Введение к работе
Актуальность проблемы. Функции экстраклеточных S-подобных рибонуклеаз растений в настоящее время малоизучены. Известно, что экспрессия генов некоторых экстраклеточных РНКаз индуцируется при повреждении тканей, при фосфатном голодании, в стареющих тканях растений, а также при инфекции.
Предполагают, что одна из функций этих ферментов может быть связана с механизмами неспецифической защиты от патогенов вирусной и грибковой природы (Galiana et al., 1997; Hugot et al, 2002; LeBrasseur et al, 2002). Это предположение основано, в частности, на том, что экспрессия некоторых генов S-подобных РНКаз индуцируется при повреждении тканей, причем не только локально (в месте повреждения), но и системно (Ye and Droste, 1996; Lers et al, 1998; LeBrasseur et al, 2002). Для многих вирусов покровные ткани растения являются труднопреодолимым барьером, и поранение, вызванное механическим повреждением, позволяет им проникнуть в растение. Принимая во внимание тот факт, что у большинства вирусов растений генетический материал представлен РНК, можно предположить, что эксграклеточные РНКазы, индуцируемые поранением, являются одним из компонентов противовирусной защиты на начальных этапах инфекции. Однако причины повышения РНКазной активности и функциональная роль индуцированных РНКаз именно в вирусоустойчивости пока остаются неясными. Так, индукция рибонуклеаз может быть вызвана собственно повреждением тканей или их преждевременным старением и отмиранием и может быть необходима для ремобилизации фосфата (Green, 1994).
С другой стороны, в некоторых тестах in vitro и in planta показана противогрибковая активность экстраклеточной РНКазы табака (Hugot et al., 2002). Данных о противовирусной активности экстраклеточных РНКаз растений нет, однако показано, что экзогенное нанесение панкреатической РНКазы быка (РНКазы А) вместе с вирусным инокулюмом защищает растения от вируса табачной мозаики (ВТМ) (Galiana et al., 1997). Кроме того, трансгенные растения табака, экспрессирующие РНКазу А быка, характеризуются повышенной устойчивостью к ВТМ (Trifonova et al., 2007). Эти результаты не означают, что растительные рибонуклеазы также обладают противовирусной активностью, поскольку наблюдаемый эффект может быть связан со специфическими свойствами РНКазы А. Однако участие рибонуклеаз растительного происхождения в механизмах вирусоустойчивости весьма вероятно.
По-видимому, S-подобные рибонуклеазы растений могут выполнять и другие, не известные в настоящее время функции. Для некоторых экстраклеточных РНКаз показана экспрессия на ранних стадиях развития (Rogers and Rogers, 1999; Kock et al, 2004; Hillwig et al, 2008). Это дает основания полагать, что некоторые S-подобные РНКазы участвуют в контроле процессов роста и развития.
В целом, имеющиеся данные указывают на то, что S-подобные РНКазы могут быть задействованы в ряде важных биологических процессов (прорастание, развитие, ремобилизация фосфата, стрессоустойчивость, формирование
устойчивости к патогенам - особый интерес представляет возможное участие РНКаз в формировании неспецифической вирусоустойчивости). Большая часть из этих функций пока остаются недоказанными, что обусловливает актуальность проведения исследований в этом направлении.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в создании трансгенных растений табака с измененной активностью экстраклеточных рибонуклеаз и исследовании на этой модели функциональной роли экстраклеточных рибонуклеаз растений в формировании устойчивости к патогенам, а также в процессах роста и развития.
Были поставлены следующие задачи:
создание генетических конструкций, обеспечивающих повышенный и сниженный уровень рибонуклеазной активности в апопласте;
получение трансгенных растений табака с увеличенным и сниженным уровнем рибонуклеазной активности в апопласте;
анализ вирусоустойчивости трансгенных и контрольных растений;
сравнительный анализ трансгенных и контрольных растений табака по морфологии и срокам развития.
Научная новизна. Создана новая генетическая модель - трансгенные растения табака с измененной активностью экстраклеточных рибонуклеаз (увеличенной и сниженной по сравнению с контролем). Показано, что в нормальных условиях трансгенные растения не проявляют значимых отличий от растений исходной линии по морфологическим параметрам. Впервые показано, что повышенный уровень РНКазной активности в апопласте вследствие конститутивной экспрессии РНКазы ZRNasell Zinnia elegans сопровождается повышенной вирусоустойчивостью растений, что подтверждает гипотезу об участии экстраклеточных рибонуклеаз растений в формировании вирусоустойчивости. Кроме того, результаты анализа полученных модельных растений позволяют предположить, что в нормальных условиях изменение уровня активности экстраклеточных рибонуклеаз не влияет на процессы роста и развития растений.
Практическая ценность. Показано, что экстраклеточные рибонуклеази растений могут использоваться для получения генетически модифицированных растений с повышенной вирусоустойчивостью. Получен патент; Заявка 2009109530 Российская федерация. МПК C12N15/82. Рекомбинантная плазмида, обеспечивающая экспрессию гена экстраклеточной рибонуклеазы Zinnia elegans ZRNasell в трансгенных растениях (варианты) и способ получения вирусоустойчивых форм растений. / Авторы: Трифонова Е.А., Сангаев С.С., Романова А.В., Кочетов А.В., Сапоцкий М.В., Малиновский В.И, Шумный В.К.; заявитель: Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН (ИЦиГ СО РАН); приоритет 16.03.2009. решение о выдаче патента от 04.02.2010.
Положения, выносимые на защиту.
1. Генетическая конструкция pBi-Nk, несущая двуцепочечный РНК-
супрессор гена экстраклеточной РНКазы Nkl Nicotiana tabacum, обеспечивает существенное снижение активности РНКазы Nkl.
Генетическая конструкция pBi-RNS, несущая кДНК экстраклеточной РНКазы ZRNasell Zinnia elegans под управлением промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, обеспечивает эффективную экспрессию РНКазы ZRNasell и существенное увеличение общей рибонуклеазной активности в апопласте табака.
Трансгенные растения, конститутивно экспрессирующие РНКазу ZRNasell, характеризуются повышенной устойчивостью к вирусу табачной мозаики.
Трансгенные растения табака с измененной активностью экстраклеточных рибонуклеаз не проявляют существенных отличий от растений исходной линии по морфологическим характеристикам и параметрам развития.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007 г.); на Всероссийской научной конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2007 г.); на Международной научной школе-конференции молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Москва, 2008 г); на Российско -Французской конференции "Problems and prospects in plant biotechnology" (Новосибирск, 2008 г.); на Германо - Российском биотехнологическом форуме (Новосибирск, 2009 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 печатных работы в рецензируемых журналах и получен 1 патент.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 22 рисунка.
