Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I - Обзор литературы 8
1.1. Шазмиды как экстрахромосомнне детерминанты наследственности . 8
1.2. Типы бактериальных плазмид ю
1.3. R-плазмиды и их свойства 15
1.3.1. Молекулярная и генетическая организация R-плазмид 15
1.3.2. Репликация R-плазмид 18
1.3.3. Транемиесивноеть R -плазмид. 22
1.3.4. Круг хозяев R -плазмид 24
1.3.5. Способность R-плазмид ингибировать тгафункцию плазмиды 26
1.3.6. Классификация R-плазмид на основе несовместимости 27
1.3.7. Происхождение R-плазмид. 34
1.4. Шгазмиднне комплексы 39
ГЛАВА II Материалы и методы . 44
2.1. Использованные штаммы бактерий и плазмиды 44
2.2. Питательные среды 45
2.3. Использованные реактивы и ферменты .
2.4. Конъюгация бактерий
2.5. "Трехродительские скрещивания" 47
2.6. Определение колициногенности клеток 48
2.7. Реакция нарастания титра фага MS2 .48
2.8. Элиминация плазмид 49
2.9. Определение совместимости
(несовместимости) плазмид 49
2.10. Выделение плазмидной ДНК 51
2.II* Рестрикция и электрофоре плазмидной.ДНК 52
ГЛАВА III - Результаты 54
3.1. Определение лекарственной резистентности и колициногенности клеток E.coli B-I3 54
3.2. Разделение плазмидного комплекса B-I3 56
3.3. КЬньюгативность плазмидкомплекса B-I3 63
3.4. Шли, детерминируемые R -плазмидами комплекса B-I3 66
3.5. Молекулярные массы- R -плазмид комплекса В-ТЗ... 69
3.6. Стабильность R -плазмид комплекса B-I3 в клетках 69
3.7. Способность R -плазмид комплекса B-I3 мобилизовать на перенос неконъюгативные плазмиды 70
3.8. Способность R-плазмид комплекса B-I3 ингибировать Тга -функцию пла ЗМИДЫ F 72
3.9 Совместимость (несовместимость) R-плазмид комплекса В-ІЗ
с плазмидами разных групп несовместимости 73
3.10, Рестрикодонныи анализ
R -плазмид комплекса В-ІЗ. ... . III
ГЛАВА ІV Обсуждение результатов. 122
Выводы... 148
Список литературы
- Шазмиды как экстрахромосомнне детерминанты наследственности
- Молекулярная и генетическая организация R-плазмид
- Использованные штаммы бактерий и плазмиды
- Определение лекарственной резистентности и колициногенности клеток E.coli B-I3
Введение к работе
Плазмиды бактерий - это экстрахромосомные генетические детерминанты, существующие в цитоплазме бактериальных клеток и способные к автономной репликации* Они "обитают" в бактериях многих видов, но не являются обязательным компонентом бактериальных клеток. Не оказывая существенного влияния на роет.и размножение бактериальных клеток, плазмиды несут, однако, гены, которые контролируют ряд очень важных свойств бактерий - лекарственную устойчивость, бактериоциногенность, гемолитическую активность, биодеградацию ряда органических соединений и др. Молекула плазмидной ДНК представляет собой репликон, детерминирующий функции собственной репликации, сохранения в клетках,
трансмиссивность и другие свойства*.
Исследование плазмид имеет громадное теоретическое значение , поскольку помогает в познании структуры и функции генетического материала на молекулярном уровне. Обладая относительно небольшими размерами (2—250 МД), плазмидный репликон очень удобен для изучения репликации, рекомбинации, переноса генов между бактериями; Благодаря плазмидам, обуславливающим системы скрещиваний бактерий, стал возможен их генетический анализ., многие плазмиды широко применяются в качестве генетических векторов в генетической инженерии, благодаря которой стало доступным проведение многих ранее практически невыполнимых экспериментов.
Однако, помимо теоретических аспектов, изучение плазмид
имеет важное прикладное значение, особенно в инфекционной патологии человека и животных,в связи с лекарственной резистентностью возбудителей болезней. Как извеотно, интенсивное использование антибиотиков в медицине и ветеринарии обусловило появление большого количества полирезистентных штаммов, устойчивых к широкому спектру лекарственных веществ. Эта устойчивость в большинстве случаев контролируется R-плазмидами. Наличие лекарственной резистентности бактерий осложняет многие лечебные и профилактические мероприятия.
В первые годы изучения плазмид в бактериях штаммов, выделяемых из разных природных источников, обнаруживали, как правило, одну какую-либо плазмиду. Однако в последние годы участились случаи идентификации в бактериальных клетках уже ни одной плаз-миды, а нескольких, каждая из которых может контролировать разные свойства бактерий. Такие стабильно сосуществующие в бактериальной клетке разные плазмиды получили название плазмидных комплексов (Кудлай, 1977).
Елазмидные комплексы идентифицированы в бактериях многих видов, но изучены они пока крайне мало. Поэтому целью настоящей работы явились идентификация и изучение комплекса плазмид в клетках полирезистентного колициногенного и энтеротоксигенного штамма Escherichia coli B-I3 дикого типа. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи исследований:.
- определить тип (плазмидный или хромосомный) конт
роля лекарственной резистентности и колициногенности клеток
E^coii В-ІЗ;
- в случае установления плазмидного-контроля лекарст
венной резистентности и колициногенности "разогнать" с помощью
конъюгативных скрещиваний комплекс плазмид, содержащихся в
E.coii B-I3 на отдельные шгазмиды;
определить молекулярные размеры идентифицированных R-плазмид; .
изучить генетический перенос, осуществляемый идентифицированными плазмидами, а также способность их к мобилизации на перенос неконъюгативных плазмид;
определить тип ззилей, детерминируемых r-плазмидами комплекса B-I3;
классифицировать идентифицированные . R-плазмиды по способности ингибировать генетический перенос плазмиды F.;.
определить стабильность поддержания R-плазмид в клетках—донорах, а также их чувствительность к воздействиям элиминирующих агентов;
осуществить рестрикционный анализ идентифицированных R-плазмид;
определить совместимость (несовместимость) идентифицированных R-плазмид между собой и с референс-плазмидами известных групп несовместимости.
Шазмиды как экстрахромосомнне детерминанты наследственности
Плазмиды - это экстрахромосомные генетические детерминанты, существующие в клетке в автономном состоянии и способные к бесконечно долгому поддерживанию и воспроизводству в такой форме. К настоящему времени плазмиды выявлены в бактериях более 100
ВИДОВ, принадлежащих К родам Escherichia , Bacteroides , Salmo -nella ,; Shigella ,? Serratia , Proteus; , Pasteurella „ Erwinia , Pseudomonas , Streptococcus ,.. Staphylococcus , Neisseria , Agro-bacterium ,Bacillus, VibrioH Др., И ЭТО ОВИДЄТЄЛЬСТВуЄТ Об ИХ исключительно большом распространении в микробном мире.
Существуя в бактериальной клетке обособленно от хромосомы в количестве от одной до нескольких десятков копий, плазмидный репликон детерминирует все важнейшие функции, позволяющие ему находиться в таком автономном состоянии. Так, наличие генов репликации на плазмидном репликоне обуславливает бесконечно долгое поддержание и воспроизводство его в автономном состоянии. А благодаря генам переноса плазмиды способы передаваться от одних клеток к другим, обеспечивая обмен генов между различными бактериями, преодолевая иногда при этом ввдовые и родовые барьеры.
Все до сих пор выделенные из бактерий плазмиды существуют в виде двухцепочечных кольцевых молекул ДНК, размеры кото рых варьируют в пределах от 1,5 до 250 ВД. .. Представляя собой молекулы ДНК, они, однако, гетерогенна,в плане генетической организации и функциональной активности; Одни из плазмид представляют собой "чистые" факторы генетического переноса, другие являются коинтегративными, то есть представляют собой коинте-граты, состоящие из фактора переноса и тех или иных детерминантов фенотипических свойств бактерий. їфоме того, в бактериях многих видов существуют неконъюгативные плазмиды, представляющие собой гены репликации и генетические детерминанты различных свойств бактерий - лекарственной резистентности, колициногенное-ти, синтеза гемолизинов, энтеротоксинов и др.
За время изучения плазмид получены фундаментальные данные об их физико-химической организации, репликации, мутагенезе, конъюгативных особенностях, а также о свойствах бактерий, содержащих плазмиды. Находясь в бактериях, они придают им ряд свойств - лекарственную резистентность, способность к синтезу бактерио-цинов, гемолизинов и других биологически активных веществ, способность к деградации ряда органических соединений, а в случаи некоторых видов, имеющих значение в инфекционной патологии , человека и животных, участвуют в контроле их патогенных свойств.
Шшзмиды не являются необходимыми компонентами бактериальных клеток, а бактерии могут как иметь, так и не иметь плазмиды. Однако бактериальный штамм, клетки которого содержат те или иные плазмиды, в определенных условиях будет иметь селективное преимущество перед таким же штаммом, клетки которого, однако, не содержат определенных плазмид. Кроме того, обеспечивая обмен генов между различными бактериями,, приток-в бактерии новых генов, плазмиды обуславливают эволюционную пластичность бакте риалышх видов.
К настоящему времени известно 9 четко различимых типов плазмид. Один из самых больших типов составляют. ..R-плазмиды, но этим плазмидам будет посвящена следующая глава, поэтому в этой главе мы дадим краткую характеристику остальным типам плазмид.
Факторы генетического переноса
Классическим фактором переноса является рнплазмида, впервые обнаруженная Ледербергом (Lederberg et al.,I952). Это малокопийная (I—2 копии на одну бактериальную клетку) крупная плазмида. Ее молекулярный вес составляет, 61—63 ВД, несет она около 90—100 генов (Sharp et аі.,І972). По отношению к бактериальной хромосоме F-фактор может существовать в двух альтернативных состояниях - автономном и интегрированном. Клетки, несущие фактор Р в автономном состоянии являются донорами типа р , тогда как клетки, несущие его в интегрированном состоянии, известны в качестве доноров Hfr.
Кроме типичного фактора F, известны его варианты . Будучи автономными, они представляют собой комбинированные структуры, так как включают в себя отдельные гены хромосомы бактерий. Перенос р-фактора между бактериальными клетками обеспечивается функционированием его tra-оперона и требует участия особых донорных (конъюгативных) пилей. В настоящее Бремя идеи тифицирован 21 ген tra-оперона. Бее они располагаются на участке 62—93,2 кб карты F фактора (Rowburry ,,1977). Это именно та область плазмиды F , которая,, по имеющимся данным (sharp et ai.,1973), гомологична.. соответствующим областям R100-1; , Coiv-K94 плазмид.
Молекулярная и генетическая организация R-плазмид
R-плазмиды, как и все известные к настоящему, времени; плазмиды, представляют собой кольцевые ковалентно-замкнутые двунитевне. молекулы ДНК. їїосле наделения из клеток плазмидная. ДНК обнаруживается в форме_ суперскрученных замкнутых кольцевых молекул, открытых кольцевых и линейных молекул. Молекулярная масса R:-плазмид варьирует от (2-4).106 до 250. Ю6 (Коротя-ев, Малышева, 1982).
Как правило, плазмиды с высокой молекулярной массой, например, RI (молекулярная масса 62. Ю6), R64 (молекулярная масса 79.106) присутствуют в клетке-хозяине в количестве 1—3 копий. Низкомолекулярные плазмиды относятся к мультикопийным. Существует взаимосвязь мевду числом копий плазмид и типом контроля репликации, ТТлазмиды со строгим типом контроля относятся к числу малокопийных, с ослабленным - к мультикопийным;
Говоря о генетической структуре R.-плазмид, следует заметить, что для них характерна структурная гетерогенность. Она заключается в том, что они могут находиться в нескольких альтернативных состояниях, которые будут зависеть от характера взаимоотношений мекду двумя структурными компонентами Егплазмидї. фактором переноса (RTP) И компонентом устойчивости - г -детерминантом. Фактор переноса - RTF (resistance transfer factor) - это репликон, обуславливающий собственную репликацию и генетический перенос и не имеющий никаких дополнительных детерминантов. Именно он наделяет R -плазмиды способностью к конью-гационному переносу.
Компонент или детерминант устойчивости (г) - это репликон, обуславливающий, помимо собственной репликации, устойчивость к одному или нескольким лекарственным веществам.
Как уже было сказано выше, фактор, переноса..CRTF) - и. детерминант резистентности ( г) могут находиться в клетках в не скольких альтернативных состояниях. Во-первых, RTF И Г могут быть соединены.друг с другом в единый репликон прочными ковалентними связями. Такая коинтегративная R -плазмида несет одновременно генетические детерминанты для репликации, переноса и резистентности к антибиотикам, составляющие одну группу сцепления.
Во-вторых, фактор переноса и г -детерминанты могут находиться в клетке в дискретном автономном состоянии. Они могут автономно реплицироваться и могут передаваться вместе или раздельно, иногда клетки могут нести единую автономную плазмиду, несущую детерминанты резистентности, но без фактора переноса. При этом такие плазмиды, несущие гены резистентности, но не имеющие фактора переноса, являются нетрансмиссивными, и перенос их обеспечивается либо фактором переноса, если ТЭКОЕОЙ имеется в клетке, либо другими конъюгативными плазмидами. К плазмидам этого класса относят г -детерминанты Ар и SuSm, идентифицированные вместе с фактором А в клетках штамма s.typhimurium 29AST (Anderson, 1968), а также и многие неконьюгативные плазмиды R (Smith et al., 1974).
Если в первом случае сцепленные фактор: переноса и . г -детерминант ) образуют коинтеграт, то во втором случае, находясь в клетке в обособленном состоянии, они образуют агрегат (Milliken, Clowes, 1973).
Структура плазмид, о которых говорилось выше и которые несут либо только гены резистентности, либо гены резистентности у них сцеплены с фактором переноса, является относительно, простой и . определяется взаимоотношением двух компонентов: фактора переноса и г -детерминантов.
К настоящему времени показано для ряда R -плазмид, что в местах соединения фактора переноса с г -детерминантами расположены is -последовательности. Была предложена гипотеза, что рекомбинация между is -элементами и является причиной соединения и разделения соответствующих областей R -коинтеграта (Ptashne, Cohen, 1975), Данная гипотеза получила экспериментальное подтверждение. Так, ДЛЯ ПЛазМИДЫ R100.1 бНЛО ПОКазаНО (Chandler et ai., 1977), что ее г -детерминант фланкирован двумя isi -сайтами и что при диссоциации плазмиды на RTF И Г -детерминант имеет место обмен между isi: -сайтами.
Более сложную структуру представляют в. -плазмиды, являющиеся рекомбинантами двух или большего числа независимых .плаз-мидных репликонов. Такая рекомбинация между отдельными плазмида-ми, приводящая к образованию сложной коинтегративной R -плазмиды, также часто обуславливается is—элементами, а в некоторых случаях - транспозонами.
К настоящему времени таких коинтегративных плазмид, составленных из нескольких плазмидных репликонов, идентифицировано огромное множество. В качестве примера можно привести такие плазмиды как плазмида рШ502 , идентифицированная в клетках Е.СОІІ и являющаяся рекомбинантом двух плазмид (Hauman et ai., 1982), плазмиду R394 являющуюся коинтегратом двух плазмид -R394a и R394b (Nugent et al., 1982) И многие другие.
Использованные штаммы бактерий и плазмиды
При определении типа пилей конъюгацию в жидкой и на.плотной средах Осуществляли ПО методу Bradley et al . (1980). С некоторыми, модификациями, Донорные и реципиентные.клетки выращивали до концентрации 2.10 кл/мл, после чего готовили конъю-гационную смесь, состоящую из равных объемов донорных и реципи-ентных клеток. 0,3 мл такой смеси добавляли в I мл МПБ и столько же высевали на чашку с МПА. После часовой инкубации при 37 С готовили серию разведений конъюгационной смеси из. жидкой среды и Еысевали на соответствующие селективные среды. С плотной среды клетки снимали соскобом, добавляя на чашки 20—30 мл МПБ, затем полученную взвесь осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение десяти минут, осадок ресус-пендировали в 3 мл МПБ, после чего серию разведений полученной смеси высевали на селективные среды.
При осуществлении "трехродительских" скрещиваний в качестве доноров использовали клетки штамма E.coli АР115 , содержащие одну из R-плазмид, в качестве "промежуточных" реципиентов использовали клетки E.coli ивібзб либо Е.соїі.сбоо, содержащие неконъюгативную плазмиду, и "конечными".. реципиентами служили клетки. E.coli C60Q Rifr, Селекцию трансконъюгантов вели на МПА с добавлением необходимых антибиотиков.
Уколом петли делали посев исследуемой культуры да чашку с MffiL. Чашку с посевом инкубировали при 37 С в течение 24г—48 часов. Выросшие на чашке культуры убивали хлороформом в. течение 20 минут, после чего добавляли 6 мл 0,6 -ного .мясо-пептон-ного агара, содержащего клетки индикаторной культуры E.colif, и инкубировали при 37 С в течение 18 часов.
Наличие чистой зоны на газоне индикаторной культуры.в месте локализации колонии исследуемой культуры свидетельствовало о колициногенности ее клеток.
Способность исследованных бактерий обеспечивать размножение донорспецифического фага MS2 определяли по реакции нарастания . титра фага (РНФТ) в экспериментах, которые проводили по. следующей схеме: 18-часоЕые бактериальные культуры инфицировали до-норспецифическим фагом MS2 с множественностью инфекции, порядка I, полученные смеси инкубировали при 37 С и через, определенные промежутки Бремени устанавливали количество фаговых частиц в образцах этих смесей, делая посевы из соответствующих разведений в 0,6, %-ввМ мясо-пептонный агар,, содержащий клетки, индикаторной культуры E.coii JC158 Hfr. В каждом случае.определяли индекс нарастания титра фага (ИНТФ), который представлял собой отношение числа зон лизиса, обнаруженных после. „ 18-часового лш-кубироЕания фагоЕо-бактериальной смеси, к числу зон лизиса, об наруженных в контроле - до начала инкубирования,
В пробирке с МПБ . растворяли додецилсульфат. натрия в таком количестве, чтобы концентрация раствора составила 10 %,. после чего добавляли в пробирку 0,3 мл свежей бактериальной культури. После 18-часовой инкубации при 37 С готовили серию разведений и высевали бактерии на чашки с ША. Чашки с посевами инкубировали 18 часов при 37 С, после чего проверяли выросшие на чашках колонии по всем маркерам исследуемых плазмид. Аналогичным образом производили элиминацию и с бромистым этидием, добавляя его в соответствующих концентрациях в пробирки с МПБ.
Определение лекарственной резистентности и колициногенности клеток E.coli B-I3
Условно-патогенный штамм Е.СОІІ B-I3. (серогруппа. 0101) был выделен от больного теленка. К началу наших исследований было известно, что клетки этого штамма содержат Р -подобную плазмиду энтеротоксигенности (Ent) рАРЮ-2 . Поэтому мы начали с определения лекарственной устойчивости и колициногенности клеток данного штамма.
Определение спектра лекарственной резистентности клеток . E.coli в-13 было начато с проверки их резистентности при помощи дисков (фирмы "Oxoid") . После первичной проверки на . дисках уровни резистентности были определены на средах с различными концентрациями антибиотиков. В результате было, выяснено, что бактерии штамма Е.СОІІ В-ІЗ устойчивы,к следующим . антибиотикам: стрептомицину (sm) - 175мкг/мл,. хлорамфени-колу (cm) - 200, ампициллину. (Ар) -200, тетрациклину (тс) - 200, канамицину (Km) - 200, сульфаниламиду ..(su). - 2000 мкг/мд
Характер резистентности к лекарственным, веществам, а также наличие колициногенности позволили предположить, что клетки Е.сои в-13 содержат плазмиды лекарственной резистентности и колициногенности. Для выяснения, природы контроля.полирезистентности клеток E.coli В-13 последние были подвергнуты конъюга ционному скрещиванию с бактериями штаммов. . Е.СОІІ сбоо и E.coli АР115. Селекцию трансконъюгантов вели на резистентность К Sm , Cm , Ар , Km , Тс .
Оказалось, что бактерии Е.СОІІ В-ІЗ передают,гены устойчивости клеткам—реципиентам с частотой І.І(Г3--І.І(Г трансконъюгантов на одну донорскую клетку. При анализе полученных трансконъюгантов по г-маркерам оказалось, что по фенотипу они неоднородны. Данные о переносе указывали на плазмидную природу резистентности к Sm , Cm , Ар , Km , Тс. Для подтверждения этих данных были осуществлены эксперименты по элиминации генов резистентности к вышеназванным антибиотикам элиминирующими веществами - бромистым этидием, 10 $-ным додецилсульфатом натрия. При воздействии последних на клетки Е.СОІІ В-ІЗ в 2—5 % случаев резистентности утрачивались клетками.
Эти три критерия - трансмиесивнооть, сегрегация маркеров клеток исходного штамма и способность элиминироваться из клеток - позволили предположить, что множественная лекарственная устойчивость клеток Е.соіі В-ІЗ имеет плазмидную природу и определяется не одной, а несколькими плазмидами, составляющими плаз-мидный комплекс, Помимо проверки по r-маркерам, трансконъю-ганты, полученные при скрещивании клеток Е.СОІІ В-ІЗ с Е.СОІІ сбоо и Е.СОІІ АР115 , были проверены.и на колициноген-нос.ть. Часть из них оказались колшщногенными,. а. это, явилось подтверждением того, что в состав плазмидного -комплекса, помимо плазмиды Erit и R -плазмид,, входит и плазмида.. Сої .
Плазмидный. комплекс,, идентифицированный в клетках .-ЕЛЇОІІ МЗ»- ж. представленный плазмидами трех..типов.. - . Я -плазмидами, плазмидой Col и плазмидой Ent - был назван нами как коми леке В-ІЗ.
Для идентификации плазмид,, входящих Е состав исследуемого плазмидного комплекса В-ІЗ, было осуществлено.несколько.последовательных конъюгационных скрещивании, в. которых ставилась задача "разогнать" комплекс на отдельные плазмиды в разные клетки—трансконъюганты.
Петзвое скрещивание
В первом конъюгационном скрещивании в качестве доноров, использовали клетки Е.соїі В-ІЗ, а в качестве реципиентов -клетки Е.соїі АР115. Селекцию трансконъюгантов осуществляли на стрептомицин,ампициллин, хлорамфеникол, тетрациклин, канамицин.. В описываемом конъюгационном скрещивании трансконъюганты появились с частотой: на селективной среде SmKal - 3,4.10 , CmHal - 2,9.I0"2, ApNal - З.ІО""2, ;ТсЖа1 - 4,6.І0 4, KmNai - 4,8.10 . С каждой селективной среды было отобрано по 50—100 трансконъюгантов, которые были проверены по всем неселективным маркерам. Результаты приведены в табл. 3.
