Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 5
1. Механизмы солеустойчивоети .6
2. Использование клеточной культуры для изучения солеустойчивоети 18
3. Получение солеустойчивых клеточных линий и растений регенерантов 24
4. Получение соле устойчивых растении-регенерантов 30
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 37
1. Характеристика исходной каллусной ткани и реакция на присутствие NaCl в среде 37
2. Получение соле устойчивых клеточных клонов 46
3. Физиолого- биохимический анализ клонов 56
4. Характеристика растении-регенерантов и их потомства 81
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 96
ВЫВОДЫ 98
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Механизмы солеустойчивоети
- Использование клеточной культуры для изучения солеустойчивоети
- Характеристика исходной каллусной ткани и реакция на присутствие NaCl в среде
Введение к работе
В результате ис#куственного орошения в возделываемых почвах возрастает содержание солей. Это делает их малопригодными для культивирования сельскохозяйственных растений,ограничивает естественные ареалы дикорастущих видов растений. В связи с этим актуальной задачей становится получение новых солеустойчивых форм растений. Эффективное получение таких солеустойчивых форм невозможно без глубокого знания физиологических и генетических процессов, лежащих в основе солеустойчивоети.
Применение разнообразных физиологических,биохимических, генетических подходов в современных исследованиях выявило значительную сложность проблемы солеустойчивости. Солеустойчивость растительного организма может обеспечиваться в результате самых разнообразных физиологических реакций, затрагивающих практически все метаболические процессы, происходящие в растительной клетке. По мнению современных исследователей солеустойчивость растений является полигенным признаком со сложной системой регуляции активности генов. Однако, "выделить" и локализовать эти отдельные гены в растениях пока не удалось.
Многосторонность проблемы солеустойчивоети требует привлечения новых, перспективных подходов, направленных на ее решение. Одним из таких подходов может быть применение метода культивируемых клеток in vitro. Использование данного метода раскрывает широкие перспективы в изучении солеустойчивоети.
Клеточная культура позволяет анализировать физиологические реакции происходящие на клеточном уровне в - з -условиях засоления. В условиях отсутствия координирующего и регулирующего влияния целого растительного организма более четко выявляются реакции собственно клетки. В культуре клеток in vitro эффективно анализируются цепи биохимических реакций и трансформации веществ. Выявление наиболее существенных физиологических реакций, связанных с солеустончивостью, позволит использовать их в качестве маркерных для проведения тестирования и отбора солеустойчивых форм.
В результате разнообразных приемов селекции in vitro становится возможным получение различных культивируемых клеточных линий с заранее "заданными" характеристиками, в том числе, с конкретным изменением определенных метаболических процессов. Сомаклональная вариабельность in vitro позволяет выявить специфические варианты сочетания физиолого - биохимических реакций, связанных с солеустойчивостью, которые возможны только in vitro и не проявляются на уровне целого растения.
Свойство тотипотентности клеток растений позволяет получать растения-регенеранты из различных клеточных культур. Становится возможным получение растений-регенерантов сохраняющих признак солеустойчивости как на клеточном так и на организменном уровне. Изучение реализации и наследования данного признака межет ответить на вопросы, связанные с генетической основой солеустойчивости и влиянием эпигенетических факторов на проявление данного признака. Кроме того, получение солеустойчивых форм растений может иметь важное значение для создания новых сортов.
Т.о., методы культивирования in vitro занимают особое место в изучении проблемы солеустойчивости. Клеточная - 4 -культура и получаемые из нее растения-регенеранты представляют собой модель для изучения физиологических основ солеустойчивости и ее реализации на клеточном уровне и на уровне целого растения.
Целью настоящего исследования было изучение модельной системы "клеточная культура in vitro и растения-регенеранты" применительно к проблеме солеустойчивости растений. Для ее решения были поставлены следующие задачи: путем селекции in vitro получить клеточные клоны резистентные к действию высоких концентраций NaCl провести оценку солеустойчивости полученных клонов изучить физиолого-биохимические реакции полученных клонов и контрольной линии в условиях засоления и на пресном фоне получить растения-регенеранты из солеустойчивой клеточной культуры оценить солеустойчивость растений-регенерантов и их потомства оценить возможность применил метода изоферментного анализа для тестирования солеустойчивости клеточных клонов и растений
Механизмы солеустойчивоети
Механизмы устойчивости, благодаря которым растения выживают в условиях засоления, проявляются на уровне целого растения, что требует взаимодействия его различных органов и тканей,позволяющего избегать токсического воздействия ионов.
На уровне растений наиболее важное значение в контроле поступления ионов имеет, по-видимому, всасывающая (поглощающая) система корня, модификация проводящей системы, паренхим-ных клеток ксилемы (Bruggemann, Janiesh, 1988). За счет избирательной активности клеток ризодермы, может обеспечиваться предотвращение проникновения избытка ионов в корневую систему (Koiro, Stelzer, 1988). Благодаря абсорбции ионов паренхимны-ми клетками ксилемы и специфическому обмену между ксилемой и флоэмой некоторые растения избегают распространения и накопления ионов во всех клетках стебля и других частях растения (Greenway, Mums, 1980; Flowers, 1985; Duran, Lakan, 1994). Другим распространенным механизмом защиты является создание ионного градиента между растущими и не растущими частями растений (Yeo,1983). Различия в содержании токсических ионов обнаруживает, например, Б молодых и старых листьях ячменя. Нижние листья могу накапливать в 3 - 4 раза больше Na+ , чем верхние (Greenway, 1965). В корнях кукурузы в условиях засоления зона роста и растяжения корня содержала в 2 - 3 раза меньше Na , чем другие зоны (Yeo, 1977). Выведение избытка ионов из растения в случае галофитов осуществляется с использованием солевых желез или трихом (Flowers et al., 1977). Одним из механизмов, осуществляющих этот процесс может быть явление пиноцитоза. Попадание токсических ионов внутрь клеток из апопласта у галофитов Petrosimoma triandra и Salicornia europaea и их транспортировка внутри клетки происходит, по-видимому, с образованием пиноцитозных везикул ( Куркова, Балнокин, 1993). В большинстве случаев проявление тех или иных механизмов зашиты на уровне целого организма является следствием процессов защиты от засоления на уровне клеток и тканей.
В настоящее время выделяют несколько механизмов, обеспечивающих устойчивость к засолению на клеточном уровне: устойчивость белков и ферментов, мембранная регуляция поступления ионов, осмотическая регуляция с помощью изменения содержания различных осмотически активных веществ и ионов в клетке.
Конформационная устойчивость белков к действию электролитов широко встречается у галофильных бактерий, частично у растений (Хочачка, Сомеро, 1977). Исследования различных белков и ферментов in vitro показали их сверхустойчивость к солям. Это связано со значительным числом аминокислотных остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот, что придает полипептидам отрицательный заряд. Для нейтрализации заряда и сохра - 8 -нения нативной конформации молекулы требуется высокая концентрация катионов в среде. Однако, данный способ адаптации является мало распространенным.
У высших растений устойчивость большинства ферментных систем ниже, чем у галофильных бактерий и не связана с аналогичными изменениями в первичной структуре белка. Наибольшей устойчивостью к действию засоления обладают защитные ферменты: супероксиддисмутаза (Polyakoff-Mayber,, 1982), пероксидаза (Gettis et al. ,1980), АТФ-аза, регулирующая К+ - Na+ обмен (Erdei, Kuiper, 1980) а так же гликолатоксидаза и некоторые другие (Austenfeld, 1976). Однако, большинство ферментных систем растений, в том числе, глутаматдегидрогеназа, каталаза являются чувствительными к действию засоления (Boucard, Billard, 1978, Billard, Boucard, 1980, Polyakoff-Mayber, 1982) и для защиты клетки от засоления используют иные механизмы.
Использование клеточной культуры для изучения солеустойчивоети
Многообразие механизмов солеустойчивости и широкий спектр физиолого-биохимических реакции растений требует комплексного подхода к изучению данной проблемы. Привлечение новых эффективных методов может внести существенный вклад в изучение механизмов солеустойчивоети и получение устойчивых форм растений.
Отсутствие регулирующего влияния целого растения позволяет избежать трансформации ответных реакций клетки, возникающих в результате стрессового воздействия. Анализ физиологических реакций на культуре клеток позволяет выявлять непосредственные клеточные реакции в ответ на засоление. В работе Rus-Alvares и Guerrer (Rus-Alvares, Guerrer, 1994) применение клеточной культуры позволило оценить вклад различных метаболических путей пролина в создание солеустойчивости двух видов томатов. Каллусные культуры доместицированного соле-чувствительного вида Lycopersicon esculentum и солетолерант-ного дикого вида Lycopers і con penne 1.1 і і выращивали в отсутствии засоления и при добавлении 140 мМ NaCl в среду культивирования. При действии засоления в обоих генотипах возрастало содержание глутамина, глутамата, аспарагина и аспартата, тогда как содержание пролина значительно возрастало только в клетках солечувствительного томата. Уровень орни-тина (возможного предшественника пролина) снижался в клетках обоих популяций.
Анализ активности ферментов синтеза возможных предшественников или источников пролина и ферментов катаболизма про-лина выявил интересные закономерности: накопление пролина не было связано с активностью глутаминеинтетазы С ГС), глута-матсинтазы (ГТС) и накоплением глутамина и: глутамата. Б условиях засоления каллусная ткань солеустойчивого вида обладала способностью превращать больше глутамата в свободный пролин благодаря высокой активности д-пирролин-5 карбоксилатредукта-зы (П5КР). В то же время, вторым регулирующим фактором являлась активность ферментов пролиндегидрогеназы (ПДГ) и проли-ноксидазы (ПО). Высокое накопление пролина в клетках соле-чувствительной ткани являлось результатом метаболической "дисфункции" вследствие снижения активности ПДГ и ПО и нарушения процессов дыхания. В результате происходит нарушение окисления пролина и образования гидроксипролина, играющего ключевую роль в образовании клеточной стенки у доместициро-ванного вида, что, в свою очередь, снижало скорость роста клеточной культуры.
Характеристика исходной каллусной ткани и реакция на присутствие NaCl в среде
Исходная каллусная ткань была получена из незрелых зародышей кукурузы линии А 188. Данная линия обладает высоким эмбриогенным потенциалом и может длительное время сохранять способность к регенерации, что позволяет на основе ранее разработанной схемы получать растения - регенеранты (Чернышева и др. , 1988).
Каллусная ткань кукурузы, полученная из незрелых зародышей была достаточно гетерогенна по морфологическим признакам. Более светлый плотный каллус с зелеными апексами, который при перенесении на среду без 2,4-Д давал регенерацию растений, мы называли эмбриогенным. Неэмбриогенный каллус был желтоватого цвета, более оводненным и не имел зеленых апексов. Каждый эксплант ткани в конце пассажа имел участки каллуса эмбриогенного типа и неэмбриогенного. На протяжении всей работы с культурой ткани ставилась задача поддержания именно эмбриогенной ткани. Индекс роста, то есть отношение конечного веса экспланта к исходному, в среднем варьировал от 8 до 10.
Наличие NaCl в среде заметно снижало рост ткани (Рис.1). На среде с 0,5Х содержанием NaCl средний вес экспланта через 25 - 28 суток составлял 189,2 мг. Но реакция каллусной ткани на NaCl была различной. Для некоторых эксплантов была отмечена стимуляция роста. Вес отдельных каллусов достигал 450 мг. На среде с концентрацией 0,5% NaCl -гетерогенность каллусной ткани по росту была высокой. Коэффициент вариации (с. v.) был равен 47,1%.
При повышении содержания NaCl в среде до 1% происходило значительное снижение скорости роста каллусной ткани. Прирост в среднем составлял менее 40% от контроля. Конечный вес эксплантов варьировал от 1 мг до 157 мг (табл. 2). Средний вес экспланта был равен 72,7 мг, коэффициент вариации составлял 51%. Культивирование ткани на среде с данной концентрацией приводило к проявлению наибольшей гетерогенности каллусов по морфологии и ростовым характернетинам. Большая часть эксплантов приобретала черты неэмбриогенного каллуса. И только некоторые экспланты сохраняли эмбриогенную способность и имели прирост биомассы.
Повышение концентрации NaCl в среде до 1,5% и выше приводило практически к полному торможению роста, средний вес эксплантов был равен соответственно 6,4 мг и 25,6 мг. Коэффициент вариации значительно снижался и составлял соответственно 14,8% и 12,1% что свидетельствует о значительном угнетении роста и отсутствии гетерогенности эксплантов. Кал-лусная ткань приобретала серовато - коричневый цвет и некро-тизировала. На эксплантах полностью отсутствовали участки эм-бриогенной ткани. Возрастание веса некоторых эксплантов, по-видимому, связано с оводнением ткани.
