокампа мозга может свидетельствовать о более низком пороге возбудимости гиппокампа и о большей динамичности в процессе передаче нервного импульса по сравнению с неокортексом.
Пулы фосфолипидов рассматриваются в качестве резервуаров липидных мессенджеров в нейронах, глии, эндотелиальных клетках сосудов мозга. При действии нейротрансмиттеров, нейротрофических факторов, цитокинов, при мембранной деполяризации, активации ионных каналов происходит активация фосфолипаз, под действием которых происходит отщепление от резервных фосфолипидов специфических липидных мессенджеров [см. Farooqui A.A. et al, 2000; Bazan N.G., 2003]. Фосфатидилинозитол является одним из ключевых звеньев передачи межклеточного сигнала. Фосфотидилинозитол-4,5-дифосфат гидролизуется фосфолипазой С с образованием двух биологически активных производных - инозитол-1,4,5.-трифосфата и 1,2-диацилглицерола. Инозитолтрифосфат, взаимодействуя с внутренними мембранными рецепторами, приводит к мобилизации эндогенного кальция, что влияет на активацию протеинкиназы С, тогда как диацилглицерол непосредственно связывается с некоторыми изоформами протеинкиназы С и активизирует ее, инициируя сигнальный каскад [Farooqui A.A, et al, 2000]. Помимо важной роли в образовании вторичных посредников, фосфатидилинозитол входит в состав гликозилфосфатидилинозитольных комплексов, выполняющих функцию «заякоривания» на мембране некоторых белков, например, ацетилхолинэстеразы, щелочной фосфатазы, карбоксипептидазы М. Гликозилфосфатилинозитольные «якоря» по сравнению с полипептидными занимают меньше места на мембране и обладают большей латеральной подвижностью, а, кроме того, способствуют передвижению белковых и других молекул к аксональной мембране (см. Farooqui A.A. et al, 2000). Таким образом, изменение фосфорилирования инозитол глицерофосфолипидов влияет не только на образование вторичных мессенджеров, но и на ход различных клеточных процессов, включая экзоцитоз, реорганизацию цитоскелета, апоптоз и транспорт через мембрану. При сравнении гомогенатов гиппокампа и неокортекса головного крыса мозга крыс мы обнаружили небольшое, но достоверное преобладание содержания фосфатидилинозитола в неокортексе. С одной стороны, такое преобладание может свидетельствовать о потенциально более высокой реактивности неокортекса в ответ на различные влияния по сравнению с гиппокампом. С другой стороны, более низкое по сравнению с корой содержание фосфатидилинозитола в гиппокампе может наоборот свидетельствовать о повышенном метаболизме этого липида и, как следствие, более высокой возбудимости. Однако точную закономерность между содержанием отдельных фосфолипидов и пластическими возможностями отдельных структур мозга выявить трудно, поскольку лип иды отличаются высокой скоростью метаболизма и гетерогенностью в мембранных структурах, выполняющих специфические функции.
Предположение о том, что судорожная активность может стимулировать существующие в норме сигнальные механизмы с участием липидных мессенджеров [BazanN.G,, 2003], позволяет рассматривать однократный судорожный эпизод в качестве своеобразной модельной системы для исследования изменений липидного метаболизма в результате гиперактивации клеток. Вместе с тем, изменения клеточного метаболизма, инициированные действием конвульсанта, могут рассматриваться и как реакция мозга на повреждающее воздействие, включающая также и компенсаторные процессы, протекающие с участием липидов. Как выше подчеркивалось, фосфолипиды являются пулом для образования вторичных мессенжеров и их предшественников (таких как арахи до новая кислота, инозитол-3-фосфат и др.), осуществляют функцию "заякоривания" протеинов, участвуют в индукции клеточной гибели, регулируют активность протеинкиназ [Farooqui А.А., 2000]. Эпилепшформная активность сопровождается активацией ряда ферментов: фосфолипаз А1, А2, С, диацилглицерол липазы, триацилглицерол липазы. Вследствие этого, наблюдается изменение содержания некоторых фосфолипидов и аккумуляция свободных жирных кислот и диацилглицеролов (Мартиросян М.А. и др., 1991; Bazan N.G. et al, 1986; Birkle D.L., 1993), В результате гидролиза мембранных липидов и высвобождения свободных жирных кислот и диацилглицеролов, изменяются некоторые свойства нейрональных мембран, например, микровязкость, проводимость ионных каналов, активность мембранно-связанных ферментов. Причем, разные фосфолипиды в период развития судорожной активности могут меняться разнонаправленно. Так, если содержание в неокортексе лизофосфатидилхолина и фосфатидилсерина повышается в результате коразоловых судорог, то уровень фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноамина - снижается [Мартиросян М.А., 1991].
