Содержание к диссертации
Введение
Часть I. Обзор литературы 6
1. Путь биосинтеза L-пролина 6
1.1. у-Глутамилкиназа 8
1.2. у-Глутамилфосфатредуктаза 9
1.3. Пирролин-5-карбоксилатредуктаза 10
1.4. Обходной путь образования Ь-глутамат-5-полуальдегида в клетках Е. 11 coli
1.5. Организация генов пути биосинтеза пролина 12
1.6. Пары токсин-антитоксин 13
1.7. Регуляция пути биосинтеза пролина 15
2. Транспорт и деградация пролина 19
2.1. Транспорт пролина и осморезистентность 19
2.2. Деградация пролина 20
3. Продуценты пролина 21
4. Предшественники пролина 24
4.1. Глутаминовая кислота - структурный предшественник пролина 24
4.1.1. Глутаматдегидрогеназа 25
4.1.2. Глутаматдекарбоксилазы 26
4.2. а-Кетоглутаратдегидрогеназа. 27
4.3. Фосфопируваткарбоксилаза 29
Часть П. Материалы И Методы 32
1. Бактериальные штаммы, фаги, плазмиды и среды 32
1.1. Получение мутантов 35
1.2. Получение мутантов, резистентных к структурным аналогам пролина. 35
2. Методы и ферменты, использованные при работе с ДНК 35
2.1. Трансформация, трансдукция, клонирование in vivo 36
3. Ферментации 36
3.1. Определение концентрации аминокислот в культуральной жидкости 36
4. Определение активностей ферментов
4.1. Приготовление экстрактов клеток для определения активности ферментов 37
4.2. Определение активности у-глутамилкиназы (ГК) 37
4.3. Определение активности у-глутамилфосфатредуктазы (ГФР) 38
4.4. Определение активности Д'-пирролин^-карбоксилатредуктазы 38 (ПКР)
4.5. Определение активности фосфопируваткарбоксилазы (ФПК) 39
4.6. Определение активности а-кетоглутаратдегидрогеназы 40
4.7. Определение активности глутаматдегидрогеназы (ГДГ) 41
5. Использованные программы компьютерного анализа. 41
Часть III. Результаты И Обсуждения 42
1. Усиление биосинтеза L-пролина в штамме Е. coli К12 за счет снятия 42 ретроингибирования ферментов этого пути, амплификации содержащих необходимые мутации генов пути биосинтеза пролина, а также блокирования известных путей деградации L-пролина.
1.1. Селекция и свойства полученных аналогорезистентных мутантов штамма E.coli К12 - продуцентов пролина.
1.2. Получение ауксотрофных мутантов Е. coli К12 по L-пролину пенициллиновым методом обогащения.
1.3. Клонирование in vivo фрагментов хромосомы Е. coli, комплементирующих пролиновую ауксоторофность.
1.4. Минимизация фрагмента хромосомы штамма 240-18, содержащегоргоВ*А оперон.
1.5. Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей белков, кодируемых генами Ь0245 nyaffV.
1.6. Конструирование плазмид, содержащих гены биосинтеза пролина . 53
1.7. Идентификация мутации в генергаВ*. 56
1.8. Результаты амплификации генов пути биосинтеза пролина в клетках 60 штамма Е. coli 240-18.
2. Оптимизация уровня экспрессии генов, кодирующих ферменты участвующие в синтезе предшественников пролина.
2.1. Клонирование и интеграция в хромосому штамма 12ВА20 дополнительных копий гена gdhA.
2.2. Анализ потоков распределения углерода штаммах c амплифицированными генами ргоВ*А и gdhA с помощью ЯМР спектроскопии.
2.3. Оптимизация уровня экспрессии генов sucAB путем замены и нативного промотора в составе бактериальной хромосомы.
2.4. Клонирование и интеграция в хромосому штамма 12ВА20 генаррс. 76 Определение оптимальной активности фосфоенолпируваткарбоксилазы в клетке для биосинтеза пролина.
2.5. Роль глутаматдеркарбоксилазы в пути биосинтеза L-пролина.
Список литературы 89
- Регуляция пути биосинтеза пролина
- Приготовление экстрактов клеток для определения активности ферментов
- Конструирование плазмид, содержащих гены биосинтеза пролина
- Роль глутаматдеркарбоксилазы в пути биосинтеза L-пролина.
Введение к работе
Пролин (C5H9N02)-3TO неполярная аминокислота, наряду с другими аминокислотами является строительным материалом клеточных белков. Несмотря на то, что пролин является заменимой аминокислотой, он выполняет в клетке несколько различных функций: является источником углерода и азота, выполняет структурную функцию в белках, благодаря уникальному пятичленному кольцу обеспечивает поворот в белковой а-спирали или располагается на краю р-слоя. Известно, например, что в коллагене более трети аминокислотных остатков приходится на пролин и гидроксипролин, эти аминокислоты также стабилизируют тройную спираль коллагена по отношению к действию протеаз. Благодаря своей структурной функции L-пролин является коммерчески привлекательным для фармакологии и косметологии, а также для производства пищевых добавок.
Другой важной функцией пролина является его роль универсального осмопротектора в клетке, поэтому, с развитием биотехнологии, путь биосинтеза пролина быстро стал объектом генетических экспериментов, особенно в растениях, где коммерческая ценность сорта определяется в том числе его устойчивостью к засухе и засоленности почвы.
Недавно были опубликованы данные о практическом использовании еще одной функции пролина в клетке. В статье Морита [Morita Y. et al., 2002] приведены данные о том, что пролин является не менее эффективным криопротектором, чем глицерин и трегалоза в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae, и внутриклеточное накопление пролина приводит к значительному повышению процента выживаемости клеток дрожжей после замораживания до -20°С, что имеет большое значение, в частности для производства полуфабрикатов из теста.
L-пролин широко используется в медицине в составе аминокислотных смесей для парентерального питания и как основа для создания нейролептических препаратов, а также в пищевой промышленности в качестве антиоксиданта и ароматизатора.
Путь биосинтеза пролина в разных группах живых организмов имеет лишь незначительные отличия. Таким образом, изучение влияния уровня экспрессии генов пути биосинтеза L-пролина и генов центральных путей метаболизма на продукцию L-пролина в хорошо изученном штамме Е.соИ К12, а также создание спектра генетических конструкций, содержащих гены биосинтеза L-пролина, в том числе мутированные с повышением активности кодируемых ими ферментов, является актуальным и экономически обоснованным.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
- повысить уровень биосинтеза L-пролина за счет введения мутаций по генам биосинтеза, приводящим к снятию ретроингибирования соответствующих ферментов пролином, и амплификации мутантных генов, а также блокирования известных потенциальных путей деградации L-пролина;
- создать стабильные генетические конструкции, несущие гены ферментов пути биосинтеза L-пролина;
- подобрать оптимальный уровень синтеза предшественников L-пролина за счет изменения экспрессии соответствующих генов центрального метаболизма;
- минимизировать накопление побочных продуктов биосинтеза L-пролина.
Регуляция пути биосинтеза пролина
Бактериальные токсин-антитоксин (ТА) пары белков представляют собой систему регуляции, состоящую из стабильного белка-токсина (95-135 аминокислотных остатков), вызывающего смерть клетки за счет того, что токсин нарушает жизненно важный для клетки процесс, связываясь с ключевыми белками этого процесса и инактивируя их. Второй компонент ТА пары - нестабильный белок-антитоксин (65-85 аминокислотных остатков), который, в свою очередь связывается с токсином и блокирует его активность [Engelberg-Kulka, Н., and G. Glaser, 1999]. Впервые ТА пары были обнаружены на плазмидах как постсегрегационные убийцы - после деления клеток те дочерние клетки, которые не получили плазмиду погибают, поскольку не могут синтезировать антитоксин [Zelenkiewicz, U. and P. Ceglowski, 2001.]. Такой механизм поддержания плазмид за счет постоянного синтеза нестабильного антитоксина, нейтрализующего действие токсина, оказался чрезвычайно эффективным.
Что касается хромосомных ТА пар, то их назначение еще не до конца понятно. Существуют две версии - одна, что такие пары существуют для клеточного апоптоза в ответ на строгий ответ (stringent response) при аминокислотном голодании - на примере пары mazE/mazF— генов, расположенных в rel опероне. В результате снижения уровня хромосомной транскрипции возникает нехватка антитоксина и токсин вызывает гибель клетки. Как считают авторы, такая стратегия дает эволюционные преимущества за счет гибели части популяции клеток, чтобы компенсировать нехватку питательных веществ оставшейся части [Aizenman, E.et al., 1996; Engelberg-Kulka, H., and Glaser, G., 1999].
Другая версия не столь радикальна, на примере пары relB/relE доказывается, что хромосомные ТА пары, в отличие от плазмидных, участвуют лишь в адаптации клетки к стрессу, не приводя к апоптозу. Механизм действия токсина relB состоит в специфическом разрезании мРНК, что замедляет трансляцию и синтез белков. Антитоксин relE нейтрализует действие токсина и эта система регулирует скорость метаболических процессов в клетке в соответствии с условиями окружающей среды [Gerdes, К., 2000; Pedersen, К., et al, 2002]. Браун и Шоу [Brown, J.M. and Show, K.J., 2003] изучили три предполагаемых ТА пары, в том числе пару генов Ь0245 (ykfl)/yafW. Эти гены были клонированы в вектор, экспрессия которого индуцируется арабинозой. Сверхэкспрессия гена ykfl привела к снижению скорости роста штамма реципиента, а дополнительная экспрессия гена yajW нейтрализовала негативный эффект экспрессии гепаук/Т. Механизм влияния экспрессии тенаук/І на замедление роста клеток неизвестен. Эксперимент, призванный обнаружить физическое взаимодействие двух ТА белков не дал положительных результатов. Несмотря на отсутствие прямого взаимодействия между белком антитоксином и токсином, пара генов ykfl/yaJW была отнесена к новому семейству ТА пар белков.
Несмотря на то, что уже достоверно установлено, что гены ргоВА составляют оперон, в литературе отсутствуют какие-либо указания на существование систем репрессия-дерепрессия или гена-репрессора пролинового оперона. Более того, анализ нуклеотидной последовательности, расположенной на хромосоме Е. coli непосредственно перед пролиновым опероном и нуклеотидная последовательность самого оперона ргоВА не обнаруживает никаких возможных шпилечных структур для аттенуаторной области.
Таким образом, для пролинового оперона в настоящее время не показано существование никаких регуляторных механизмов (за исключением ретроингибирования пролином глутамилкиназы), что отличает его от всех аминокислотных оперонов. Возможно, это обусловлено особой ролью пролина в клетке, связанной с осмотолерантностью.
Как у эу-, так и у прокариот, биосинтез пролина из глутамата регулируется обратным ингибированием ПС - первого фермента пути биосинтеза [Omori К., etal., 1991]. Эксперименты с очищенным ферментом показали, что, помимо ингибирования пролином, активность ГК в меньшей степени регулируется глутаматом и АДФ, таким образом, осуществляя тонкую настройку синтеза пролина по отношению к субстрату и к доступной энергии [Smith, C.J., et al, 1984]. Мутации, приводящие к устойчивости к аналогам пролина (и, как следствие, к суперпродукции пролина) описаны для нескольких микроорганизмов, во всех случаях это мутации ГК, вызывающие понижение чувствительности этого фермента к своему аллостерическому эффектору
Только ПС, являющаяся ключевым ферментом в пути биосинтеза пролина, подвержена ретроингибированию пролином, поэтому для исследователей наибольший интерес представляют мутации, ослабляющие эту регуляцию. Таких мутаций известно немного и они локализованы, как правило, ближе к N-концу белка. Такого рода мутации - это, как правило, точечные замены -обычно сопряжены с повышением продукции пролина и, в ряде случаев, с повышением осморезистентности штамма.
На сегодняшний день для Е. coli известно 3 таких мутации в гене ргоВ: 1. замена лейцина 65 на глицин, в результате точечной замены А на Т в положении 194 нуклеотидной последовательности гена, что приводит, как к сверхсинтезу пролина, так и к повышению осмоустойчивости [Неумывакин, Л.В. и др., 1990];
Асп107 на Асн, более известная как ргоВ74, в результате точечной замены G на А в положении 319 нуклеотидной последовательности гена, проявляется в способности штамма-мутанта к сверхсинтезу пролина, и в повышении осмоустоичивости штамма [CsonkaL.N.e/a/., 1988]; замена Глу143 на Ала, известная как DHPR, в результате точечной замены А на С в положении 427 нуклеотидной последовательности гена, приводит к повышению уровня синтеза пролина, но не повышает осморезистентность [Rushlow, К.Е. etal., 1984].
Локализация описанных мутаций в глутамилкиназе представлена на Рисунке 2. На Рисунке 3 изображено выравнивание участка аминокислотных последовательностей мутантных глутамилкиназ из Escherichia coli, Serratia marescens, Thermus thermophilus и Listeria monocytogenes
Для Serratia marcescens [Omori K., et al, 1992], Thermus thermophilus [Kosuge, Т., Hoshino, Т., 1998] и Listeria monocytogenes [Sleator R.D., et al., 2001] также известна точечная мутация в том же районе гешргоВ, приводящая к сверхсинтезу пролина и к повышению осмоустоичивости - это замена аланина на валин в 117 позиции (для S. marcescens) в результате точечной замены А на G.
Приготовление экстрактов клеток для определения активности ферментов
Для выделения аналогорезистентных мутантов клетки высевали на чашки, содержащие среду М9 с добавлением изолейцина 50 мкг/мл и аналогов пролина - AC, DP и ТР (50 мкг/мл). Выросшие через 3-5 дней колонии отбирали и рассевали до отдельных колоний. Методы и ферменты, использованные при работе с ДНК Выделение плазмидной и фаговой и хромосомной ДНК, электроэлюцию фрагментов ДНК осуществляли, как это описано у Маниатиса [Маниатис Т. и др., 1984]. Рестрикционные нуклеазы, ДНК-лигаза фага Т4 и ДНК-полимераза фага Т4 НПО "Ферментас" (Литва), фирм "Амершам" и "Сигма" использовали согласно рекомендациям производителя или как описано в руководстве Маниатиса с соавторами [Маниатис Т. и др., 1984]. Секвенирование ДНК осуществляли по методу Сенгера [Sanger F. et al, 1977]. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили, как описано в руководствах [PCR protocols, 1993]. Трансформация, трансдукция, клонирование in vivo Трансформацию Е. coli, получение лизатов фага PI vir и трансдукции этим фагом проводили, как это описано у Миллера [Миллер Дж., 1976]. Получение лизатов фага Mud 5005; штаммов, лизогенных по Mu cts 62, трансдукцию фагом Mud 5005 и другие операции с фагом мини-Ми осуществляли по методике, описанной Гройсманом и Касадабаном [Groisman Е. A. and Casadaban М. J., 1986].
Ферментации
Посевной материал выращивали при 32 С в течение 18 часов в LB бульоне с добавкой соответствующих антибиотиков. Затем по 0.2 мл полученной культуральной жидкости вносили в пробирки с 2 мл ферментационной среды, и культивировали при 32 С 48-72 часа на роторной качалке (240 об/мин).
Состав ферментационной среды Лейцин-И (г/л): Глюкоза-60, (NH4)2S04- 15, К2НР04- 1,5, MgS04 х 7Н20-1, дрожжевого экстракта -1, тиамин НС1 - 0,0002, СаС03 - 20 (добавляют после стерилизации). При необходимости для выращивания ауксотрофов по изолейцину добавляют раствор изолейцина 50 мкг/мл.. Определение концентрации аминокислот в культуральной жидкости Концентрацию пролина в КЖ определяли методом тонкослойной хроматографии в системе "изопропанол : ацетон : аммиак : вода" (50:50:12:8 в объемных процентах). Концентрацию L-пролина определяют также с помощью ТСХ в системе этанол : водный раствор аммиака: вода (70 : 5 : 25) В качестве проявителя использовали 1% раствор нингидрина в ацетоне, содержащий 3% ледяной уксусной кислоты. Экстракцию проводили в 50% растворе этанола, содержащем 0,5% CdCl2. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре при 340 нм. Определение активностей ферментов Приготовление экстрактов клеток для определения активности ферментов. Бактериальные культуры выращивали на среде Лейцин-2 с 5 % по объему LB, для ауксотрофных штаммов добавляли по 0,05 мг/мл необходимых аминокислот. Для изучения ферментов в условиях дерепрессии клетки выращивали в среде без LB, для ауксотрофных штаммов добавляли по 0,01 мг/мл необходимых аминокислот. Для изучения репрессии в среду добавляли по 0,5 мг/мл соответствующих аминокислот. Клетки, находящиеся в поздней логарифмической фазе роста (титр 5-10 хЮ8), дважды отмывали Tris-HCl или фосфатным буфером, рН 7,5, осаждали центрифугированием и собранную биомассу использовали для получения ферментных препаратов.
Для получения ферментных препаратов клетки обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе (MSE, Англия) при амплитуде 10-12 мк 3 минуты на холоду, а затем центрифугировали при 10000 об/мин 30 минут. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорда [Bradford, 1976], используя реагент Bio-Rad Protein Assay фирмы «Bio-Rad».
Конструирование плазмид, содержащих гены биосинтеза пролина
Для исследования влияния дозы генов биосинтеза пролина на накопление Pro штаммами-продуцентами было осуществлено конструирование серии рекомбинантных плазмид, содержащихргоВ Л-оперон, генргоС либо комбинациюргоВ А+ ргоС, на основе векторов различной копийности.
В качестве донорарго-б -оперона использовался описанный в п. 1.4. фрагмент 1-4ES, а ген ргоС был получен в результате амплификации с помощью полимеразной цепной реакции, используя в качестве матрицы хромосомальную ДНК клеток E.coli К12.
Для амплификации гена ргоС с собственным промотором в реакции ПЦР использовались следующие праймеры:
После амплификации фрагмент ДНК в 1133 п.о. с геном ргоС был клонирован в малокопийный вектор pMWl 19, и его биологическая активность в составе плазмиды была подтверждена по появлению прототрофности плазмидного штамма, созданного на основе E.coli К12ргоС-в качестве реципиента. В качестве векторов различной копийности использовали: pMWl 19 - имеющую репликон pSClOl (6-8 копий на хромосомный эквивалент); pBR322 и pAYCTERl - (16-20 копий на хромосомный эквивалент); pUC19 - (более 50 копий на хромосомный эквивалент). Созданные на основе этих векторов рекомбинантные плазмиды, содержащие фрагмент 1-4ES с ргоВ А-опероком, были обозначены pMWl-4ES, pBRl-4ES, pAYCTERl , pUC2, соответственно. Физико-генетические карты некоторых из этих плазмид приведены на Рисунке 10. Созданная на основе pMWl 19 рекомбинантная плазмида с геномргоС была обозначена - pMWproC. Добавление этого гена в состав плазмиды pMWl-4ES, уже содержавшей ргоВ А-опсрон, привело к созданию новой рекомбинантной ДНК, которая была обозначена - pMWBACN. Для дальнейшей Mu-зависимой интеграции генов биосинтеза пролина в состав бактериальной хромосомы на основе разработанных в Институте интегративных векторов стандартными генно-инженерными методами были созданы также рекомбинантные плазмиды с фрагментом 1-4ES (ргоВ А, Ь0245 и yqfW), которые были обозначены как pMDpro и pMIVpro. V 1.7. Идентификация мутации в гене ргоВ .
Для определения локализации полученной мутации в гене ргоВ , была определена нуклеотидная последовательность фрагментов хромосомы штаммов 240-18,1-22 и 55ilvA (свойства этих бактериальных штаммов приведены в Таблице 5), содержащих структурную часть этого цистрона, а также по 100 нуклеотидов с 5 и 3 -концов от соответствующей открытой рамки считывания.
Сравнительный анализ определенных нуклеотидных последовательностей показал, что если в геноме штаммов 55ilvA и 1-22 структура гена ргоВ соответствует известной из литературы для гена E.coli MG1655, то ъргоВ штамма 240-18 в положении 349 последовательности этого гена произошла замена А - G, что привело к соответствующей замене А1ац7 - Valiи в первичной структуре РгоВ . Отметим, что А1ац7 входит в состав консервативного участка (R-LNAR) глутамилкиназ различных микроорганизмов, что показано на Рисунке 11.
Не менее 90% идентичных АК в данной позиции выравнивания - красный Не менее 50% идентичных АК в данной позиции выравнивания - синий Менее 50% идентичных АК в данной позиции выравнивания - черный Рис. 11. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей РгоВ из различных Как уже было сказано, ProB является первым ферментом терминального пути биосинтеза пролина, подверженным ретроингабированию пролином. Мутации, нарушающие способность фермента к ретроингабированию, приводят обычно к повышению продукции клетками Pro, а также, в ряде случаев и к повышению осморезистентности бактерий. Как упоминалось в обзоре литературы, к моменту выполнения нашей работы для Е. coli было описано 3 таких мутации в генергаВ. Сравнение свойств полученной нами и известных мутаций приведено в Таблице 9.
Из Таблицы 9 видно, что полученная мутация proBl 17 сообщает ГК максимальную устойчивость к ингибированию пролином, по сравнению с известными мутациями. Кроме того, мутация proBl 17, в отличие от мутации DHPR, повышает осморезистентность клеток.
Также несколько штаммов (родительский штамм 55ilvA и В7 (дикий тип)) без плазмид и с введенной в них плазмидой, содержащей мутацию ргоВ117 ъргоВ А опероне, были проверены на осмочувствительность на минимальной среде с добавлением различных концентраций NaCl (Таблица 10).
Роль глутаматдеркарбоксилазы в пути биосинтеза L-пролина.Выводы
В ряде ферментации при анализе состава культуральной жидкости методом тонкослойной хроматографии, рядом с пятном пролина наблюдалось дополнительное пятно другого цвета. Пятна обладали такой же подвижностью, как и пролин в системе этанол-вода. Аналитической группой с помощью ВЭЖКХ (Waters Accqag Amino Acid Analysis Method) было показано, что это вещество является у-аминомасляной кислотой (ГАМК) (Рисунок 16). Соответствие формулы исследуемого вещества у-аминомасляной кислоте также было подтверждена методами масс-спектроскопии и ЯМР. ГАМК считается одним из основных веществ-нейромедиаторов у млекопитающих, широко используется в фармацевтике. Штаммы-продуценты L-пролина - ауксотрофы по изолейцину - обладают повышенным пулом глутамата - структурного предшественника как L-пролина, так и ГАМК. Поэтому при проведении ферментации с целью продукции пролина, ГАМК является нежелательной примесью, к тому же образование ГАМК снижает конверсию пролина из глюкозы, поскольку из пути биосинтеза пролина часть глутамата забирается на синтез ГАМК. С другой стороны, на основе штаммов-продуцентов пролина, могут быть получены продуценты ГАМК - при изменении условий ферментации в сторону благоприятствования биосинтезу ГАМК (повышение концентрации изолейцина в среде). Механизм влияния изолейцина на экспрессию генов путей биосинтеза ГАМК и пролина пока неизвестен. Возможно, повышение продукции ГАМК при повышении концентрации изолейцина является частью так называемого строгого ответа (stringent response), осуществляемого с помощью алармона ppGpp. При голодании по аминокислоте - изолейцину - клетка стимулирует образование собственных аминокислот (в нашем случае пролина), но при поступлении в среду избытка изолейцина - происходит переключение с синтеза аминокислоты на другие пути расходования избыточного пула глутаминовой кислоты.
Биосинтез ГАМК из глутамата в Escherichia coli катализируется двумя изоферментами - декарбоксилазами глутаминовой кислоты - GadA и GadB, кодируемыми генами gadA и gadB соответственно. Схожесть нуклеотидных последовательностей данных генов составляет 98% [Smith D.K., et al, 1992]. Такая дупликация генов на хромосоме может объясняться чрезвычайной важностью оперативного биосинтеза ГАМК в условиях кислотного стресса. Выживание при низких значениях рН имеет жизненно важное значение для клеток E.coli, вынужденных противостоять высокой кислотности желудочного сока (рН 3) и летучим жирным кислотам, выделяемым кишечной микрофлорой [Mahan MJ, et al., 1996]. Ген gadB транскрибируется в опероне с геном gadC, который кодирует транспортный белок GadC. Поскольку GadC-зависимый экспорт ГАМК из клетки сопряжен с импортом протонированной глутаминовой кислоты, что означает транспорт протонов в клетку и защелачивание внеклеточной среды, то использование этого механизма представляет серьезные преимущества бактерии в условиях кислотного стресса [De Biase D. et al., 1999]. Следовательно, делеция гена gadB со сбоем рамки считывания для гена gadC может оказаться более эффективной, по сравнению с делецией гена gadA.
Снятие зависимости продукции ГАМК от концентрации изолейцина в ферментационной среде, показало, что с увеличением концентрации изолейцина продукция ГАМК возрастает. Интересно, что в штамме - продуценте пролина 12В А20 с увеличением концентрации изолейцина продукция пролина стремительно падает, то же самое происходит и с продукцией глутаминовой кислоты в родительском штамме 1-22 - продуценте глутаминовой кислоты. Данные пробирочной ферментации представлены в Таблице 17. Поскольку глутаматдекарбоксилаза конкурирует с глутаматкиназой -первым ферментом пути биосинтеза пролина за субстрат (Glu), то нами были сконструированы штаммы с делегированными генами gadA и gadB. Ниже будет подробно описана делеция в гене gadB. Делеция гена gadA производилась аналогично делеции гена gadB.
Для делеции гена gadB были использованы следующие праймеры: Делеция в гене gadB была получена с использованием метода, впервые разработанного Datsenko и Wanner (2000), также называемого рекомбинацией с использованием Red-системы. Для этого были сконструированы праймеры для ПЦР gadBSTART и gadBSTOP, гомологичные как участкам, прилегающим к гену gadB, так и участкам гена cat, придающему устойчивость к антибиотику и находящемуся на плазмиде, использованной в качестве матрицы для ПЦР. Плазмида pACYC148 (NBL Gene Sciences Ltd., UK) (инвентарный номер X06403 в GenBank/EMBL) была использована в качестве матрицы для ПЦР (Рисунок 17). Условия ПЦР были следующими: денатурация 3 мин при 95 С; первые два цикла: 1 мин при 95 С, 30 сек при 34 С, 40 сек при 72 С; следующие тридцать циклов: 30 сек при 95 С, 30 сек при 50 С, 40 сек при 72 С; последняя стадия 5 мин при 72 С.
Полученный продукт ПЦР длиной 938 п.о. был очищен в агарозном геле и использован для электропорации штамма Е. coli MG1655, содержащего плазмиду pKD46 с термочувствительным репликоном. Плазмида pKD46 [Datsenko and Wanner, 2000] содержит фрагмент ДНК длиной 2154 нуклеотида (31088-33241) фага лямбда (инвентарный номер J02459 в GenBank), состоящий из генов системы гомологичной рекомбинации X Red (гены у, р, ехо), находящихся под контролем промотора Р в, индуцируемого арабинозой. Плазмида pKD46 необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма MG1655.
Электрокомпетентные клетки были приготовлены следующим образом: ночная культура штамма Е. coli MG1655, выросшая при 30 С в LB среде, содержащей ампициллин (100 мг/л), была разбавлена в 100 раз 5-тью мл среды SOB с ампициллином и L-арабинозой (1 мМ). Полученную культуру выращивали при аэрации при 30 С до достижения оптической плотности OD60o и 0.6 и затем делали электрокомпетентной путем концентрирования в 100 раз и тройной промывкой деионизованной водой, охлажденной во льду. Электропорацию осуществляли, используя 70 мкл клеток и 100 нг продукта ПЦР. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC при 37 С в течение 2,5 часов, после этого высевали на L-arap и растили при 37 С для отбора CmR рекомбинантов. Затем для элиминирования плазмиды pKD46 осуществляли два пассажа на L-arape с Cm при 42 С и полученные клоны проверяли на чувствительность к ампициллину. Полная схема конструкции хромосомного фрагмента, содержащего инактивированный ген gadB приведена на Рисунке 18.
