Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Эпидемиология рака яичников 9
1.2. Факторы риска развития рака яичников 12
1.3. Роль генов систем передачи сигнала о повреждении ДНК, регуляции клеточного цикла, репарации ДНК и апоптоза в развитии рака яичников 17
1.4. Роль генов системы метаболизма эстрогенов в развитии рака яичников27
1.5. Полногеномный анализ ассоциаций при изучении рака яичников 33
Глава 2. Материалы и методы 40
2.1. Материалы исследования 40
2.2 Молекулярно-генетические методы исследования 45
2.2.1 Выделение ДНК из периферической крови 45
2.2.2 Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК 46
2.2.3. Аллель-специфичная ПЦР 46
2.2.4. Аллель-специфичная дуплексная ПЦР 47
2.2.5. Рестрикционный анализ 47
2.2.6. Анализ кривых плавления с высокой разрешающей способностью (HRM) 48
2.2.7. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 49
2.2.8. Метод дискриминации аллелей TaqMan (Gene Expression Assays) 51
2.2.9. Установление лимфобластоидной клеточной линии 52
2.2.10. Выделение белков из лимфобластоидной клеточной линии 53
2.2.11. Вестерн-блот анализ 54
2.2.12. Иммуноцитохимический анализ 57
2.3. Статистические методы 59
Глава 3. Результаты и обсуждение 61
3.1. Анализ мутаций c.5266dupC, c.l81T G и c.4034delA в гене BRCA1 у , больных раком яичников 61
3.2. Анализ мутации c.5946delT (6174delT) в гене BRCA2 у больных „ раком яичников и в контрольной группе 72
3.3. Скрининг мутаций CHEK2dele9,10(5kb), IVS2+1G A, 1 lOOdelC и полиморфного варианта I157T в гене СНЕК2 в выборке больных раком яичников и в группе контроля 73
3.4. Анализ мутации c.5932G T (р.Е1978Х) в генеЛ7Му больных раком яичников и в контрольной группе 83
3.5. Анализ мутации c.657del5 в гене NBNy больных раком яичников и в контрольной группе 84
3.6. Анализ кодирующего региона гена PALB2 (Partner and localizer of BRCA2) у больных раком яичников 86
3.7. Анализ кодирующего региона гена RAD51D у больных раком яичников с семейной историей рака яичников и/или рака молочной железы 95
3.8. Изучение варианта c.3855insl23 в гене MDC1 (Mediator of DNA 7 damage checkpoint 1) у женщин с онкопатологией 97
3.9. Анализ ассоциаций однонуклеотидных полиморфных вариантов «3814113 / 9р22.2, «8170 / 19р13.11, «2072590 / 2q31, «2665390 / 3q25, «10088218 / 8q24, «9303542 / 17q21, «2736108 и «2736109 в гене TERT с раком яичников 108
3.10. Анализ ассоциации полиморфных локусов «762551 в гене CYP1A2, «2740574 в гене CYP3A4, «1056836 в гене CYP1B1, «4680 в 133 гене СОМТи «700519 в гене CYP19 с риском развития рака яичников 133
3.11. Изучение роли межгенных взаимодействий в формировании предрасположенности к раку яичников 149
Заключение 151
Выводы 157
Список литературы 158
- Роль генов систем передачи сигнала о повреждении ДНК, регуляции клеточного цикла, репарации ДНК и апоптоза в развитии рака яичников
- Анализ мутаций c.5266dupC, c.l81T G и c.4034delA в гене BRCA1 у , больных раком яичников
- Изучение варианта c.3855insl23 в гене MDC1 (Mediator of DNA 7 damage checkpoint 1) у женщин с онкопатологией
- Анализ ассоциации полиморфных локусов «762551 в гене CYP1A2, «2740574 в гене CYP3A4, «1056836 в гене CYP1B1, «4680 в 133 гене СОМТи «700519 в гене CYP19 с риском развития рака яичников
Введение к работе
Актуальность проблемы. Во всем мире проблема заболеваемости и смертности, связанная с онкологическими заболеваниями, на протяжении многих лет занимает лидирующие позиции и является актуальной. Ежегодно от рака умирают более 4 млн. человек во всем мире (Pertmuth-Wey et al., 2009). В России за последние два десятилетия отмечается неуклонный рост показателей заболеваемости злокачественными новообразованиями, а также тенденция к "омоложению" рака.
Рак яичников (РЯ) занимает первое место по смертности среди гинекологических раков, поскольку часто заболевание диагностируется на поздних стадиях развития (III или IV). В России ежегодно регистрируют более 12000 случаев заболевания раком яичников (Чиссов с соавт., 2011). Высокий уровень заболеваемости наблюдается также в Республике Башкортостан (РБ). Ежегодно выявляют более 700 случаев рака яичников, при этом, наблюдается высокий уровень смертности от данного заболевания, около 400 человек в год (Ручкин с соавт., 2011; Кудряшова с соавт., 2012).
На сегодняшний день не вызывает сомнения ведущая роль генетических факторов в развитии рака яичников. Высокий риск развития заболевания в первую очередь связан с нарушениями в генах BRCA1 и BRCA2 (Antoniou et al., 2005; Janavicius, 2010). Продукты этих генов вовлечены в общий сигнальный путь ответа клетки на повреждения ДНК, который включает в себя множество участников: BRCA1, BRCA2, CHEK2, NBN, ATM, MDC1, PALB2, RAD51D, TP53, MRE11 и другие (Petrini et al., 2003). Нарушения в генах, которые являются компонентами процессов передачи сигнала о повреждении ДНК, регуляции клеточного цикла, репарации ДНК и апоптоза, вовлечены в развитие опухолей различной локализации, в том числе РЯ (O'Donovan et al., 2010).
Эпидемиологические исследования указывают на то, что семейная история заболевания, гормональный статус, возраст, бесплодие, образ жизни, вредные привычки играют важную роль в развитии РЯ (Permuth-Wey et al., 2009).
Рак яичников относят к гормонозависимым опухолям и нарушения метаболизма эстрогенов являются одним из факторов канцерогенеза. Эстрогены могут напрямую или опосредованно влиять на образование опухоли. Под воздействием эстрогенов могут возникать спонтанные ошибки репликации ДНК. Продукты метаболизма эстрогенов содержат активные формы кислорода и могут участвовать в повреждении ДНК. Также эстрогены способствуют пролиферации клеток с возникшей мутацией (Заридзе, 2004). Генетические нарушения в генах метаболизма эстрогенов могут приводить к изменению активности ферментов, что также может способствовать развитию гормонозависимых опухолей.
Для всестороннего и комплексного изучения рака яичников эпидемиологами, клиницистами, генетиками создан международный консорциум для проведения масштабных исследований, в том числе и полногеномного анализа ассоциаций (GWAS), который направлен на поиск новых генов, вовлеченных в патогенез заболевания (Song H. et al., 2009). В результате GWAS были обнаружены новые гены- кандидаты: BNC2, MERIT40, HOXD1, TiPARP, MYC, SKAP1 и TERT, ассоциированные с раком яичников (Goode et al., 2008; Song et al., 2009; Goode et al., 2010, Bolton et al., 2010, Beesley et al., 2011, Bolton et al., 2012; Pharoah et al., 2013).
Изучение генетических факторов рака яичников проводится и в России, которое, главным образом, сконцентрировано в Москве и Санкт-Петербурге (Хансон с соавт., 2000; Suspitsin et al., 2009; Любченко с соавт., 2010). В Республике Башкортостан существует значительное своеобразие генофонда населения, формирование которого имеет длительную и сложную историю, что должно отражаться на структуре заболеваемости онкопатологиями, в том числе и рака яичников.
На основании всего вышеизложенного нами были сформулированы цель и задачи исследования.
Цель работы: молекулярно-генетическое изучение рака яичников в Республике Башкортостан.
Задачи исследования:
-
Провести скрининг мутаций c.5266dupC, a181T>G и c.4034delA в гене BRCA1, c.5946delT в гене BRCA2, CHEK2dele9,10(5kb), c.444+1G>A, c.1100delC и c.470T>C в гене CHEK2, ^5932G>T в гене ATM, c.657del5 в гене NBN, инсерции с.3855їш123 в гене MDC1 у больных РЯ.
-
Провести поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене PALB2 у больных раком яичников.
-
Провести поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене RAD51D у больных раком яичников с семейной формой заболевания.
-
Изучить динамику репарации ДНК от двунитевых разрывов после воздействия радиации в клетках (LCL), гомозиготных по инсерции с.3855їш123 в гене MDC1.
-
Провести анализ ассоциации 8 однонуклеотидных полиморфных вариантов rs3814113 в регионе 9p22.2, rs8170 в гене MERIT40, rs2072590 в регионе 2q31, rs2665390 в гене TiPARP, rs10088218 в регионе 8q24, rs9303542 в гене SKAP1, rs2736108 и rs2736109 в гене TERT с риском развития рака яичников.
-
Провести анализ ассоциации 5 полиморфных локусов rs762551, rs2740574, rs1056836, rs4680 и rs700519 в генах метаболизма эстрогенов CYP1A2, CYP3A4, CYP1B1, COMT и CYP19, соответственно, с риском развития рака яичников.
Научная новизна исследования. Проведено молекулярно-генетическое изучение рака яичников в Республике Башкортостан на репрезентативных выборках больных РЯ (n=243) и контрольной группы (n=374). С высокой частотой обнаружена мутация c.5266dupC в гене BRCA1 (5,3%). У больных РЯ впервые выявлена мутация p.R145W в гене CHEK2 с частотой 0,8% у женщин русского и татарского происхождения. Впервые обнаружены мутация c.172_175delTTGT в гене PALB2 у больной РЯ (0,4%) русской этнической принадлежности и новый полиморфный вариант c.26T>A (p.L9L).
Впервые дана оценка ассоциации полиморфных вариантов rs3814113 в регионе 9p22.2, rs8170 в гене MERIT40, rs2072590 в регионе 2q31, rs2665390 в гене TiPARP, rs10088218 в регионе 8q24, rs9303542 в гене SKAP1, rs2736108 и rs2736109 в гене TERT с раком яичников при анализе больных из РБ. Обнаружена ассоциация полиморфного локуса rs2072590, расположенного на хромосоме 2q31, c РЯ в общей выборке больных (OR=1.5, 95% CI 1.0-2.1, p=0.045). Выявлена ассоциация полиморфного варианта rs8170 в гене MERIT40 с риском развития РЯ у русских (OR= 0.5; 95% CI 0.3-0.9, p=0.03).
Проведен анализ ассоциации 5 полиморфных вариантов генов системы метаболизма эстрогенов rs762551/CYP1A2, rs2740574/CYP3A4, rs105683/CYP1B1, rs4680/COMT и rs700519/CYP19 с РЯ у женщин из РБ. Показано, что данные полиморфные варианты не являются маркерами риска развития рака яичников.
Научно-практическая значимость работы. Данные, полученные в результате нашего исследования, расширяют знания о генетических основах предрасположенности к развитию рака яичников. Результаты диссертационной работы востребованы при медико-генетическом консультировании в Республике Башкортостан и при проведении ДНК - тестирования.
Материалы диссертации могут быть включены в курс лекций биологических факультетов университетов, медицинских ВУЗов, на курсах повышения квалификации медицинских работников.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на Всероссийской конференции, посвященной 10-летию кафедры генетики БГПУ им. М. Акмуллы, приуроченной к ежегодным Вавиловским чтениям (Уфа, 2009); VI съезде общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010); II Всероссийской научно- практической конференции "Медико-биологические аспекты мультифакториальных патологий" (Курск, 2011); Международной конференции по генетике человека (Amsterdam, 2011); II Всероссийской школе молодых ученых уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии (Уфа, 2011); V Всероссийской конференции с международным участием "Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век нанотехнологий (Санкт-Петербург, 2012); Всероссийской школе-конференции молодых ученых: "Актуальные проблемы генетики человека, животных, растений и микроорганизмов" (Уфа, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, из которых 6 статей в иностранных журналах и 2 в российских изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 190 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, главы результатов исследований и их обсуждений, выводов и перечня цитируемой литературы, состоящего из 297 источников (12 отечественных и 285 зарубежных). Рукопись содержит 36 таблиц и 60 рисунков.
Благодарность. Автор данной работы выражают благодарность доктору биологических наук, профессору Эльзе Камилевне Хуснутдиновой, доктору естественных наук T. Doerk и доктору естественных наук Богдановой Н.В.
Роль генов систем передачи сигнала о повреждении ДНК, регуляции клеточного цикла, репарации ДНК и апоптоза в развитии рака яичников
В основе канцерогенеза лежат повреждения генетического аппарата клетки, в первую очередь, накопление разнообразных мутаций в онкогенах и генах-супрессорах опухолей, которые являются важными участниками общих сигнальных путей, контролирующих целостность генома, клеточный цикл, апоптоз и дифференцировку клеток. Существует большое число онкогенов и генов-супрессоров, вовлеченных в формирование злокачественных новообразований яичников [56].
Высокий риск заболевания раком яичников в первую очередь ассоциирован с генами BRCA1 (Breast cancer 1 gene) и BRCA2 (Breast cancer 2 gene) [10]. Продукты этих генов вовлечены в процессы регуляции пролиферации клеток, стабильности генома и репарации ДНК посредством механизмов гомологичной рекомбинации [63]. Из-за ошибок репарации происходят нарушения работы генов, контролирующих клеточный цикл и апоптоз. Накопление подобных ошибок играет ключевую роль в канцерогенезе [200].
Ген BRCA1, открытый в 1994 году, локализован на хромосоме 17q21-12, состоит из 22 экзонов и кодирует белок размером 1863 аминокислоты. Продукт гена BRCA1 является важным участником репарации ДНК с помощью гомологичной рекомбинации [289]. Белок BRCA1 содержит несколько важных функциональных сайтов связывания с различными белковыми продуктами генов, вовлеченных в процесс репарации ДНК. На СООН-конце белка BRCA1 расположен домен BRCT, который является важной областью белковых взаимодействий и необходим для фосфорилирования многими белками в ответ на взаимодействие с белком BRIP1 (Breast cancer 1-interacting protein). На 1ЧН2-конце расположен RING-домен, который обладает убиквитинлигазной активностью. BRCA1 может взаимодействовать с протеином BARD1, как убиквитинлигаза ЕЗ с радиационно-активным Н2АХ [160] или с прогестероновым рецептором [199] и/или с эстрогеновым рецептором альфа [68]. Ближе к МН2-концу располагается мотив сигнальной ядерной локализации, который необходим для транспорта белка BRCA1 в ядро [107]. В центральной части протеина локализован ДНК-связывающий домен, необходимый для взаимодействия с СНЕК2 (Checkpoint kinase 2). К нему прилегает регион Р кластера, который имеет многочисленные сайты фосфорилирования для белков ATM (Ataxiaelangiectasia mutated gene) и ATR (Ataxiaelangiectasia and Rad3-related) [294]. Также в данной области локализован домен С, необходимый для взаимодействия с белком PALB2 (Partner and locolizer of BRCA2) [292] (Рисунок 5).
После воздействия ионизирующего излучения белок BRCA1 фосфорилируется активным ATM в позициях Ser-1387, Ser-1423 и Ser-1524 [92], а также киназой СНЕК2 в позиции Ser-988 [50]. В ответ на повреждение ДНК протеин BRCA1 опосредовано через взаимодействие с белком BRCA2 способствуют локализации в сайтах повреждения ДНК протеина RAD51, который является важным участником репарации двунитевых разрывов [227]. Согласно литературным данным, белок BRCA1 локализуется в местах повреждения ДНК совместно с комплексом Rad50-Mrell-NBS1 и является его регулятором [282; 297]. Подавляя нуклеазную активность Mrell, белок BRCA1 способствует репарации ДНК с помощью гомологичной рекомбинации. Действительно в некоторых исследованиях выявлены нарушения гомологичной рекомбинации в клетках дефицитных по BRCA1 [171]. Кроме того, белок BRCA1 локализуется вместе с фосфорилированным гистоном уН2АХ, который является важным датчиком сигнала о повреждении ДНК [188]. Известно, что белок BRCA1 участвует в активации тирозин киназы С-АЫ, которая локализуется в цитоплазме и ядре. Ядерная С-АЫ активируется разнообразными генотоксическими агентами и индуцирует апоптоз, регуляцию транскрипции и репарацию ДНК [87]. Кроме того, белок BRCA1 может выступать как регулятор транскрипции р53, а также в остановке клеточного цикла через активацию р21 [238]. Таким образом, BRCA1 выполняет важные функции в контроле ответа клетки на повреждение ДНК, процессах репарации и регулирования клеточного цикла.
В 1995 году был открыт другой важный участник репарации ДНК продукт гена BRCA2 [281]. Ген BRCA2, локализованный на xpoMocoMel3ql2.3, содержит 27 экзонов и кодирует белок размером 3418 аминокислот [250]. Белок BRCA2 содержит сайты связывания с важными участниками передачи сигнала о двунитевых разрывах и репарации ДНК [289]. N-концевая область белка BRCA2 содержит участки связывания для белков PALB2 (partner and localizer of BRCA2), CAF1 (Chromatin assembly factorl) и EMSY (Partner and localizer of Breast cancer 2 и Chromosome 11 open reading frame 30) [114; 283]. Протеин PALB2 способствует локализации BRCA2 в хроматине. Белок CAF1 необходимым для сборки октамеров гистонов в репарации ДНК. EMSY осуществляет негативную регуляцию активации функции BRCA2. В центральной части белка расположены BRC повторы, состоящие из 8 аналогичных последовательностей, которые необходимы для связывания с RAD51 [190]. Кроме того, на С-терминальном конце расположен дополнительный сайт для связывания с RAD51 [72]. Ближе к центральной области продукта гена BRCA2 расположен сайт связывания с DMC1 (Dosage suppressor of mckl homolog, meiosis-specific homologous) [257], гомологом RAD51 и FANCD2 (Fanconi anemia, complementation group D2) [115]. Белок BRCA2 содержит ДНК-связывающий домен (DBD), для взаимодействия с протеина DSSl (Deletedinsplit-hand/split-foot 1 region), необходимого для поддержания стабильности белка BRCA2 (рисунок 6).
Согласно литературным данным, белок BRCA2 непосредственно участвует в процессе репарации ДНК с помощью гомологичной рекомбинации. Известно, что BRCA2-fle H4HTHbie клетки обладают высокой чувствительностью к ионизирующей радиации, что свидетельствует о нарушениях в репарации двунитевых разрывов ДНК [172]. Белок BRCA2 имеет несколько сайтов связывания с основным белком гомологичной рекомбинации RAD51 [72]. Протеин BRCA2 регулирует внутриклеточную локализацию и функцию протеина RAD51[61]. После повреждения ДНК, белок BRCA2 локализуется совместно с фосфорилированным гистоном уН2АХ и белком EMSY, которые осуществляют негативную регуляцию его функции в контроле процесса транскрипции. В некоторых работах обнаружено, что высокая экспрессия белка EMSY ассоциирована со спорадическими опухолями яичников высокой степени злокачественности, что указывает на возможную роль нарушений в работе белка BRCA2 в развитии спорадических форм рака яичников [114]. Согласно литературным данным, у женщин с нарушениями в генах BRCA1 и BRCA2 риск заболевания раком яичников возрастает на 45-60% и 11-35%, соответственно [267]. У носительниц мутаций в гене BRCA1 рак яичников диагностируется в более раннем возрасте. Было показано, что средний возраст развития заболевания у носительниц мутаций в гене BRCA1 составляет 52 года, у носительниц мутаций в гене BRCA2- 62 года, при спорадических формах - 63 года [36]. Кроме того, женщины с мутациями в генах BRCA1 и BRCA2 имеют повышенный риск развития злокачественных новообразований другой локализации - эндометриального рака, рака поджелудочной железы, рака простаты, рака толстой кишки [124; 243]. А также, около 30% женщин с диагнозом рак фаллопиевых труб являются носительницами мутаций в генах BRCAJ или BRCA2 [273].
Основным сенсором в передаче сигнала о повреждении ДНК выступает комплекс MRN (MRE11, RAD50, NBN). Важной регуляторной единицей комплекса является белок NBN, который необходим для его локализации в местах повреждения ДНК [35]. Протеин NBN на С-конце содержит сайт для связывания с белком ATM, что способствует доставке ATM в места повреждения ДНК [75].
Биаллельная иннактивация гена NBN (Nijmegen breakage syndrome 1 (nibrin)) приводит к развитию синдрома Нижмегена. Это аутосомно-рецессивное заболевание, характеризующееся повышенной хромосомной нестабильностью, иммунодефицитом и повышенной радиочувствительностью [228]. У больных этим синдромом часто встречаются злокачественные опухоли различной локализации, развитие которых происходит возрасте до 21 года [112]. У родственников больных с синдромом Нижмегена наблюдается повышенная частота развития злокачественных опухолей [31]. Обнаружена ассоциация гетерозиготного носительства мутаций в гене NBN с некоторыми типами солидных злокачественных опухолей [179] и раком молочной железы [26]. Для клеточных линий дефектных по NBN характерны спонтанная хромосомная нестабильность [247] и повышенная чувствительность к радиационно индуцированным хромосомным аберрациям [177], а в экспериментах на мышах было продемонстрировано, что гетерозиготные мутации в гене NBN могут провоцировать злокачественное перерождение клеток [67]. Эти данные указывают на важную роль гена NBN в патогенезе злокачественных новообразований.
Другим важным участником ответа клетки на воздействие ионизирующего излучения является продукт гена АТМ (Ataxia telangiectasia mutated) [231]. Белок ATM является основным трансдуктором в передаче сигнала о двунитевых разрывах ДНК [142]. После возникновения повреждения ДНК происходит автофосфорилирование протеина ATM в позиции Ser-1981 и его доставка в места двунитевых разрывов с помощью комплекса MRN [23]. Активный белок ATM фосфорилирует соседние гистоны Н2АХ с образованием уН2АХ [75]. Затем, с помощью белка MDC1, активный ATM фосфорилирует более отдаленные молекулы гистонов Н2АХ, создавая, тем самым, положительную обратную связь [151]. Кроме того, в ответ на повреждение ДНК киназа ATM фосфорилирует протеины BRCA1, СНЕК2, р53 и другие, выполняющие важные функции в процессах репарации ДНК, проверки клеточного цикла и апоптоза [162; 14; 222].
Инактивация обоих аллелей гена ATM приводит к развитию аутосомно-рецессивного синдрома Атаксия-Телеангиэктазия для которого характерны имунодифицит, повышенная чувствительность клеток к радиации и высокий риск возникновения злокачественных новообразований [94]. Эпидемиологические исследования указывают на то, что у родственниц пациентов с Атаксией-Телеангиэктазией в значительной степени повышен риск развития онкологических заболеваний [256; 183; 46]. Мутации в гене А ТМ ассоциированы с развитием наследственной формы рака яичников [258].
Анализ мутаций c.5266dupC, c.l81T G и c.4034delA в гене BRCA1 у , больных раком яичников
Выбор мутаций c.5266dupC, c.4034delA, C.181T G в гене BRCAl был основан на данных о частоте мутаций в популяциях Восточной Европы и Западной части России. Спектр и частота мутаций варьируют между различными популяциями и регионами [212; 98; 164; 158; 27; 195].
Скрининг мутации c.5266dupC (5382insC) в гене BRCA1 В группе больных РЯ (п=243) проведен поиск мутации c.5266dupC, локализованной в 20 экзоне гена BRCAl. Инсерция цитозина в позиции 5266 кДНК приводит к сдвигу рамки считывания и формированию преждевременного стоп-кодона, в результате чего образуется укороченный белок без BRCT домена, необходимого для связывания с другими белками и взаимодействия с транскрипционными факторами [53]. Мутация c.5266dupC встречается в большинстве европейских стран, но наибольшей частоты распространения достигает в Восточной Европе [95; 185; 138; 146; 259; 82; 27; 104].
Поиск мутации c.5266dupC гена BRCA1 выполнен методом ПДРФ анализа с использованием эндонуклеазы рестрикции Ddel. Под воздействием рестриктазы ПЦР-продукт длиной 270 п.н., содержащий мутантный аллель, делится на 2 фрагмента - 248 п.н. и 22 п.н. Участок ДНК, содержащий аллель «дикого» типа, не расщепляется (рисунок 16). Все позитивные случаи подтверждены прямым секвенированием (рисунок 17).
В выборке больных раком яичников выявлено 13 пациенток с мутацией c.5266dupC, что составляет 5.3%. Средний возраст манифестации заболевания у носительниц изучаемого нарушения 51 лет. По этническому составу женщины с мутацией с.5266с1ирСпринадлежат к разным этническим группам: русские - 5, татары - 5, башкиры -2, украинцы -1 (рисунок 18).
У одной носительницы инсерции в семье отмечается РМЖ, еще у одной пациентки имеется семейная история РЯ (вторая степенью родства). Для 8 носительниц мутации c.5266dupC характерно двустороннее поражение яичников. У больных с инсерцией клетки опухоли были преимущественно умеренной и низкой степени дифференцировки (G2-G3). Для носительниц инсерции характерен серозный рак яичников - 9/13. Четыре пациентки находились в менопаузе в момент постановки диагноза.
Известно, что риск развития рака яичников в течение жизни у женщин с мутацией в гене BRCA1 повышается на 37-62% [118]. Согласно литературным данным, наиболее распространенной мутацией в популяциях Восточной Европы и Западной части России является c.5266dupC [165; 244]. При сравнении частоты мутации c.5266dupC среди больных РЯ и здоровых женщин была обнаружена значительная ассоциация анализируемого нарушения в гене BRCA1 с повышенным риском развития заболевания (OR: 10.3, 95% СІ (2.3-46.0), р=0.0005) (рисунок 19).
Скрининг мутации C.181T G (300T G. P.C61G) в гене BRCA1 Мутация c.l81T G (p.C61G) -миссенс-мутация, локализованная в участке RING домена гена BRCA1, который необходим для связывания с белком BARD1 (BRCA1 associated RING domain 1). Данная мутация приводит к потере убиквитин-лигазной активности белка BRCA1 [38].
Анализ мутации p.C61G выполнен с помощью аллель-специфичной ПЦР, в результате чего амплифицировался продукт размером 221 п.н. В качестве внутреннего контроля ПЦР использован фрагмент гена MDC1, размером 353 п.н. (рисунок 20). Все позитивные случаи подтверждены секвенированием (рисунок 21).
Мутация C.181T G выявлена у 3/243 (1,2%) пациенток с РЯ. Средний возраст манифестации заболевания у женщин с данной мутацией 47 лет. У одной пациентки наблюдались случаи заболевания РМЖ в семье (I степень родства). По этническому составу группа носительниц мутации C.181T G неоднородна: татарки - 2; русские - 1.
У всех пациенток с изучаемой мутацией выявлено поражение обоих яичников. Клетки опухоли преимущественно низкой степени дифференцировки (G3). У двух пациенток наблюдается поражение лимфоузлов и метастазы. Носительницы анализируемой мутации имеют опухоли серозного типа.
У одной пациентки с мутацией C.181T G репродуктивная функция на начало развития заболевания была сохранена. У двух женщин диагноз поставлен в период постменопаузы.
Скрининг мутации c.4034delA (4153delA ) в гене BRCA1.
В результате мутации c.4034delA, расположенной в 11 экзоне гена BRCA1, происходит сдвиг рамки считывания, в результате чего появляется преждевременный стоп кодон.
Анализ мутации c.4034delA выполнен с помощью аллель-специфичной ПЦР, в качестве внутреннего контроля ПЦР использован фрагмент гена А ТМ, размером 269 п.н. Размер ПЦР продукта, содержащий мутацию c.4034delA, -131 п.н. (рисунок 22).
Делеция аденина в позиции 4034 кДНК ранее была обнаружена у женщин с раком яичников, проживающих в Польше (2%), Латвии (5,1%), Белоруссии (11,9%) и России (0,7%) [165; 244; 27; 195]. Высокая частота мутации c.4034delA гена BRCA1 у больных РЯ из Белоруссии свидетельствует в пользу эффекта основателя данного нарушения в популяции региона. В России делеция выявлена с низкой частотой. В нашей работе носители мутации c.4034delA гена BRCA1 не идентифецированы.
Наличие зародышевых мутаций в гене BRCA1 является важным генетическим фактором, предрасполагающим к развитию рака яичников и рака молочной железы. Мутации в генах BRCA1 и BRCA2 ответственны за половину семейного РЯ с двумя и более случаями заболевания в семье [207]. Считается, что 5-15% всех случаев заболевания раком яичников, вызваны мутациями в этих генах [73; 207]. Нарушения в генах BRCA1 и BRCA2 обнаружены на всем протяжении кодирующей области и в сайтах сплайсинга. Основными мутациями в этих генах являются мутации сдвига рамки считывания, нонсенс мутации или мутации сайтов сплайсинга, которые приводят к преждевременной остановке синтеза белка. Идентифицировано несколько функционально значимых миссенс мутаций. Также, обнаружено множество вариантов, не оказывающих патологического воздействия на функцию генов. Спектр и частота мутаций варьируют между разными географическими регионами и различными этническими группами [207] (таблица 2).
Изучение варианта c.3855insl23 в гене MDC1 (Mediator of DNA 7 damage checkpoint 1) у женщин с онкопатологией
Продукт гена MDC1 является важным модулятором в процессе передачи сигнала о повреждении ДНК. Известно, что после возникновения двунитевых разрывов ДНК в местах повреждения локализуется комплекс MRN (MRE11/RAD50/NBN), который необходим для активациии локализации ATM в сайтах повреждения [35; 266]. В свою очередь, активный ATM фосфорилирует прилегающие гистоны Н2АХ [40]. Затем, MDC1 связывается с фосфорилированными гистонами (у-Н2АХ) через BRCT домен и непосредственно с ATM через FHA домен или опосредовано через NBN. Взаимодействие MDC1 с ATM способствует пролонгированной локализации ATM в местах двунитевых разрывов ДНК и фосфорилированию отдаленных молекул гистонов Н2АХ, что, в свою очередь, содействует распространению и усилению первоначального сигнала о повреждении [151]. Таким образом, MDC1 действует не только как сенсор о повреждении хроматина (взаимодействуя с у-Н2АХ), но и как сенсор для активации ATM [236]. Также, MDC1 способствует локализации убиквитинлигазы RNF8, которая присоединяет молекулы убиквитина (Ub) к гистонам Н2А и Н2АХ. Белок RNF8 связывает убиквитинированные гистоны и катализирует образование на них поли-убиквитининовых цепей. Описанные события необходимы для локализации важных участников процесса ответа клетки на повреждение ДНК, таких как, 53ВР1 и комплекса BRCA1-Abraxas-RAP80 [276]. Кроме того, протеин MDC1 вовлечен в процессы репарации ДНК с помощью негомологичной и гомологичной рекомбинации, участвует в активации и деактивации точек проверки клеточного цикла, а также в регуляции митоза [65; 284; 155; 262].
В результате совместных исследований с коллегами из Медицинской школы Ганновера (Германия) при анализе гена MDCI была выявлена ранее не описанная в литературе инсерция c.3855insl23, приводящая к удлинению белкового продукта на 41 аминокислоту. Анализ ассоциации варианта c.3855ins!23 в гене MDC1 с риском развития рака яичников Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов варианта с.З 85 5 ins 123 в гене MDC1 между больными раком яичников и контролем, а также женщинами с раком молочной железы и контрольной группы не выявил достоверных различий. Интересным был факт определения в выборке больных РМЖ двух гомозигот по инсерции 123 пар нуклеотидов в гене MDC1 (таблица 8, 9).
Для изучения функциональной значимости данного варианта были проведены ряд экспериментов. Выполнены исследования оценки влияния данной инсерции на динамику репарции ДНК при двуцепочечных повреждениях ДНК in vitro.
Установлена лимфобластоидная клеточная линия от пациентки с РМЖ, гомозиготной носительницы инсерции c.3855insl23 в гене MDCl.c помощью иммортализации периферических В-лимфоцитов крови вирусом Эпштейна-Барра (EBV).
В дальнейшем, мы провели облучение с дозой 6 Гр клеток нескольких клеточных линий. В работе были использованы лимфобластоидные клеточные линии любезно предоставленные d. d. Т. Doerk: -L 325 — клеточная линия здорового донора;
-L 493 - клеточная линия, полученная от гомозиготной носительницы варианта c.3855insl23 в reneMDCJ; -L 226 - клеточная линия дефицитная по NBN;
-L 56 - клеточная линия дефицитная по ATM.
В клетках дефицитных по ATM наблюдаются нарушения в активации точек проверки клеточного цикла и репарации двунитевых разрывов [122; 86]. Для клеток от пациентов с синдромом Ниджмегена характерны частые хромосомные аберрации, гиперчувствительность к ионизирующей радиации, нарушения в работе точек проверки клеточного цикла, снижение уровня гомологичной рекомбинации и более быстрое укорорачивание теломер [230]. После облучения (6 Гр) клеток, проведен Вестерн блот анализ содержания белков SMC1, КАРІ, СНЕК2, фосфорилированных в позициях Ser-969, Ser-824 и Ser-19, соответственно, в облученных и не облученных клеточных линиях. Анализируемые протеины являются основными эффекторами белка MDC1.
Белок SMC1 (Structural maintenance of chromosomes 1) выполняет важную роль в процессах сцепления сестринских хроматид, конденсации хромосом, рекомбинации и репарации ДНК. В ответ на повреждение ДНК белок MDC1 опосредованно через фосфорилирование белков ATM и NBS1 регулирует активацию протеина SMC1[241].
Фактор конденсации хроматина КАРІ (Kruppel-associatedBox (KRAB)-associatedprotein 1) в ответ на повреждение ДНК фосфорилируется белком ATM в позиции Ser-824. Фосфорилированный КАРІ взаимодействует с конденсированным хроматином и вызывает релаксацию нуклеосом. В отсутствие фосфорилированного КАРІ происходит задержка репарации гетерохроматина [64; 290]. Белок MDC1 регулирует фосфорилирование протеина КАРІ [178].
Киназа СНЕК2 считается основным эффектором протеина ATM и необходим для деградации фосфатазы Cdc25A, препятствуя, тем самым, активации циклин-зависимой киназы Cdk2 и инициации репликации ДНК [78]. Кроме того, протеин СНЕК2 выполняет важную функцию в активации белка р53 -важного участника апоптоза. В ответ на ионизирующее излучение белок через FHA домен связывается с фосфорилированным протеином СНЕК2 и способствует фосфорилированию протеина р53 [152].
В качестве количественного контроля мы использовали (3-actin (рисунок 40).
В результате проведенного анализа не было обнаружено различий в количестве белковых продуктов SMC1, КАРІ, СНЕК2 между клетками линий здорового донора и клетками, гомозиготными по варианту c.3855insl23 в гене MDC1, однако наблюдались значительные различия между клетками линий дикого типа и дефицитными по NBN и ATM.
Для оценки уровня двунитевых разрывов ДНК и эффективности их репарации использовался метод анализа флуоресцентных фокусов белков репарации ДНК уН2АХ и 53ВР1.
у-Н2АХ - это фосфорилированный в позиции Ser-139 гистон Н2АХ. у-Н2АХ является маркером повреждения ДНК, так как, появляется через несколько минут после образования двунитевых разрывов, помечая области хроматина, прилегающие к участку двунитевых разрывов [215]. у-Н2АХ является прямой мишенью MDC1. BRCT домен белка MDC1 обладает высокой специфичностью С-концу только фосфорилированной формы гистона Н2АХ, таким образом, MDC1 выступает в качестве специфического сенсора для у-Н2АХ [242].
53ВР1 - крупный медиаторный белок, принимающий участие в процессе передачи сигнала о повреждении ДНК [70]. MDC1 через BRCT домен напрямую связывается с центральной областью белка 53ВР1. Данное взаимодействие способствует локализации белка 53ВР1 в местах двунитевых разрывов [116].
Анализ ассоциации полиморфных локусов «762551 в гене CYP1A2, «2740574 в гене CYP3A4, «1056836 в гене CYP1B1, «4680 в 133 гене СОМТи «700519 в гене CYP19 с риском развития рака яичников
Рак яичников относится к гормонозависимому типу опухоли и риск развития данного заболевания напрямую или опосредовано может быть связан с половыми гормонами, в частности, с эстрогенами [108]. Считается, что эстрогены, в большей мере за счет стимуляции пролиферации клеток в органах-мишенях, могут приводить к образованию опухоли.
На сегодняшний день основной концепцией развития гормонозависимых опухолей являются нарушения в метаболизме эстрогенов, которые приводят к увеличению концентрации циркулирующих в крови гормонов или локальному повышению их содержания в тканях-мишенях [233]. Генетическая природа таких нарушений может способствовать развитию заболевания.
Полиморфные варианты или мутации генов синтеза и трансформации эстрогенов, изменяющие активность ферментов или нарушающие их функцию, могут быть вовлечены в развитие эстроген-индуцируемого рака. Эстрогены потенциально способны вызвать увеличение числа спонтанных ошибок в результате репликации ДНК. Стимулируя пролиферацию, эстрогены могут способствовать увеличению числа клеток с возникшей мутацией. С другой стороны, продукты окисления эстрогенов, катализируемого изоформами цитохрома Р450 (CYP), такие как катехолэстрогены, семихиноны и хиноны, содержат активные формы кислорода и являются электрофильными молекулами, которые могут участвовать в повреждении ДНК. Продукты метаболизма эстрогенов могут приводить к возникновению мутаций, которые, в свою очередь, опосредуют развитие опухоли.
Литературные данные, в которых отражены исследования полиморфных вариантов генов метаболизма эстрогенов при развитии гормонозависимых опухолей, противоречивы.
Анализ ассоциации полиморфного варианта «762551 в гене CYP1A2 с риском развития рака яичников
Полиморфный вариант ra762551(CYPlA2 lF) (нуклеотидная замена цитозина на аденин в первом интроне гена CYP1A2 в позиции 734 ниже первого транскрипционного нуклеотида) приводит к повышению ферментативной активности CYP1A2 [221]. В ряде исследований показано, что аллель С данного полиморфного локуса, ассоциированный с низкой активностью фермента, чаще встречается у женщин с гормонозависимыми типами опухолей [220; 166].
Нами был проведен анализ полиморфного варианта «762551 в гене CYP1A2 в группе больных РЯ (п=236) и контроле (п=368). Идентификация аллелей выполнена методом ПДРФ анализа.
ПЦР-продукт дикого типа длиной 920 п.н. под воздействием эндонуклеазы рестрикции Bspl20I расщепляется на два фрагмента длинной 709 и 211 п.н. Мутантный аллель не расщепляется (рисунок 55).
При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта «762551 в гене CYP1A2 между больными РЯ и здоровыми женщинами в общей выборке (таблица 26) и с учетом этнической принадлежности (таблица 27) (русские, татары, башкиры), достоверных различий не выявлено (р 0.05).
В нашем исследовании обнаружена ассоциация полиморфного варианта rs!6255\ в гене CYP1A2 с риском развития рака яичников у женщин из Республики Башкортостан, однако «рисковый» аллель С встречался с несколько большей частотой среди больных раком яичников (33%) по сравнению со здоровыми донорами (30%). Полученные нами результаты не согласуются с данными из работы Mikhailova et al. (2006), где была выявлена ассоциация аллеля А полиморфного варианта «762551 в гене CYP1A2 с раком яичников (OR: 0.50, 95%, СІ (0.34-0.74), р=0.0003) [166].
Анализ ассоциации полиморфного варианта «2740574 в гене CYP3A4 с риском развития рака яичников
Полиморфный вариант «2740574 (CYP3A4 1B) локализован в 5 -регуляторной области гена CYP3A4. Согласно исследованиям in vitro CYP3A4 1B приводит к увеличению каталитической активности фермента в 1.5-2 раза [17]. Фермент CYP3A4 играет важную роль в окислении эстрогенов и превращении их в 16-гидроксиэстрогены, высокая скорость образования которых вызывает состояние гиперэстрогенемии. Известно, что доминирование 16-гидроксиэстрона над 2-гидроксиэстрогенами повышает риск заболевания раком матки или молочной железы [21; 147].
Мы провели поиск полиморфного варианта «2740574 в гене CYP3A4 среди больных РЯ (п=235) и здоровых женщин (п=366). Идентификация аллелей выполнена методом ПДРФ анализа.
В норме ПЦР-продукт длиной 334 п.н. под воздействием эндонуклеазы рестрикции PstI расщепляется на три фрагмента длинной 220, 81 и 33 п.н. При наличии мутантного аллеля получается четыре фрагмента длинной 199, 81, 33 и 21 п.н. (рисунок 56).
Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта «2740574 в гене CYP3A4 не выявил достоверно значимых различий между больными РЯ и здоровыми донорами (Таблица 28).
В результате анализа распределения генотипов и аллелей полиморфного варианта «2740574 в гене CYP3A4 среди больных РЯ и контрольной группы с учетом этнической принадлежности (русские, татары, башкиры) также не обнаружено достоверных различий (р 0.05) (таблица 29).
В работе Kadlubar с соавт. было обнаружено, что у носительниц аллеля G (CYP3A4 1B), который связан с высокой активностью фермента, риск развития рака молочной железы значительно выше (3.21; CI, 1.62-6.89) [123]. Однако в работе Spurdle с соав. (2002) не было выявлено ассоциации полиморфного локуса CYP3A4 1B с злокачественными заболеваниями у женщин [240]. В одном исследовании показана ассоциация полиморфного варианта «2740574 с повышенным риском развития эндометриального рака [54].
В ходе нашей работы не выявлена ассоциация полиморфного варианта «2740574 в гене CYP3A4a риском развития рака яичников у женщин из РБ.
Анализ ассоциации полиморфного варианта «1056836 в гене CYPlBlc риском развития рака яичников
При раке яичников наблюдается значительное увеличение количества фермента CYP1B1 [161]. Замена лейцина на валин в положении 432 белка (га 1056836), приводит к повышению каталитической активности фермента CYP1B1 [140]. В ряде работ была показана ассоциация полиморфного локуса «1056836 с риском развития РМЖ и РЯ [110; 120].
Мы провели анализ полиморфного локуса «1056836 в гене CYP1B1 среди больных РЯ (п=234) и контрольной группы (п=364) методом ПДРФ анализа.
ПЦР-продукт длиной 650 п.н. расщепляется под воздействием эндонуклеазы рестрикции Есо571 в случае наличия мутантного аллеля на два фрагмента длинной 340 и 310 п.н. (рисунок 57).
