Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1 Получение трансгенных растений: общие сведения 14
1.2 Наследование чужеродных генов и вариабельность их экспрессии у трансгенных растений 20
1.3 Инактивация чужеродных генов в растительном геноме 24
1.4 Молекулярно-генетические механизмы инактивации чужеродной ДНК в ядерном геноме трансгенных растений 32
1.4.1 Структура и местоположение экзогенной ДНК в растительном геноме 32
1.4.2 Замолкание экспрессии трансгена и модификация ДНК 34
1.4.3 Мутации растительных генов, влияющих на процесс инактивации экспрессии чужеродной ДНК 40
1.5 Примеры инактивации экспрессии множественных копий собственных * растительных генов 50
1.6 Инактивация экспрессии множественных копий генов у грибов-аскомицетов 52
1.7 Использование феномена инактивации экспрессии множественных копий генов для целенаправленного выключения экспрессии растительных генов 54
1.8 Стратегия предотвращения инактивации целевых генов в трансформированных растениях 56
ГЛАВА 2. Материалы и методы 62
2.1 Получение трансгенных растений табака 62
2.2 Типы генетических конструкций 63
2.3 Гибридологический анализ трансгенных растений табака 65
2.4 Определение активности неомицинфосфотрансферазы II in situ 67
2.5 Флуориметрическое определение активности |3-глюкуронидазы в листьях трансгенных растений табака 68
2.6 Выделение геномной ДНК из листьев табака 69
2.7 Саузерн блот гибридизация геномной ДНК трансгенных растений табака 70
2.8 Выделение РНК из растительной ткани и точечный Нозерн блоттинг 70
2.9 Подтверждение наличия дупликаций в области инсерции Т-ДНК с помощью метода ПЦР 71
2.10 Проверка исходных трансформантов на присутствие в растительном геноме векторных последовательностей с помощью метода ПЦР 72
2.11 Электрофоретический анализ ДНК 73
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 74
3.1 Стабильность экспрессии маркерного гена прШ у гибридов от скрещивания трансгенных растений табака с одной инсерцией Т-ДНК 74
3.2 Анализ стабильности наследования гена прШ у трансгенных растений табака со множественными инсерциями Т-ДНК 81
3.3 Моделирование влияния дупликации в структуре Т-ДНК на стабильность экспрессии маркерных генов nptll и uidA в трансгенных растениях табака 87
3.3.1 Сравнительный анализ стабильности экспрессии гена nptll в первом и втором поколениях от самоопыления трансгенных растений табака (с одной копией гена uidA и с дупликациями данного гена в составе Т-области) 87
3.3.2 Анализ активности ферментов (З-глюкуронидазы и NPTII в двух группах трансгенных растений табака (с одной копией гена uidA и прямой дупликацией данного гена) 92
3.3.3 Анализ стабильности экспрессии гена nptll у гибридов Fi от различных типов скрещиваний 98
3.3.4 Встраивание векторных последовательностей в растительный геном исходных трансгенных растений табака 110
3.4 Мозаичный характер проявления экспрессии гена nptll в трансгенных растениях табака модельной линии Nu 21 113
Заключение 144
Выводы 148
Список цитируемой литературы
- Получение трансгенных растений: общие сведения
- Получение трансгенных растений табака
- Стабильность экспрессии маркерного гена прШ у гибридов от скрещивания трансгенных растений табака с одной инсерцией Т-ДНК
- Анализ активности ферментов (З-глюкуронидазы и NPTII в двух группах трансгенных растений табака (с одной копией гена uidA и прямой дупликацией данного гена)
Введение к работе
За последнее десятилетие в ведущих биотехнологических центрах мира интенсивно ведутся работы по модификации ядерного генома высших растений с применением методов генной инженерии. При создании трансгенных растений и их внедрении в сельское хозяйство как коммерческих культур наиболее важным моментом является достижение высокого и стабильного уровня экспрессии перенесенных целевых генов как среди исходных трансформантов и их потомков от самоопыления, так и у гибридов от их скрещивания. Исследования стабильности экспрессии и наследования чужеродной ДНК в геноме трансгенных растений показали, что, как правило, они наследуются по классическим законам Менделя как доминантные мутации (Potrykus et al, 1985; Budar et al, 1986). Однако уже через несколько лет после получения первых трансформантов исследователи столкнулись с явлением вариабельности экспрессии чужеродных генов и феноменом неменделевского наследования, связанного с потерей экспрессии ("замолканием") трансгенов (Potrykus et al, 1985; Budar et al, 1986; Deroles, Gardner, 1988). С начала 1990-х годов и до настоящего времени продолжается активное исследование феномена инактивации и изменений в экспрессии перенесенных генов у генетически модифицированных растений (Matzke et al, 1989, 2000, 2004; Mittelsten Scheid et al, 1991; Vance, Vaucheret, 2001).
Частота инактивации гетерологичных генов в первом поколении от самоопыления исходных трансформантов, полученных с помощью агробактериальной трансформации, может составлять немногим более половины случаев по данным разных исследований (\ Л \х et al, 1986; Deroles, Gardner, 1988; Meza et al, 2001; Sallaud et al, 2001V В данную группу в основном входят трансформанты с множественных инсерциями чужеродной ДНК, интегрированными в один или несколько районов растительного генома. Однако известны случаи потери экспрессии транс; с: їв в последующих поколениях при самоопылении моноинсерционных растений (Cherdshewasart et al, 1993; Metz et al, 1997; Дейнеко и др., 1998; McCabe et al, 1999; Fu et al, 2000; Vain et al, 2002; Sallaud et al, 2003) и у гибридов от их скрещиваний (Cherdshewasart et al, 1993; Schmulling, Rohrig, 1995; Charrier et al, 2000). Частота инактивации может существенно возрастать, если в состав генетической конструкции включены тандемные копии генов, как в прямой, так и в обратной ориентации (Wang, Waterhouse, 2000; Ma, Mitra, 2002).
Непредсказуемые изменения в стабильности экспрессии трансгенов как среди потомков от самоопыления, так и у гибридов от скрещиваний трансгенных растений, нежелательны с коммерческой точки зрения и такие трансформанты необходимо выбраковывать в дальнейшей селекционной работе. Однако трансгенные растения с нестабильным уровнем экспрессии чужеродных генов представляют несомненный интерес в качестве моделей для исследования причин и механизмов инактивации экспрессии рекомбинантных генов, что вносит существенный вклад в понимание молекулярно-генетических механизмов регуляции экспрессии растительных генов (Fagard, Vaucheret, 2000; Matzke et al, 2000) и способов защиты растительного генома от амплификации транспозонньгх элементов, вирусов и вироидов (Vance, Vaucheret, 2001).
Актуальность проблемы. Бурное развитие генетической инженерии и биотехнологии, разработка методов переноса генетического материала в растительную клетку позволило модифицировать геном многих видов растений. Трансгенные растения представляют собой яркий пример преодоления физических, эволюционных и генетических барьеров, которые изолируют геномы различных организмов (Miki, McHugh, 2004). К настоящему времени накоплены экспериментальные данные о нестабильности экспрессии чужеродной генетической информации в растительном геноме, связанные, главным образом, с инактивацией и изменениями в экспрессии гетерологичных генов (Flavel, 1994; Matzke, Matzke, 1995; Matzke et al, 2000). На трансгенных растениях табака, риса и Arabidopsis thaliana получены модельные линии, позволяющие изучать данный феномен (Kilby et al, 1992; Matzke et al, 1994a; Voucheret et al., 1994; Davies et al, 1997; Mittelsten Sheid et al, 1998; Fu et al, 2000). Матзцке с соавт. на трансгенном табаке исследовали свойства и структуру трансгенного Н локуса, который включает серию аллелей. Аллели со сложной структурой Т-ДНК (с дупликациями, векторными последовательностями) способны вызывать процесс транс-инактивации других чужеродных генов под управлением NOS промотора нопалинсинтазы A. tumeficeins в геноме гибридов (Matzke et al, 1989, 1994а; Jakowitsch et al, 1999). Достаточно хорошо исследован мультикопийный локус 271, способный вызывать замолкание экспрессии трансгенов, находящихся под управлением 35S промотора ВМЦК у трансгенных растений табака (Vaucheret et al, 1994; Park et al, 1996). Именно на трансгенных растениях петунии и томата в 1990 году впервые был описан феномен ко-супрессии - координированного подавления экспрессии трансгенов и гомологичных им хозяйских генов, связанного с посттранскрипционным разрушением мРНК в цитоплазме (Napoli et al, 1990; Van der Krol et al, 1990; Smith et al, 1990). Данное явление в настоящее время обнаружено у нематоды Caenorhabditis elegans (Fire et al, 1998), Drosophila melanogaster (Misquitta et al, 1999; Pal-Bhadra et al, 2002), Trypanosome brucei (Ngo et al, 1998), Paramecium (Ruiz et al, 1998), млекопитающих (Wianny et al, 2000) и получило название РНК интерференция.
На основе феномена инактивации экспрессии трансгенов разработаны рекомендации для создания различных генетических конструкций, как обеспечивающих достаточно высокий уровень экспрессии гетерологичного белка в трансформантах, так и целенаправленно вызывающих инактивацию экспрессии определенных растительных генов (Wesley et al., 2001; Gossele et al., 2002; Stoutjesdijk et al, 2002; Brummel et al, 2003).
Сходный феномен инактивации множественных копий генов в ядерном геноме в настоящее время активно исследуется у низших грибов Neurospora crassa (Selker, 1997), Ascobolus immerses (Rhounim et al, 1992), Coprinus cinereus (Freedman, Pukkila, 1993), Magnoporte grisea (Ikeda et al, 2002) и Podospora anserine (Graia et al, 2001). Показано, что интеграция множественных тандемных копий гена white в геном Drosophila melanogaster приводила к нарушению стабильности экспрессии трансгена, что проявлялось либо как мозаицизм, либо как отсутствие ожидаемого фенотипа (Dorer, Henikoff, 1997). Авторами была установлена отрицательная корреляция между числом встроенных копий трансгена и стабильностью его экспрессии. Взаимосвязь между числом копий гена и уровнем его экспрессии обнаружена и для ряда собственных растительных генов (Todd, Vodkin, 1996; Luff et al, 1999). Так ген pail-pai4 A. thaliana линии Wassilewskija, организованный в виде инвертированного повтора, подавляет экспрессию трех гомологичных однокопийных генов pail, pail, раіЗ линии Colombia при объединении их в геноме гибридов (Luff et al, 1999).
Таким образом, в связи с интенсивным развитием генетической инженерии и биотехнологии растений проблема инактивации экспрессии чужеродных генов в трансгенных растениях представляется весьма актуальной. Важность данных исследований очевидна, так как усилия многих исследователей по реконструкции генома растений могут не привести к желаемым результатам. Исследования феномена инактивации экспрессии чужеродных генов в геноме трансгенных растений вносят существенный вклад и в решение фундаментальных задач - выявлены новые механизмы регуляции экспрессии растительных генов и устойчивости к вирусам, ТЭ, основанные на гомологии нуклеотидной последовательности (Fagard, Vaucheret, 2001; Vance, Vaucheret, 2001; Matzke, Matzke, 2004). Однако, несмотря на очевидный прогресс данного научного направления, остается еще много неясных вопросов. Поэтому изучение стабильности экспрессии чужеродных генов у трансформантов и их потомков, у гибридов от различных видов скрещиваний, получение новых модельных систем на трансгенных растениях представляется чрезвычайно актуальным.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение стабильности экспрессии чужеродных генов у трансгенных растений табака {Nicotiana tabacum L.) в поколениях от самоопыления и гибридах от различных типов скрещиваний. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1. Провести гибридологический анализ стабильности экспрессии маркерного гена nptll у трансгенных растений табака с одной инсерцией Т-ДНК в ядерном геноме.
2. Проанализировать стабильность наследования гена nptll у трансгенных растений табака с множественными событиями интеграции Т-ДНК.
3. Выделить модельные линии трансгенных растений табака, содержащих в составе области Т-ДНК прямые или инвертированные повторы гена uidA, с нестабильным характером экспрессии маркерных генов.
4. Провести гибридологический анализ наследования мозаичного характера проявления экспрессии гена nptll в трансгенных растениях табака модельной линии Nu 21.
Научная новизна и практическая ценность. Для изучения наследования и стабильности экспрессии чужеродных генов были выделены модельные линии трансгенных растений табака: 1) трансгенные растения с одиночными и множественными вставками Т-ДНК; 2) трансформанты, имеющие в геноме Т-ДНК инсерцию с дупликацией гена uidA и одной копией гена nptll; 3) трансгенное растение табака Nu 21 с мозаичным характером проявления экспрессии маркерного гена nptll. В исследовании представлены различные варианты организации инсерций Т-ДНК, при этом, использование маркерных генов позволило на больших выборках проследить особенности их наследования в поколениях и гибридах трансгенных растений. Проведен гибридологический анализ характера наследования маркерного гена nptll в поколениях от самоопыления исходных трансформантов, а так же гибридов от различных видов скрещиваний. Установлено, что частота инактивации гомологичных трансгенов существенно возрастает в геноме гибридных растений. Впервые показано, что наличие дупликации гена uidA в составе Т-ДНК инсерций оказывает существенное влияние на стабильность экспрессии рядом расположенного другого маркерного гена nptll, при этом инактивированное состояние по гену uidA влияло на стабильность экспрессии гена nptll преимущественно в гемизиготе. Впервые проведен гибридологический анализ наследования мозаичного характера экспрессии маркерного гена nptll у потомков (Тг Т4) и гибридов от скрещиваний с диким типом трансгенных растений табака. Отобраны гибридные комбинации и потомки от самоопыления, представляющие несомненный интерес для дальнейшего более детального изучения молекулярно-генетических механизмов инактивации экспрессии трансгенов.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на следующих конференциях, симпозиумах и конгрессах: международной конференции, посвященной памяти академика А.А. Баева. Москва, 20-22 мая 1996 г.; German-Russian Cooperation in Biotechnology. Workshop IV. Russia. St.-Peterburg, October 10-13, 1996 г.; международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда». Москва, 1997 г.; международной конференции «Новые направления биотехнологии». Москва, 27-29 апреля 1998 г.; International Congress «Plant Biotechnology and in vitro biology in the 21st century». Jerusalem, Israel, June 14-19, 1998 г.; всероссийском симпозиуме "Изучение генома и генетическая трансформация растений". Иркутск, 23-27 августа 1999 г.; II съезде Всесоюзного Общества Генетиков и Селекционеров (ВОГИС). Санкт-Петербург, 1-5 февраля 2000 г.; конференции молодых ученых, посвященной 100-летию со дня рождения М.А. Лаврентьева. Новосибирск, 4-6 декабря 2000 г.; международном симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология», Москва (18-21 ноября) - Минск (22-24 ноября), 2001 г.; 1-м международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития». Москва, 14-18 октября 2002 г.; 8-й международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». Саратов, 9-13 сентября 2003 г.); III съезде ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития». Москва, 6-12 июня 2004 г.; международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология». Минск, 24-26 ноября 2004 г.. Материалы диссертационной работы представлялись в устных докладах на отчетных сессиях ИЦиГ СО РАН в 2001, 2004 гг..
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 статей.
Deineko Е., Zagorskaya A., Filipenko Е., Filipenko М., Novoselya Т., Kochetov А., Komarova М., Shumnyi V. Instability of nptll gene expression in the progeny of transgenic tobacco plants {Nicotiana tabacum L. and N. plumbaginifolia L.) II Biotechnology and biotechnological equipment. 1996. N. 4. P. 89-92.
Дейнеко E.B., Новосели T.B., Загорская A.A., Филипенко Е.А., Шумный В.К. Стабильность экспрессии гена nptll в популяции трансгенных растений табака // ДАН. 1999. Т. 369. С. 420-423.
Новоселя Т.В., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Стабильность экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.) с множественными инсерциями Т-ДНК // Генетика. 2000. Т. 36. 27-430.
Дейнеко Е.В., Новоселя Т.В., Загорская .л.л.. Филипенко Е.А., Шумный В.К. Нестабильность экспрессии чужеродных ген, тпансгенных растений табака // Физиология растений. 2000. Т. 47. №. 3. С. 394
Дейнеко Е.В., Новоселя Т.В., Загорская •,.. Филипенко Е.А., Пухначева Н.В., Шумный В.К. Инактивирование чужеродных генов в геноме трансгенных растений // Изучение генома и генетическая трансформация растений. Новосибирск: Наука, 2001.С. 132-142.
Novoselia T.V., Deineko E.V., Filipenko E.A., Shumnyi V.K. Expression stability of marker gene nptll in transgenic plants Nicotiana tobacum L. with single T-DNA insertion II Biotechnology and biotechnological equipment. 2001. V.15. N.2. P. 3-7.
Новосели T.B., Дейнеко E.B. Моделирование нестабильной экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака // Физиология растений. 2002. Т. 49. № 3. С. 437-443.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (276 наименований). Работа изложена на 172 страницах, включает 29 рисунков и 26 таблиц в тексте диссертационной работы.
Благодарности. В разные периоды работа была поддержана отечественными грантами: РФФИ (№96-04-51075) «Наследование и стабильность экспрессии чужеродных генов в геноме трансгенных растений: молекулярно-генетический анализ гена nptll у трансгенных растений табака» (исполнитель); РФФИ (№97-04-48763) «Инактивирование чужеродных генов в геноме трансгенных растений: молекулярно-генетические механизмы» (исполнитель); РФФИ (№97-04-49334) «Нестабильность экспрессии чужеродных генов в поколениях трансгенных растений: исследование роли дупликаций в структуре Т-ДНК» (исполнитель); РФФИ (№00-04-49557) «Молекулярно-генетические механизмы функционирования чужеродных генов в геноме трансгенных растений» (исполнитель); грантом для научных проектов молодых ученых СО РАН, посвященном 100-летию со дня рождения академика М.А. Лаврентьева, 2000-2001 г. (руководитель и исполнитель); РФФИ (00-15-97968) -«Особенности преобразования геномов и функционирование генов в процессе хромосомной и генной инженерии растений» (исполнитель); госконтракт 43.050. 11.1537 от 05.02.2002 г. «Молекулярно-биологический анализ генетических факторов, влияющих на "замолкание" целевого гена в ряду поколений трансгенных растений табака» (исполнитель); № 25.8 программы РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека» (направление: «Фундаментальные проблемы трансгенеза растений и животных») (исполнитель).
Автор выражает искреннюю благодарность и признательность научному руководителю д.б.н. Е.В. Дейнеко, сотрудникам лаборатории гетерозиса растений ИЦиГ СО РАН Е.А. Филипенко, А.А. Загорской, Ю.В. Сидорчуку и Н.В. Пухначевой, сотрудникам сектора генетической инженерии растений ИЦиГ СО РАН к.б.н. А.В. Кочетову, к.б.н. М.Л. Комаровой, Е.А. Трифоновой и А.В. Романовой; а так же сотруднику лаборатории фармакогеномики ИХБиФМ СО РАН к.б.н. М.Л. Филипенко, участвовавших в выполнении ряда экспериментов и в обсуждении полученных данных, нашедших отражение в совместных публикациях.
Получение трансгенных растений: общие сведения
Технологии получения трансгенных растений основаны на переносе в растительный геном рекомбинантных генов из разных гетерологичных систем (вирусов, микроорганизмов, млекопитающих и др.). Предложены два основных способа переноса чужеродной генетической информации: 1) трансформация с помощью почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens (Zambryski et al, 1983; Zupan et al, 2000); 2) прямой перенос генетических конструкций с использованием таких методов, как бомбардировка протопластов микрочастицами с нанесенными на них векторными ДНК (Christou, 1992), использование липосом (Deshayes et al, 1985), микроинъекции в клетки растений (Crossway et al., 1986), электропорация протопластов (Fromm et al, 1985) и др. Выбор способа трансформации растений зависит от многих факторов: разработки методов культивирования и регенерации in vitro для данного вида растения, от чувствительности к почвенным бактериям и возможностей экспериментатора. Рассмотрим процесс переноса и интеграции Т-ДНК при агробактериальной трансформации с точки зрения тех событий, которые могут влиять на экспрессию перенесенных генов.
Перенос и встраивание Т-ДНК в растительный геном при агробактериальной трансформации. Представители рода Agrobacterium содержат уникальный природный вектор для горизонтального переноса бактериальных генов в геном высших растений, обозначенного термином «генетическая колонизация». Роль данного вектора выполняет Ті (tumor inducing) плазмида, имеющая в своем составе несколько районов: vir (virulence) область, кодирующая 6 генов вирулентности (virA, virB, virC, virD, virE, virG), Т-область (transferred DNA, Т-ДНК), ограниченная небольшими прямыми повторами 25 п.н., Tra-область с генами коньюгативного переноса и OriV - область репликации плазмиды. В природных штаммах область Т-ДНК включает гены синтеза опинов и белков (онкогенов), участвующих в биосинтезе растительных гормонов; экспрессия этих генов вызывает неконтролируемую пролиферацию растительных клеток (Чумаков, 2001; Zhu et al, 2000). Установлено, что перенос Т-ДНК в растительную клетку определяется только фланкирующими правым и левым повторами, поэтому гены заключенные в этой области заменяются другими, представляющими интерес для исследователя (целевыми и маркерными).
Процесс переноса Т-области условно может быть разделен на два этапа: первый - бактериальный, связанный с образованием одноцепочечной Т-ДНК и второй -растительный, включающий непосредственно процесс переноса гетерологичных генов в цитоплазму и ядро растительной клетки, а так же встраивание их в геном. На первом этапе активация генов vir области фенольными соединениями, выделяющимися при повреждении клеточной стенки растительных клеток, запускает процессинг Т-ДНК по типу коньюгативного бактериального переноса, в результате которого образуются одноцепочечные молекулы ДНК (Tinland, 1996; Zupan et ah, 2000). Механизм переноса Т-области из бактерии в растительную клетку еще недостаточно исследован, предполагают, что в образовании мембранного канала участвуют как бактериальные белки, так и белки растительного происхождения (Tinland, 1996; Dumas et ah, 2001). В цитоплазму растительных клеток Т-ДНК попадает в виде одноцепочечной молекулы, защищенной от действия экзонуклеаз белком virE и с ковалентно прикрепленным на 5 конце белком virD2 (Citovsky et ah, 1989; Tinland et ah, 1994; Rossi et ah, 1996; Tinland, 1996). Механизм проникновения данного нуклеопротеинового комплекса в ядро реципиентной растительной клетки так же мало изучен, известно, что оба белка virE и virD2 содержат сигнальные последовательности ядерной локализации белка (NLS) (Citovsky et ah, 1992; Howard et ah, 1992).
Встраивание чужеродных генов в растительный геном происходит в большинстве случаев по механизму негомологичной рекомбинации, при котором необходим лишь небольшой участок гомологии порядка 6-7 п.н. между растительной ДНК и краевыми последовательностями переносимых векторов (Gheysen et ah, 1991; Mayerhofer et ah, 1991). Известно, что данный процесс является многоступенчатым и в нем принимают участие как бактериальные белки virE и virD2, так и растительные ферменты, отвечающие за репликацию и репарацию ДНК (Tinland, 1996; Salomon, Puchta, 1998; Ziemienowicz et ah, 2000; Chilton, Que, 2003; Gelvin, 2003). На этапе интеграции могут происходить ошибки, ведущие к встраиванию усеченных фрагментов Т-ДНК (Nacry et ah, 1998; Jakowitsch et ah, 1999), образованию конкатамеров множественных тесно сцепленных копий гетерологичных генов (Pawlowski et al, 1998; Jakowitsch et al, 1999; Kohli et al, 1999) и перестроек в растительной ДНК на правой или/и левой границах Т-ДНК в виде делеций различной протяженности, прямых и инвертированных дупликаций (Kumar, Fladung, 2001а; Svitashev et al, 2002; Forsbach et al, 2003; Windels et al, 2003).
В ядерный геном растительных клеток могут встраиваться от одной до нескольких копий Т-ДНК. На основании результатов анализа популяций исходных трансгенных растений установлено, что примерно в 40-60% выявляются растения с одной вставкой трансгена, в остальных случаях - с множественными Т-ДНК инсерциями (Budar et al, 1986; Deroles, Gardner, 1988; Herberle-Bors et al, 1988; Van der Hoeven et al, 1994; Sallaud et al, 2003). Известно, что встраивание множественных тесно сцепленных копий гетерологичных генов часто наблюдается при прямом переносе генов в растительную клетку (Pawlowski et al, 1998; Kohli et al, 1999; Vain et al, 2002). Довольно высокий процент растений с тандемными повторами в одном локусе регистрируется и при агробактериальной трансформации (Jones et al, 1987; Jorgensen et al, 1987; Kumar, Fladung, 2001a). Наличие множественных копий в составе чужеродной инсерции может оказывать влияние на уровень и стабильность экспрессии перенесенных генов. Отмечена отрицательная корреляция между уровнем экспрессии трансгенов и числом их копий в геноме (Hobbs et al, 1990; Assaad et al, 1993; Jakowitsch et al, 1999; Wang et al, 2000; Ma et al, 2002).
Образование тандемных последовательностей перенесенных генов в растительном геноме возможно в следующих случаях: 1) при репликации Т-области; 2) при лигировании Т-ДНК; 3) при одновременном встраивании нескольких цепей Т-ДНК. Данные предположения основаны на результатах анализа механизмов встраивания фрагментов экзогенной ДНК в растительный геном и данных о нуклеотидных последовательностях районов стыков растительной ДНК и Т-ДНК, а так же участков между Т-ДНК в сложно организованных локусах.
Получение трансгенных растений табака
Получение трансгенных растений табака В качестве исходного материала для получения трансгенных растений использовали линию SRI Nicotiana tabacum L. (семена любезно предоставлены доктором Р. Менделем, Институт генетики и растительных ресурсов (IPR), Гатерслебен, Германия). Трансформанты получали методом агробактериальной трансформации листовых дисков по стандартной методике (Дрейпер и др., 1991) с использованием штамма Agrobacterium tumefaciens С58С1 Rif PGV 2260) (Deblaere et al., 1987) (штамм был предоставлен М.И. Ривкиным).
Агробактериалъная трансформация растений табака методом "листовых дисков". Экспланты листьев стерильного растения табака культивировали совместно с несколькими каплями ночной культуры A. tumefaciens (YEP среда, канамицин 100 мг/мл, рифампицин 50 мг/мл) в чашках Петри на жидкой среде MS (Murashige, Skoog, 1962) с добавлением 20 г/л сахарозы в течение 1-2 суток. Затем листовые диски отмывали в стерильной воде и оставляли на 1-2 суток на жидкой среде MS (с добавлением 20 г/л сахарозы, 500 мг/л клафорана для подавления роста бактерий). Экспланты подсушивали на фильтровальной бумаге и переносили в чашки Петри с агаризованной средой ТІ (MS с добавлением 20 г/л сахарозы, 8 г/л агара, 1 мг/л БАП, 0,1 мг/л НУК, 500 мг/л клафорана, 100 мг/л канамицина). Через 4-5 недель каллусы переносили в пробирки со средой Т2 (MS с добавлением 20 г/л сахарозы, 8 г/л агара, 0,1 мг/л БАП, 500 мг/л клафорана, 100 мг/л канамицина) для побегообразования. Зеленые побеги переносили для укоренения в пробирки со средой ТЗ (MS с добавлением 20 г/л сахарозы, 8 г/л агара, 500 мг/л клафорана, 100 мг/л канамицина). Укоренившиеся трансформанты переносили в искусственный грунт (керамзит/вермикулит). Растения выращивали в условиях гидропонной теплицы, при температурном режиме 24/18 С (день/ночь) и фотопериоде 16/8 часов (день/ночь).
Исходные трансгенные растения были обозначены как Т0 (трансформант), а растения, полученные от самоопыления исходного трансформанта, соответственно обозначены Ті (первое поколение), Т2 (второе поколение) и т.д.
Для тестирования потомков трансгенных растений по устойчивости к канамицину, простерилизованные семена табака (3 минуты в 96% этиловом спирте) высевали в чашку Петри на среду MS с добавлением сахарозы 20 г/л, агара 8 г/л и концентрацией канамицина 200 мг/л. Через 4-6 недель подсчитывали соотношение Km-устойчивых (зеленых) и Km-неустойчивых (белых) растений. Соответствие фактического расщепления теоретическому оценивали по критерию %2, достоверность различий между группами от скрещиваний растений Т] по стабильности экспрессии гена прШ оценивали по формуле Фишера (Урбах, 1964).
Регенераты из потомков Ті исходного трансформанта Nu 21 были получены введением растений в культуру in vitro. Экспланты листьев стерильных растений І ! культивировали на среде MS с добавлением 20 г/л сахарозы, 8 г/л агара, 1 мг/л БАП, 0,1 мг/л НУК для стимуляции образования каллусов. Через 2-3 недели, по мере образования каллусов, экспланты переносили на среду MS с добавлением 20 г/л сахарозы, 8 г/л агара, 0,1 мг/л БАП для побегообразования. Побеги переносили для укоренения на среду MS с добавлением 20 г/л сахарозы, 8 г/л агара, 200 мг/л канамицина. YEP среда - 1% дрожжевой экстракт, 1% бакто-триптон, 0,5% NaCI, 1,5% бакто-агар.
Для трансформации табака были использованы различные типы генетических конструкций, сконструированных в секторе генной инженерии растений ИЦиГ СО РАН д.б.н. М.И. Ривкиным, к.б.н. А.В. Кочетовым, к.б.н. М.В. Пилюгиным, Е.А.Трифоновой, В.В. Лукашевой (1991-1995 г.г.).
Для анализа стабильности экспрессии маркерного гена прШ использовали две группы трансгенных растений табака, полученных ранее (Deineko et al, 1996; Дейнеко и др., 1999). Схемы Т-области генетических конструкций приведены нарис. 8. В растения с одной инсерцией трансгена (Nu 41, Nu 44, Nu 45, Nu 48, Nu 49, Nu 411) перенесена Т-область плазмиды pGA-nuclB, включающая маркерный ген nptll E.coli под контролем промотора нопалинсинтазы Ті плазмиды A. tumefaciens и ген панкреатической нуклеазы быка под контролем двойного 35S промотора ВМЦК. У растений под номерами 43, 44, 45, 410, 412, 78, 714 с множественными вставками чужеродной ДНК в ядерном геноме, область Т-ДНК включала маркерный ген nptll E.coli, ген uidA Е. coli и ген Р -интерферона человека под управлением двунаправленного MAS промотора гена маннопинсинтазы Ті плазмиды A. tumefaciens. В растительный геном трансгенного растения табака Nu 21 была перенесена генетическая конструкция рСП-nuclS с маркерным геном прШ и целевым геном секреторной эндонуклеазы Serratia marcescens под управлением двунаправленного MAS промотора гена маннопинсинтазы Ті плазмиды A. tumefaciens.
Т-область модельных генетических конструкций pBil21, pBi-(Glu)2-D, рВі-(Glu)2-R включала маркерный ген nptll, под контролем промотора нопалинсинтазы Ті плазмиды A. tumefaciens, ген uidA Е. coli в виде уникальной (pBil21) или повторенной последовательности (pBi-(Glu)2-D - прямая дупликация, pBi-(Glu)2-R -инвертированная дупликация) под контролем 35S промотора ВМЦК (рис. 9).
Стабильность экспрессии маркерного гена прШ у гибридов от скрещивания трансгенных растений табака с одной инсерцией Т-ДНК
Для электрофоретического разделения ДНК, обработанной рестриктазами, мы использовали 0,8% агарозный гель, для разгонки продуктов ПЦР реакции величиной 280-610 п.н. - 2,0% агарозный гель, размером 1247 п.н. - 1% агарозный гель, приготовленные на 1 х ТАЕ буфере (х 50 ТАЕ: 2М трис-НО, рН 8,0; 1,56М уксусная кислота; 0,05М EDTA, рН 8,0; рН буфера 7,6). Для разделения фрагментов 280-610 п.н. так же использовался 6% полиакриламидный гель, приготовленный на 0,5 х ТВЕ буфере (х 10 ТВЕ: 89мМ трис-HCI, рН 8,0; 89мМ борная кислота; 2мМ EDTA, рН 8,0; рН буфера 8,3). К образцам при нанесении на гель добавляли 1/10 объема краски (30% глицерин, 0,3% бромфеноловый синий, 0,3% ксилен-цианол). Гель окрашивали в растворе бромистого этидия (0,1 мкг/мл, 10 минут) и просматривали в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе (Т2201, Sigma) и фотографировали на установке Gellmage.
Стабильность экспрессии маркерного гена nptlly гибридов от скрещивания трансгенных растений табака с одной инсерцией Т-ДНК Известно, что одним из условий инактивации трансгенов является наличие множественных инсерций в геноме трансгенного растения. В связи с этим представляет интерес проанализировать стабильность экспрессии гена прШ при объединении двух независимых встроек экзогенной ДНК в геноме гибридных растений. В табл. 4 представлены результаты расщепления в первом поколении от самоопыления исходных трансгенных растений, отобранных для проведения скрещиваний.
Как видно из результатов табл. 4 у всех шести растений табака Nu 41, Nu 44, Nu 45, Nu 48, Nu 49, Nu 411 расщепление на среде с канамицином соответствовало моногибридному (3Km+:lKm"), что указывало на наследование одной инсерций Т-ДНК.
Результаты анализа соотношений Km+ : Km" потомков во втором поколении от самоопыления анализируемых трансформантов сведены в табл. 5. В зависимости от генотипа выбранного растения Ть расщепление по устойчивости к канамицину соответствовало 3Km+:lKm" (гемизигота по гену nptll), либо все потомки были Кт+ (трансген в гомозиготе). Отклонений от ожидаемого расщепления выявлено не было, что свидетельствовало о стабильной экспрессии маркерного гена в первом и втором поколениях от самоопыления исходных трансгенных растений. сцепления, то теоретически расщепления среди потомков не должно происходить, за исключением случаев сегрегации трансгенов кроссинговером. Как видно из таблицы 6, у большинства растений в F2 проявляется расщепление гена прШ по дигибридному типу. В девяти гибридных комбинациях (18%), из пятидесяти проанализированных, выявлены отклонения от ожидаемого расщепления (выделены в таблице красным цветом). Так у гибрида от скрещивания Nu 45xNu 44(1), разные семенные коробочки с одного и того же растения демонстрировали различные типы расщеплений: по моногибридному типу (3Km+:lKm"), по полигенному типу ( 15Km+:lKm) и по типу двух частично сцепленных локусов (отвергалось расщепление 3Km+:lKm" и 15Km+:lKm"). В обратной комбинации скрещивания Nu 44xNu 45(1) выявлялось расщепление по дигибридному типу. Подобные отклонения в F2 были отмечены и для гибрида Nu 45xNu 44(2). В других случаях, например для комбинаций Nu 41xNu 49(2), Nu 45xNu 411(1), Nu 48xNu 41(2) Nu 48xNu 49(2), Nu 49xNu 44(1), Nu 49xNu 45(1), Nu 49xNu 411(1) наблюдалось расщепление в сторону увеличения числа Кт+ потомков ( 15Km+:lKm"). При этом, у данных гибридов для одного растения гибридной комбинации отмечалось отклонение в расщеплении, а для другого растения этого же варианта - расщепление соответствовало ожидаемому. Для двух гибридов Nu 48xNu 411(1) и Nu 411xNu 41(1) гипотеза о несцепленном наследовании двух инсерции трансгена не принималась, но и не отвергалась.
Данные гибридологического анализа для нескольких гибридных вариантов трансгенных растений были подтверждены Саузерн блот-гибридизацией геномных ДНК. На рис. 12 представлена блот-гибридизация EcoRI-гидролизатов геномной ДНК из листьев трансгенных растений Ті и гибридов F Присутствие одной гибридизационной полосы у растений Т] Nu 49, Nu 44, Nu 45, Nu 411 (дорожки 1-4) указывает на наличие одной инсерции Т-ДНК в ядерном геноме. В гибридных комбинациях Nu 45xNu 411(2), Nu 44xNu 49(1), Nu 49xNu 44(1) (на дорожках 5-7) присутствуют оба фрагмента, представленные у родителей.
Известно, что нарушение стабильности экспрессии перенесенных генов у моноинсерционных трансформантов может происходить как после первого самоопыления трансгенных растений (Ulian et al, 1994; Cherdshewasart et al, 1993; Fu et al, 2000; Vain et al, 2002; Sallaud et al, 2003), так и в последующих поколениях при инбридинге (Cherdshewasart et al, 1993; Дейнеко и др., 1998; McCabe et al, 1999; Fu et al, 2000; Vain et al, 2002). Накоплено много экспериментальных данных о нарушении экспрессии чужеродных генов при наличии одной инсерции в гомозиготном состоянии (Neuhuber et al, 1994; Mueller et al, 1995; Meza et al, 2001; Kloti et al, 2002). В нашем эксперименте анализ поколений Ті и Т2 (гемизигот и гомозигот по Т-ДНК) от самоопыления шести исходных трансформантов выявил стабильную экспрессию маркерного гена nptll.
Анализ гибридов Fb полученных от скрещивания растений Ть гомозиготных по трансгену, не выявил нарушений экспрессии гена nptll. В F2 у основной части гибридных комбинаций в прямом и обратном скрещиваниях маркерный ген наследовался по теоретически ожидаемому дигибридному типу. Поэтому можно предположить, что инсерции трансгена наследовались независимо и Т-ДНК у исходных трансформантов встроились в разные районы ядерного генома.
Интересные на наш взгляд результаты по стабильности экспрессии гена были получены на трансгенных растениях табака (Iglesias et al, 1997). При скрещивании растений Н9 и Н83, гомозиготных по трансгену, в Fi и в F2 наблюдалась стабильная экспрессия гена hpt. Данные инсерции были локализованы в теломерных районах хромосом. Нарушение стабильности экспрессии маркерного гена наблюдали в Fi и в F2 при скрещивании нестабильных (по экспрессии трансгена в гомозиготном состоянии) растений Н59 и НІ I как между собой, так и при скрещивании с растениями Н9 и Н83. Особенно ярко явление инактивации экспрессии гена hpt были выражены в F2.
Анализ активности ферментов (З-глюкуронидазы и NPTII в двух группах трансгенных растений табака (с одной копией гена uidA и прямой дупликацией данного гена)
Стабильность экспрессии гена nptll у гибридов от анализирующего скрещивания исходных трансформантов с нетрансгеннъши растениями табака
Обобщенные данные результатов гибридизации контрольных растений с нетрансгенным табаком (w.t.) представлены в табл. 11. Во всех 12 проанализированных скрещиваниях, представленных прямыми и обратными комбинациями в нескольких повторностях, отмечалось расщепление 1Кт+:1Кт". Только в одном скрещивании в х появлялись мозаичные потомки с частотой 16,4%. Соотношение потомков 1Кт+:1Кш" подтверждало наличие одной встройки Т-ДНК в ядерном геноме исходных трансформантов и свидетельствовало о стабильности экспрессии гена nptll.
В табл. 12 приведены обобщенные данные расщеплений по Km-устойчивости в F] от анализирующего скрещивания исходных трансформантов, несущих две копии гена uidA, с нетрансгенным табаком. Отклонения от ожидаемого расщепления в сторону инактивации экспрессии маркерного гена ( 1Кш :1Кт") наблюдалось в 28,6% (из 14 скрещиваний, представленных прямыми и обратными комбинациями в нескольких повторностях). Данные отклонения проявлялись при скрещиваниях трех трансформантов 16.40, 16.36 и 16.74. Расщепления по моногибридному типу (3Km+:lKm") и по типу двух частично сцепленных инсерций (3Km+:lKm" и 15Km+:lKm" отвергается) у трансгенных растений 16.22 и 16.83 в F] свидетельствовали о встраивании двух Т-ДНК инсерций у исходных трансформантов. Таким образом, в опытной группе растений, у которых ген nptll находится в соседстве с дупликацией гена uidA, среди потомков F] от скрещивания с диким типом происходило нарушение экспрессии nptll гена, что выявлялось по отклонениям от менделевского расщепления и появлению растений-мозаиков, тогда как в контрольной группе растений наблюдалась стабильная экспрессия маркерного гена.
Стабильность экспрессии гена nptll у гибридов при скрещивании исходных трансформантов между собой
Поскольку нестабильный уровень экспрессии чужеродных генов часто связывается с увеличением числа их инсерций в геноме растений, представляло интерес провести сравнительный анализ экспрессии гена nptll у гибридов, полученных от скрещивания между собой исходных трансформантов с уникальными и повторенными последовательностями гена uidA в составе Т-ДНК.
Результаты соотношений Km+:Km" потомков, полученных от скрещиваний трансгенных растений с одной копией гена uidA в структуре Т-ДНК представлены в табл. 13 и табл. 14, где данные расщеплений в F, распределены по группам (отклонения от менделевского наследования; наследование согласно Менделю; процент мозаичных потомков).
Анализируя в целом структуру выборки гибридов, необходимо отметить, что у большей части F] отмечались расщепления согласно Менделю (94,4%). Из 126 прямых и обратных комбинаций скрещиваний только в семи случаях наблюдались отклонения от менделевского расщепления, что составило 5,5% от общего числа проанализированных вариантов и в 7,9% появлялись мозаичные растения (табл. 14). Интересно отметить, что в 4,0% случаев наблюдалось расщепление по дигибридному типу (выделены в табл. 13 зеленым цветом). Данный характер расщепления в контрольной группе трансгенных растений никогда не встречался при анализе потомков Т2 и в F] при скрещивании с диким типом.
В табл. 15 сведены данные расщеплений в Ft при скрещиваниях трансгенных растений табака с тандемным повтором гена uidA в составе инсерции и в табл. 14 результаты распределены по группам. В результате анализа гибридов Ft от скрещивания исходных трансгенных растений табака было выявлено достоверное увеличение до 35,7% доли растений с отклонениями от менделевского расщепления в сторону инактивации экспрессии маркерного гена (табл. 14). Так же достоверно увеличилась частота появления в \ мозаичных потомков до 51,6%. В табл. 15 хорошо прослеживается, что скрещивание с растениями 16.36 и 16.40 приводило к нарушениям менделевского наследования по типу инактивации экспрессии маркерного гена, что проявлялось увеличением доли Кт-неустойчивых потомков( ЗКш:1Кт" и ЗКт+:1Кт" в случаях скрещиваний с растениями 16.22 и 16.83, выделены желтым цветом).
В табл. 16 приведены результаты расщеплений в Fi при скрещиваниях между собой контрольной группы растений и растений с прямой дупликацией гена uidA в составе Т-ДНК и в табл. 14 результаты распределены по группам. Анализ расщеплений в F] показал стабильную экспрессию гена nptll в 89,4% случаев, в 10,6% выявлялись отклонения от ожидаемого расщепления и в 25,1% случаев появляются растения-мозаики, что достоверно отличалось от результатов, полученных от скрещивания контрольной группы трансформантов (табл. 14). Для растений 16.36, 16.40 сохраняется выше описанная тенденция к инактивации экспрессии маркерного гена в Fi (табл. 16, выделено желтым цветом).
Случаи инактивации трансгенов при гибридизации трансгенных растений описаны в экспериментальных работах (Mittelsten Scheid et al, 1991; Cherdshewasart et al, 1993; Van Houdt et al, 2000; Charrier et al, 2000). Так из 189 скрещиваний между собой 19 исходных моноинсерционных трансформантов в 13,2% случаев наблюдалась инактивация экспрессии гена nptll и были выделены растения, скрещивания с которыми с большей частотой приводило к инактивации экспрессии маркерного гена у гибридов (Charrier et al, 2000). Трудно поддается интерпретации факт увеличении числа Кт+ потомков при скрещивании контрольных растений, однако, подобные факты нарушения менделевского расщепления описаны и другими исследователями (Potrykus et al, 1985; Deroles, Gardner, 1988; Pawlowski et al, 1998; Cherdshewasart et al, 1993).
Сравнительный анализ результатов, представленных в табл. 14 свидетельствовал о существенном влиянии дупликаций в составе Т-ДНК на стабильность экспрессии перенесенных генов при объединении в растительном геноме гомологичных последовательностей. Наиболее ярко это проявлялось при скрещиваниях внутри группы трансформантов с дупликацией гена uidA и частота нарушений стабильности экспрессии уменьшалась в 3,5 раза при скрещивании с контрольной группой растений, однако достоверно отличалась от результатов скрещивания внутри контрольной группы растений.
Таким образом, анализ расщеплений в Fb полученных от различных типов скрещиваний трансформантов показывает, что наличие дупликации гена uidA в составе Т-ДНК оказывает существенное влияние на стабильность экспрессии рядом расположенного маркерного гена nptll.
