Введение к работе
В процессе эволюции растения выработали механизмы адаптации к неблагоприятным факторам окружающей среды Вместе с тем многие культурные виды в результате однонаправленного отбора на проявление отдельных признаков утратили устойчивость к стрессовым воздействиям, что существенным образом снижает их продуктивность Сравнение рекордных и стандартных урожаев нескольких видов возделываемых растений показало, что урожаи культурных растений обычно составляют не более 20% от их максимально возможного уровня (Воуег, 1982) Хотя такое уменьшение продуктивности отчасти связано с воздействием биотических факторов (болезней, фитофагов и сорняков), считают, что и абиотические стрессы могут играть существенную роль
При изучении механизмов индукции и поддержания стрессоустойчивости к абиотическим факторам у растений особый интерес вызывает роль пролина в этих процессах Это связано с тем, что содержание свободного пролина в растительных клетках многократно возрастает в ответ на различные стрессорные факторы 1) засуху, 2) засоление, 3) повышение или понижение температуры, 4) токсическое действие тяжелых металлов, 5) недостаток питательных веществ (Кузнецов и Шевякова, 1999) Возможно, поэтому, несмотря на значительное количество работ, посвященных защитному действию пролина, его роль по-прежнему остается во многом не ясной Например, согласно некоторым предположениям, значительное накопление пролина в клетках растений во время стресса является не защитной реакцией, а индикатором повреждения клеток стрессовыми факторами (Lutts et al, 1996, Serraj and Sinclair, 2002)
В растениях накопление пролина во время стресса происходит как за счет увеличения скорости его синтеза, гак и за счет ингибирования его деградации Скорость-лимитирующим ферментом деградации пролина является пролиндегидрогеназа (ПДГ). На сегодняшний момент, однако, нет ясности в вопросе о том, какую роль играет катаболизм пролина в стрессоустойчивости и восстановлении растений после стресса Было выдвинуто предположение о важной роли этого процесса, поскольку деградация пролина сопровождается синтезом АТФ и изменением окислительно-восстановительного потенциала (Hare and Cress, 1997) Для изучения роли ПДГ в стрессоустойчивости растений были получены трансгенные растения арабидопсиса с пониженной активностью этого фермента Однако, снижение активности ПДГ в одном случае приводило к увеличению содержания пролина и повышению стрессоустойчивости (Nanjo et а!, 1999), а в другом такого эффекта не наблюдалось (Маш et al, 2002), что не позволяло делать каких-либо заключений Баланс синтеза и деградации пролина является одним из важных элементов механизма устойчивости к осмотическому стрессу, поэтому проблема взаимосвязи
между ПДГ и стрессоустоичивостью относилось к числу актуальных задач молекулярной генетики растений
Трансгенные растения с супрессированной активностью ПДГ представляют собой адекватную генетическую модель для исследования этой проблемы Мы предполагали, что снижение активности ПДГ может привести к повышению содержания пролина в клетках трансгенных растений в нормальных условиях и, возможно, к повышению их стрессоустойчивости С другой стороны, снижение активности этого фермента могло негативно сказаться на устойчивости к стрессу, например в том случае, если деградация пролина в условиях стресса важна для поддержания адекватного баланса NAD/NADH
Таким образом, цель настоящей работы заключалась в исследовании роли гена ПДГ в устойчивости растений к абиотическим стрессам В рамках данной работы было запланировано решить следующие задачи
Создать генетические конструкции, экспрессия которых в геноме растений будет приводить к супрессии гена пролиндегидрогеназы, отвечающего за деградацию пролина
Получить растения табака, несущие генетические конструкции -супрессоры пролиндегидрогеназы
Исследовать биохимические и физиологические параметры растений-трансформантов, такие как активность пролиндегидрогеназы, содержание пролина, осмотическое давление клеточного сока, солеустойчивость
Научная новизна В результате проведенного исследования создана новая генетическая модель - трансгенные растения табака, несущие гетерологичный антисмысловой супрессор пролиндегидрогеназы Получена новая информация о роли ПДГ в контроле стрессоустойчивости растений показано, что частичная супрессия гена ПДГ сопровождается повышением устойчивости растений к засолению, что позволяет выдвинуть гипотезу о возможности контроля стрессоустойчивости за счет изменения активности этого фермента Предложен новый подход для получения стрессоустойчивых форм растений, основанный на использовании генетических конструкций - супрессоров ПДГ.
Практическая ценность Показано, что супрессоры гена пролиндегидрогеназы могут использоваться для получения генетически модифицированных растений с увеличенной стрессоустоичивостью Создан набор генетических конструкций, которые могут быть использованы для получения стрессоустойчивых форм растений Показана возможность создания достаточно эффективного супрессора на основе гетерологичного гена Разработан подход, позволяющий исключать из состава генетических конструкций маркерные гены устойчивости к антибиотикам и проводить отбор трансформантов непосредственно на стрессовых фонах Подана заявка на патент «Способ получения
трансгенных растений табака с повышенным содержанием пролина» Генетические конструкции, содержащие супрессоры гена пролиндегидрогеназы, переданы и используются в Институте физиологии растений РАН и ВНИИ картофельного хозяйства РАСХН Положения, выносимые на защиту.
Создан антисмысловой супрессор гена ПДГ Показано, что частичная супрессия гена ПДГ увеличивает стрессоустойчивость растений, что подтверждает гипотезу о роли этого гена в контроле стрессоустойчивости
Созданы генетические конструкции, не содержащие генов устойчивости к антибиотикам и несущие минимальное количество чужеродной для растения векторной ДНК Показана возможность отбора и получения трансгенных растений, несущих антисмысловой супрессор ПДГ, на средах, не содержащих антибиотики Апробация работы. Результаты работы докладывались на
российских и международных конференциях. 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых, 2003, конференции МОГиС, 2003, Международной конференции «Биология растительных клеток ш vitro и биотехнология», Саратов, 2003, Съезде ВОГиС, Москва, 2004, III международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов», Украина, Алушта, 2006, Всероссийской конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды», Иркутск, 2007
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ и подана заявка на патент
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы Работа изложена на 108 страницах, включает 21 рисунок и фотографии, 2 таблиц в тексте диссертационной работы Библиографический указатель включает 216 источников
