Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I Обзор литературы 12
1.1 Ведение культуры соматических клеток и регенерация мягкой пшеницы in vitro
1.1.1 Зависимость частоты индукции каллуса и регенерации растений пшеницы от типа экспланта
1.1.2 Зависимость частоты индукции каллуса и регенерации растений пшеницы от генотипа
1.1.3 Влияние состава среды на частоту индукции каллусогенеза и регенерации растений пшеницы
1.2 Прямой перенос генов в злаки - биобаллистическая генетическая трансформация мягкой пшеницы
1.2.1 Параметры баллистической трансформации мягкой пшеницы
1.2.2 Маркерные гены 23
1.2.3 Селективные гены и системы селекции. 25
1.2.4 Селективный ген bar. Механизм действия 26
1.2.5 Негативная селекция трансгенной ткани пшеницы in vitro
1.3 Генетика устойчивости растений к абиотическим стрессам
1.3.1 Механизм действия гена глутатион S-трансфераза (GST). Разнообразие генов GST
ГЛАВА II Материалы и методы 38
2.1 Растительный материал. Получение морфогенетической каллусной культуры соматических клеток и регенерация in vitro растений мягкой пшеницы 38
2.2 Выделение плазмидной ДНК, работа с бактерией е. coli 41
2.3 Протокол баллистической трансформация мягкой пшеницы
2.4 Создание векторной конструкции pGSTBAR 46
ГЛАВА III Оптимизация ведения культуры соматических клеток мягкой пшеницы in vitro
3.1 Влияние генотипа на частоту индукции морфогенетического каллуса мягкой пшеницы
3.2 Влияние обработки зерновок низкой температурой на частоту индукции морфогенетического каллуса
3.3 Изучение влияния различных типов фитогормонов и их концентрации в среде на частоту регенерации растений 59 мягкой пшеницы in vitro
ГЛАВА IV Получение и анализ трансгенных растений мягкой пшеницы несущих гены bar и gst
4.1 Влияние биобаллистического воздействия на морфогенетический потенциал тканей мягкой пшеницы
4.2 Оптимизация параметров баллистической трансформации мягкой пшеницы
4.3 Мониторинг процесса трансформации путем исследования транзиентной и стабильной экспрессии гена gfp
4.4. Сравнительная оценка методов селекции трансгенных тканей пшеницы
4.5 Анализ наследования гена bar у трансгенных линий пшеницы ТІ
4.6 Определение устойчивости трансгенных растений ТІ поколения к хлоридно-натриевому засолению
Заключение 115
Выводы 117
Список литературы 118
- Зависимость частоты индукции каллуса и регенерации растений пшеницы от генотипа
- Выделение плазмидной ДНК, работа с бактерией е. coli
- Влияние обработки зерновок низкой температурой на частоту индукции морфогенетического каллуса
- Оптимизация параметров баллистической трансформации мягкой пшеницы
Введение к работе
Актуальность темы Пшеница является главной сельскохозяйственной культурой для большинства населения умеренной климатической зоны. Подавляющее большинство сортов пшеницы создано традиционными методами селекции на основе использования генетического разнообразия исходных видов. Развитие генно-инженерных технологий призвано качественно изменить этот процесс путем вовлечения в селекцию единичных генов или группы генов из любых видов растений, животных, микроорганизмов, или даже аЪ initio синтезированных генов, которые могут быть введены в геном пшеницы для придания новых желаемых свойств.
Первая трансформация пшеницы методом биобаллистики осуществлена (Vasil et al, 1992). В настоящее время процесс создания трансгенных растений мягкой пшеницы (Т. aestivum L.) методом биобаллистической трансформации считается рутинным. Однако это справедливо лишь для некоторых сортов, отзывчивых к трансформации, таких как Bob-white и Florida, но и в этих случаях эффективность трансформации не превышает 1-6% (Weeks I.T. et al, 1993, Chen W. P., et al, 1998, Uze M. et al, 1999, Jordan M.C 2000, Wright M., 2001).
Производство высококачественного продовольственного зерна пшеницы лимитируется в Российской Федерации абиотическими и биотическими стрессами. Среди биотических стрессов для злаков необходимо выделить экономически значимого вредителя пшеницы клопа вредная черепашка (Eurygaster integriceps Puton), затрудняющего получение высококачественного зерна в южных и юго-восточных регионах России. Экономические потери от клопа составляют миллиарды рублей ежегодно (Захаренко В.А., 2005). Поэтому создание устойчивых к неблагоприятным условиям среды сортов пшеницы представляется первостепенной научной и важнейшей экономической задачей.
Для практического применения генетической инженерии с целью улучшения важнейших культур необходимо иметь высокоэффективную систему генетической трансформации, адаптированную для районированных в РФ сортов, Увеличение эффективности трансформации ценных генотипов пшеницы может быть достигнуто при решении следующих задач:
-
повышение частоты регенерации растений in vitro;
-
оптимизация параметров генетической трансформации;
-
выбор наиболее эффективного способа селекции трансформированных клеток и регенерации истинных растений-трансформантов.
Известно, что поддержание гомеостаза глутатиона является одним из
механизмов, обеспечивающих устойчивость растений к различным
абиотическим стрессам. Поэтому генно-инженерные манипуляции с
метаболическим путем глутатиона нродотарлшотеп многообещающими для
Р1 АУ-МСХА
кменн К.А. Тимирязева
ЧДНБ имени Н.И. Жілсзнова
Фонд научней ДИтеЕдтупы
повышения устойчивости растений к стрессам Антистрессовые действия фермента гтутатион-8-трансферазы (GST) обусловлены детоксикацией свободных радикалов, возникающих при любых стрессах Ген gst был изолирован из генома Arabidopsis thahana в группе профессора С Сопори (Международный Центр Генетической Инженерии и Биотехнологии, Нью-Дели, Индия) и любезно предоставлен нам для исследования
Цель исследования заключалась в оптимизации параметров генетической трансформации районированных в РФ сортов мягкой яровой пшеницы и получении трансгенных растений, несущих гены gst и bar, для определения устойчивости полученных растений к гербициду Баста и хлоридно натриевому засолению
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи
-
Оптимизировать параметры ведения культуры клеток и регенерации растений in vitro мягкой пшеницы сортов Лада Эстер Мис Норис и А чир
-
Оптимизировать параметры биобаллистической трансформации мягкой пшеницы сортов Лада Эстер и Мис
-
Провести сравнительный анализ эффективности трех методов негативной селекции (отложенной, градационной, регенерационной) трансгенных тканей пшеницы т vitro, дія получения истинных трансформантов
-
Получить растения трансгенной пшеницы, несущей гены bar, gfp и bar gst а также изучить характер наследования введенных трансгенов
-
Выявить трансгенные растения, устойчивые к натриево-хлоридному засолению
Научная новизна Все представленные в диссертации ретультаты являются новыми и оригинальными
-
Впервые показан стимулирующий эффект кратковременного воздействия (48 ч) пониженной температуры (-ЫС) на частоту индукции морфогенетического каллуса
-
Впервые оптимизированы условия культивирования in vitro генотипов мягкой пшеницы Лада, Эстер Мис Амир, Норис районированных в 4 зонах РФ, для индукции морфогенного каллуса и регенерации растений in vitro
-
Впервые оптимизированы параметры биобаллистической трансформации мягкой пшеницы для широко возделываемых в четырех зонах РФ сортов Лада, Эстер и Мис
-
Впервые в РФ получены трансгенные растения мягкой пшеницы, несущие гены bar и gst
5. Проведен анализ наследования трансгенов в двух поколениях на примере сорта мягкой пшеницы Лада. Показано, что экспрессия gst может повышать уровень устойчивости растений пшеницы к хлоридно-натриевому засолению.
Практическая значимость Полученные в работе результаты имеют важное практическое значение:
— результаты данной работы показали возможность получения
трансгенных растений, распространенных сортов мягкой пшеницы,
несущих различные гетерологичные гены, в количествах необходимых
для использования в селекционном процессе.
- получена выборка трансгенных растений мягкой пшеницы сорта
Лада, несущих гены bar, обеспечивающий устойчивость к гербициду
широкого действия Баста и ген антистрессового действия gst. Данные
растения представляют интерес для изучения механизмов повышения
устойчивости пшеницы к хлоридно-натриевому засолению.
Апробация работы Основные результаты работы докладывались на 2-ой научной конференции Московского общества генетиков и селекционеров "Актуальные проблемы современной генетики"; на конференции "Трансгенные растения — новое направление в биологической защите растений", Краснодар 2003 г.; на международном конгрессе XVth International Plant Protection Congress, Beijing, China, May 11-16, 2004; на международной конференции Second International Conference on Sunn Pest, ICARDA, Aleppo, Syria 19-22 July, 2004; На международной конференции "Развитие ключевых направлений сельскохозяйственной науки Казахстана: селекции, биотехнологии и генетических ресурсов" Астана, 3-7 августа 2004.
Публикации По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Объем и структура работы Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (ІЗО наименований), изложена на 13е/ страницах машинописного текста, содержит (_ таблиц и 23 рисунков.
Зависимость частоты индукции каллуса и регенерации растений пшеницы от генотипа
Известно, что различные генотипы пшеницы отличаются между собой по частоте образования и роста каллусов, регенерации растений [28]. Сиарс и Декард в 1982 г. показали, что из 39 генотипов озимой пшеницы только IS сохраняли способность к регенерации растений после 4-х месяцев (90-125 дней) культивирования [29]. Каллусные культуры, полученные из линии № Д7532 и сорта Roughrider сохраняли способность к регенерации в течение 420 дней. При этом линия № Д7532 показала наиболее высокую частоту образования МК и высокую скорость роста. Маддок с соавторами в 1983 году при анализе морфогенетических способностей у 25 сортов яровой и озимой пшеницы, установили различия по этим свойствам между различными генотипами [30], При культивировании незрелых зародышей 33-х генотипов пшеницы на среде, содержащей 2,4-Д, Бапат с соавторами в 1988 году установили, что каллусные линии, полученные из 2-х линий, а именно № 1-5439 и № 1-5743, отличаются более высокой регенерационной способностью, чем остальные 31 генотип [27]. Кроме того, у этих двух генотипов для роста образовавшихся побегов требовалось полное отсутствие ауксинов в среде культивирования, хотя формирование самих побегов происходило на среде с ауксином. В 2002 году Пелегриничи с соавторами установили, что 129 сортов, происходящих от одного генотипа Bobwhite, имеют различную частоту образования МК, частоту регенерации растений, устойчивость к баллистическому воздействию и эффективность трансформации [28].
Кроме генотипа пшеницы, сезона, типа эксплантата, возраста экспланта, состав среды для культивирования оказывает значительное влияние на способность культивируемых тканей и клеток к морфогенезу, а также определяет, какой тип морфогенеза будет превалирующим в данной культуре. Основную роль при этом играют тип используемых фитогормонов и их концентрация. Различия в частоте образования каллусов и регенерации растений пшеницы в зависимости от состава среды показаны в ряде работ [16, 29-37]. Среда для индукции каллуса и регенерации растений состоит из следующих компонентов: - основные неорганические вещества (макроэлементы); - микроэлементы; - органические добавки (витамины, аминокислоты); - углеводы; - фитогормоны - агар-агар как гелеобразующий или затвердевающий компонент Для индукции каллусогенеза и регенерации растений пшеницы наиболее часто используются среды Мурашиге и Скуг (МС) [21, 38, 39], Линсмаер и Скуг (ЛС) или Рм-63 [14, 40, 41] и их различные модификации. Эти среды отличаются между собой по составу микро- и макроэлементов и концентрациями используемых органических добавок.
В качестве источника углевода обычно используется сахароза, мальтоза, глюкоза. Источник железа - FeS04 7H20 с 1Уа2 ЭДТА 2Н20, т.е. железо находится в хелатированной форме в комплексе с ЭДТА. Частота индукции каллуса пшеницы меняется в зависимости от состава, концентрации макро- и микроэлементов и органических добавок. Так, Озиас-Акинс и Вазил в 1983 году при использовании среды МС с удвоенными концентрациями солей, получили высокую частоту образования эмбриогенного каллуса пшеницы генотипов Florida и Bobwhite [25].
Для индукции каллусогенеза в среду добавляют фитогормоны, относящиеся к ауксинам и цитокининам, а также синтетический ауксин -2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) [14, 15, 21, 30, 42]. Так, например, Сиарс и Декард в 1982 году индуцировали культуру клеток из незрелых зародышей 39 сортов озимой пшеницы на среде, содержащей 1 мг/л 2,4-Д [29].
Из других ауксинов для индукции каллусогенеза чаще используется 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т) [16, 31]. При анализе влияния ауксинов и цитокининов на процесс каллусогенеза у мягкой пшеницы Дудите с соавторами в 1975 году [16] установили, что наиболее подходящими ауксинами для получения МК являются 2,4,5-Т, беназолин, банвел Д в концентрациях 5-10 мМ, 7-Ю мМ, 7 мг/л (2 10 мМ), соответственно. Беназолин и банвел Д, так же как и 2,4-Д и 2,4,5-Т поддерживали рост каллусов в отсутствии экзогенных цитокининов. Кроме того, цитокинины ингибировали рост каллусных культур. Степень ингибирования зависела от типа цитокинина. Лазар с соавторами в 1984 году для получения культуры соматических клеток пшеницы использовали в различных концентрациях 2,4-Д; пиклорам; 2,4,5-Т в сочетании с различными концентрациями кинетина [31]. Оптимальная среда для роста каллусов содержала 2,4,5-Т в концентрациях лежащих в диапазоне 0,5 - 1,0 мг/л и 0,1 мг/л кинетина.
Таким образом, показано, что для индукции каллусогенеза мягкой пшеницы при использовании незрелых зародышей в качестве экспланта необходимым условием является присутствие в среде синтетического ауксина 2.4-Д, который вызывает недифференцированный рост или ингибирует рост каллуса [16, 31]. Танзарелло и Греко в 1985 году показали, что при добавлении в среду культивирования МС кинетина (1мг/л) и 6-бензиламинопурина (БАП) (5 мг/л), возможно индуцировать каллус из незрелых зародышей твердой пшеницы без 2,4-Д [32]. Бапат с соавторами в 1988 году получили регенерацию растений пшеницы при использовании среды МС с 1 мг/л кинетина [27].
Выделение плазмидной ДНК, работа с бактерией е. coli
Приготовление компетентных клеток: в 20 мл LB бульона вносили 0.2 мл ночной культуры Е. coli. Наращивание культуры проводили при 37 С, на качалке до оптической плотности 600 о.п. примерно 1-3 часа. При достижении необходимой оптической плотности, культуру осаждали на центрифуге (К 23) 4000 об./мин 10 минут с охлаждением. Осадок растворяли в 1/3 исходного объема в 50 мМ CaCL2 (обеспечивает преципитацию ДНК с клетками) 7 мл холодного. Помещали на лед на 15 минут. По прошествии положенного времени осаждали культуру на центрифуге (К 23) при 4000 об./мин 10 минут с охлаждением. Осадок растворяли в 1/20 (исходного объема) 1 мл холодного 50 мМ СаСЬ. Для хранения компетентных клеток в эппендорф добавляли глицерин до 15% и помещали на -70 С. предварительно разделив на аликвоты по 100 мкл.
Трансформация плазмиды е компетентные клетки Е. coli: в эппендорф с 100 мкл компетентных клеток добавляли 25 мкл трансформируемой ДНК. Выдерживали в течение часа на льду. Переносили эппендорф на водяную баню 42 С на 90 секунд, затем добавляли жидкий бульон LB 700 мкл. На один час эппендорф помещали в термостат, с температурным режимом 37С. На чашку Петри с твердой LB вносили 50 мкл культуры и втирали в среду шпателем. Чашки помещали на ночь в термостат на 37 С для наращивания колоний трансформантов на селективной среде.
Щелочной скрининг: методика щелочного скрининга позволяется за короткое время выделить плазмидную ДНК из малого объема 1-2 мл. Осаждение 1 мл бактериальной культуры в эппендорфе при 12000 об/мин. в течение 1 мин. Осадок растворяли в 200 мкл раствора 1, смесь тщательно ресуспендировали. - Состав раствора 1: на 20 мл - ТрисШрН8.0-1мл - ЭДТА0.5М-0.4мл - РНКаза100мкг/мл Добавляли 300 мкл раствора 2, смесь тщательно ресуспендировали. - Состав раствора 2: на 20 мл - №ОН1М-4мл - SDS20%-1MA - Н20-15мл Добавляли 200 мкл раствора 2, смесь тщательно ресуспендировали. - Состав раствора 2: на 100 мл - К-ацетат- 30 грамм - Уксусная кислота - 11.5 мл Осаждали смесь при 12000 об./мин 15 минут. Отбирали стерильным носиком 500 мкл надосадка. Вносили 1 мл этилового спирта, и помещали на холод -20 С на 15 минут. Осаждали при 12000 обУмин. 5 минут. Осадок промывали 0.5 мл 70% этилового спирта и осаждали при 12000 об./мин. 1 мин. Супернатант сливали, осадок высушивали и растворяли в 50 мкл стерильной дистиллированной воды. Выделение плазмидной ДНК: выделение плазмидной ДНК из ночной культуры Е. соїі (штамм DH10) проводилось по методике щелочного скрининга с последующей отчисткой препарата фенол-хлороформом. Осаждали 500 мл бактериальной культуры при 4000 обУмин. в течение 10 мин. Надосадок сливали, осадок растворяли в 50 мл физраствора. Осаждали раствор при 4000 об./мин. в течение 10 мин. Надосадок сливали, осадок растворяли в 20 мл раствора 1. Добавляли 30 мл раствора 2 тщательно ресуспендировали. Добавляли 20 мл раствора 3 тщательно ресуспендировали. Осаждали при 12000 об./мин. в течение 20 минут. Отбирали надосадок, если мутный осаждали еще раз при 12000 обУмин. в течение 10 минут. ДНК осаждали спиртом: изопропиловым 0.7 объёма, или 96% этиловым спиртом двойным объёмом. Осаждение проводили при 4000 об./мин в течение.10 мин. Осадок растворяли в 10 мл ТЕ буфера, и разделяли по 0.7 мл. в эппендорфы, добавляли фенол-хлороформ в соотношении 1/1 по 0.7 мл на каждый эппендорф. Осаждали смесь при 12000 об./мин. в течение 20 мин. Отбирали водную фазу и переносили в новый эппендорф. Добавляли в каждый эппендорф 0.7 мл хлороформа, смесь тщательно ресуспендировали. Осаждали смесь при 12000 обУмин в течение 20 мин. Водную фазу переносили в новый эппендорф. Добавляли 0.5 мл изопропанола, или 96% этанола, для экстракции ДНК эппендорфы помещали на ночь на -25 С. Осаждение проводили при 12000 обУмин в течение 5 мин. Надосадок сливали, эппендорфы в течение двух мин подсушивали. Осадок промывали 0.5 мл, 70% этиловым спиртом. Осаждали при 12000 об./мин в течение 1 мин. Осадок промывали 0.5 мл 96% этиловым спиртом. Осаждали при 12000 обУмин в течение 1 мин. Осадок из всех эппендорфов высушивали и растворяли в 200 мкл стерильной дистиллированной воды.
Влияние обработки зерновок низкой температурой на частоту индукции морфогенетического каллуса
Известно, что на частоту индукции морфогенетического каллуса оказывают влияние тип и состояние экспланта, воздействие физических факторов и фитогормональный состав сред. На основе анализа литературных источников невозможно определить значение воздействия низких температур на растительные ткани, используемые для индукции культуры клеток пшеницы, а также продолжительность сохранности незрелых тканей при низких температурах. В работе Иммонена с соавторами 1996 года указывается, что предобработка низкой температурой увеличивает частоту индукции морфогенетического каллуса тритикале [121]. В исследовании [3] проведена оценка времени воздействия низкой температурой на индукцию морфогенетического каллуса мягкой пшеницы. В результате эксперимента не выявлено различия в частоте индукции МК в опыте и контроле. В работе [3] для определения влияния предобработки низкой температурой оценка производилась один раз через 14 день при обработке 6С. Аналогичное исследование проведено [122] на трех сортах мягкой пшеницы районированных в Иране, в работе оценивали влияние температурной обработки на 4, 7 и 10 день выдерживания зерновок при низкой температуре. В результате исследования определено генотипическое воздействие на индукцию каллусообразования, низкая температура не оказывала эффекта на каллусообразование. Возможная причина противоречий в указанных исследованиях скрывается в использовании различных временных параметров, в которые производится оценка эффективности обработки.
Для того чтобы проверить, как влияет низкотемпературная обработка зерновок на частоту индукции морфогенного каллуса, был проведен следующий эксперимент. Незрелые зерновки подвергали обработке пониженной температурой (+4С) в течение 1, 2, 3, 4, 5, 9, 10 и 11 дней. Изолированные незрелые зародыши культивировали на среде (А). Далее проводили наблюдение и оценивали частоту индукции морфогенетического каллуса. Полученные данные позволяют сделать вывод о повышении частоты индукции морфогенного каллуса при кратковременной (48 ч.) экспозиции эксплантов при температуре +4 С (Рис. 8.III). Для сорта Лада максимальные значения частоты индукции морфогенетического каллуса достигают 75 %; для сорта Норис 60 %. В качестве контроля использовали незрелые зародыши сортов Лада и Норис, изолированные из зерновки сразу после срезания колоса растения с частотой индукции морфогенетического каллуса (26.3 +/- 6.29 сорт Лада и 32.8 +/- 9.54 сорт Норис). Таким образом, при сравнении значений с контролем и значениями, полученными на третий и последующие дни обработки низкой температурой, данные статистически достоверны при Р 0,05. Обработка эксплантов низкой температурой более трех дней приводит к снижению образования морфогенетического каллуса до 29.7+/- 7.56 для сорта Лада и 16.4 +/- 7.38 для сорта Норис. Частота индукции МК на пятый день культивирования при +4 С составила 21.7 +/- 6.21 для сорта Лада и 12.8 +/-7.76 для сорта Норис, что статистически не отличается от контроля (26.3 +/- 6.29 сорт Лада и 32.8 +/- 9.54 сорт Норис). Как видно из полученных результатов, частота образования морфогенетического каллуса на 1 и 4 день экспозиции одинакова, на 5 день эффективность воздействия снижается (Рис. 8.Ш). К-контроль. Изолированные зародыши из зерновок сразу после срезания колоса растения
Влияние воздействия низкой температуры на индукцию морфогенетического каллуса мягкой пшеницы сортов Лада и Норис 3.3 Изучение влияния различных типов фитогормонов и их концентрации в среде на частоту регенерации растений мягкой пшеницы in vitro Известно, что наличие-отсутствие в культуральной среде специфических экзогенных фитогормонов, их сочетания и концентраций, определенных для различных семейств растений (специфичность показана и для каждого генотипа), позволяет регулировать процессы морфогенеза в растительной ткани в культуре in vitro. Так, для злаков показано, что синтетический ауксин 2,4-Д инициируют процессы индукции из дифференцированных тканей экспланта (щитка незрелых зародышей или незрелых соцветий) неорганизованно растущей дедиференцированной каллуснои ткани [118-120]. При удалении 2,4-Д из среды, или при истощении среды, при длительном культивировании каллуснои ткани, происходит индукция побегов. Для индукции ризогенеза в среду добавляют ауксины (ссылка). Пшеница является типичным представителем однодольных растений, трудных для получения и ведения культуры соматических клеток in vitro. Трудность управлением морфогенезом in vitro отчасти заключается в генотипической зависимостью процессов морфогенеза у пшеницы. Практическая важность пшеницы объясняет большое количество исследований, направленных на оптимизацию протоколов ведение культуры тканей мягкой пшеницы in vitro [13,24,29, ЗО, 44,118-120]. Как видно из представленных в (Табл. 1 .III) данных, по использованию различных фитогормонов, существует большое количество способов увеличения регенерационного потенциала пшеницы для различных сортов. Регенерация пшеницы в большей степени, чем другие факторы определяет эффективность трансформации.
Оптимизация параметров баллистической трансформации мягкой пшеницы
Основа системы биобаллистической трансформации состоит в эффективной доставке векторных конструкций в клетки мишени, компетентные к регенерации растений. Однако проникновение металлических микрочастиц в клетку путем пробивания клеточной стенки наносит повреждения, связанные с разрушением клеточных структур. Главной задачей оптимизации параметров трансформации является поиск параметров сочетающих максимальную степень доставки векторных конструкций в ядро клетки, и при этом наносящих наименьшие повреждения живой ткани.
Для оптимизации параметров баллистической трансформации сортов мягкой пшеницы проведена сравнительная оценка влияния двух физических параметров, влияющих на доставку ДНК (кассет экспрессии) в компетентные к регенерации проростков клетки каллуса, полученных из незрелых зародышей. Величина избыточного давления гелия при выстреле - 5, 6, 7 и 8 атмосфер, и расстояние от источника частиц (сопло фильтродержателя) до ткани мишени - 10,12 и 14 см.
Для баллистической трансформации использовали векторную конструкцию pUbilGUS, содержащую ген uidA, кодирующий репортерный белок (3-глюкуронидазу, под контролем конститутивного убиквитинового кукурузного промотора.
В качестве биологического параметра, влияющего на частоту доставки кассеты экспрессии в компетентные к регенерации клетки, оценивали влияние время культивирования растительного экспланта до момента трансформации, Морфогенные каллусы, полученные из незрелых зародышей на 4, 7, 10 и 14 после их посадки на среду индукции каллусообразования трансформировали методом биобаллистики. Биобаллистическую трансформацию сорта Эстер проводили на 4, 7 и 10 день после посадки на среду индукции каллусообразования (Рис. 2.IV).
Оценка эффективности доставки генов проводилась с помощью выявления и подсчета количества синих участков - мест транзиентной экспрессии гена uidA через 48 часов после биобаллистической обработки. Следует отметить, что выбор векторной конструкции pUbilGUS был не случаен, поскольку для репортерной системы р-глюкуронидазы разработана чувствительная методика оценки экспрессии in situ. Гистохимического окрашивания растительных эксплантатов проводилось по методике Джеферсона с соавторами (1987) с использованием реактива X-gluc в качестве красителя [65].
Высокий уровень транзиентной экспрессии маркерного гена обнаружены при использовании трех пар параметров биобаллистики: 5 атм. и 10 см; 6 атм. и 12 см; 8 атм. и 14 см; (Рис. 3.IV, 4.IV) (Табл. 4-6.IV). Полученные результаты свидетельствуют о том, что оптимальным для доставки кассет экспрессии является использование давления гелия 6 атм. и 12 см расстояния до ткани мишени и морфогенетических каллусов на 10 и 14 день культивирования эксплантатов на среде индукции каллусообразования (А). Следует отметить, что количественный показатель (число участков транзиентной экспрессии) коррелирует с генотипом растения. Так, для сорта Лада выявлено более 500 случаев доставки кассет экспрессии на -3-4 мм2 поверхности, а для сортов Мис и Эстер 223.3 и 366.3, соответственно. Для сорта Мис также отмечен второй максимум транзиентной экспрессии соответствующий сочетанию параметров 14 см и 8 атм. (Табл. 4-6.IV.). Рис. 2.IV Морфогенетические каллусы, подготовленные к баллистической трансформации N(GUS) количество очагов транзиентной экспрессии гена uidA. Дни - время, прошедшее с момента инициации культуры тканей Рис. 3.IV Определение оптимального срока развития каллуса пшеницы для биобаллистической генетической трансформации пшеницы при использовании трех пар оптимизированных физических параметров баллистики Рис. 4.IV Транзиентная экспрессия маркерного гена uidA В условиях нашего эксперимента сочетание параметров 10 см и 6 атм. неэффективны для биобаллистической трансформации мягкой пшеницы. Таким образом, впервые показано, что оптимальным сочетанием физических параметров биобаллистической трансформации пшеницы для биобаллистической конструкции PIG, являются расстояние от источника частиц до ткани мишени 12 см и давление гелия при выстреле 6 атм. Оптимальным временем для генетической трансформации пшеницы является 10-14 сутки с момента инициации культуры.
