Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор Литературы 9
1.1. Трофоциты яичников насекомых: происхождение, развитие и функция... 9
1.1.2. Политенизация хроматина трофоцитов яичников: формирование первичных политенных хромосом 13
1.1.3. Пространственная организация политенных хромосом трофоцитов 15
1.1.4. Эндомитотичсские преобразования и формирование ретикулярной структуры хроматина в ядрах трофоцитов 17
1.2. Интерфазное ядро: основные принципы ядерной архитектуры 20
1.2.1. История вопроса 21
1.2.2. Современные представления о структуре интерфазного ядра: компартментализация ядра, хромосомные территории, территории активных и неактивных генов, хромосомная динамика, регуляторные взаимодействия между хромосомами 27
1.3. Использование метода микродиссекции для изучения структуры и локализации хромосомных районов 38
1.4. С. erythrocephala (Mg) как объект цитогенетических исследований 40
Глава 2. Материалы и методы 43
Глава 3. Результаты и обсуждение 48
3. 1. Развитие фолликулов и политенных хромосом трофоцитов яичников Сerythrocephala 48
3.1.і. Развитие фолликулов яичников 48
3.1.2. Морфология хроматина трофоцитов яичников С. erythrocephala.Формирование первичных политенных хромосом 53
3.1.2. Формирование вторичных ретикулярных ядер 56
3.1.3. Влияние температуры на динамику изменения морфологии хроматинатрофоцитов С. erhythrocephala 59
3.2. Идентификация первичных политенных хромосом трофоцитов яичников
С. erythrocephala , 61
3.3. Взаиморасположение первичных политенных хромосом в ядрах трофоцитов яичников С. erythrocephala 64
3.4. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) ДНК-библиотек, полученных методом микродиссекции, на первичные политенные хромосомы трофоцитов С. erythrocephala 67
3.4.1. Хромосомо-специфичнал ДНК-библиотека хромосомы 68
3.4.2. Хромосомо-специфичная ДНК-библиотека хромосомы 71
3.4.3. Районо-специфичная ДНК-библиотека хромосомы 73
3.5. FISH ДНК-библиотек на ядратрофоцитов с различной морфологией хроматина 75
3.6. Упорядоченность хроматина в высокополиплоидном ретикулярном ядре:
хромосомные территории 82
Заключение 85
Выводы 86
Литература 87
- Политенизация хроматина трофоцитов яичников: формирование первичных политенных хромосом
- Современные представления о структуре интерфазного ядра: компартментализация ядра, хромосомные территории, территории активных и неактивных генов, хромосомная динамика, регуляторные взаимодействия между хромосомами
- Морфология хроматина трофоцитов яичников С. erythrocephala.Формирование первичных политенных хромосом
- Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) ДНК-библиотек, полученных методом микродиссекции, на первичные политенные хромосомы трофоцитов С. erythrocephala
Введение к работе
Актуальность темы.
Развитие исследований в области структурно-функциональной организации хромосом стимулировало интерес к интерфазному ядру как системе, отражающей репликативную и транскрипционную организацию генетического аппарата. Поиск новых подходов, применение современных молекул яр но-цитогеиетических методов и их адаптация к конкретным объектам необходимы для решения одной из ключевых задач клеточной биологии -изучения структурно-функциональной организации интерфазного ядра.
Трофоциты яичников насекомых - прекрасная модель для изучения важнейших клеточных процессов, происходящих в интерфазном ядре -эндоредупликации, транскрипции, пространственной реорганизации интерфазного хроматина, являющейся ключевым событием в процессе видообразования (Стегний, 1993). Несомненна их огромная роль не только в обеспечении ооцита всеми необходимыми для формирования яйца продуктами, но и в создании видоспецифичной конформации цито- и нуклеоплазмы ооцита, т.е. в вопросах ооплазматической сегрегации (Айзснштадт, 1984).
Молекулярно-цитологическое изучение хроматина трофоцитов яичников Calliphora erythrocephala (Diptera: Calliphoridae) открываег уникальные возможности для выяснения принципов организации генома высших эу кари о г. Формирование политенных хромосом с последующим переходом их материала от сильно компактизоваппого (диски первичных политенных хромосом) к декомпактизованпому состоянию хроматина (ядра с ретикулярной структурой) позволяет оценить значение уровня компактизации хроматина и общей архитектоники интерфазного ядра в процессе оогенеза. Данный объект является уникальным для проведения детального анализа воздействия внутренних и внешних факторов на динамику изменений структурно-функциональной организации ядра.
Цели и задачи исследования.
Целью данной работы является изучение пространственной организации и структуры хроматина трофоцитов яичников С. erythrocephata, изменяющейся в процессе эндоредупликационных преобразований, многократного увеличения степени нлоидности и возрастания уровня экспрессии генома. В ходе работы были поставлены следующие задачи:
Изучить развитие фолликулов яичников и изменение морфологии хроматина трофоцитов.
Идентифицировать первичные политенные хромосомы трофоцитов и проанализировать их пространственное взаиморасположение.
Получить ДНК-библиотеки путем микродилетирования районов и хромосом для изучения пространственной организации хроматина ядер трофоцитов.
Проанализировать локализацию ДНК-библиотек в ядрах трофоцитов с различной морфологией хроматина.
С помощью ДНК-зондов оценить упорядоченность хроматина в ядрах трофоцитов с ретикулярной структурой хроматина.
І Іаучная новизна.
Впервые показано, что по морфологии хроматина трофоцитов яичников С. erythrocephala фолликул визуально можно разделить на три зоны: в зависимости от близости к ооциту, в ядрах трофоцитов хроматин представлен различными морфологическими формами и имеет различную степень конденсации. Проведена идентификация первичных политенных хромосом трофоцитов методом сопоставления с цитологической картой вторичных политенных хромосом и оценена их пространственная организация в ядре. Впервые для изучения архитектуры ядер трофоцитов яичников С. erythrocephala применен метод микродиссекции участков политенных хромосом и подобраны условия проведения флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) полученных ДНК-проб с хроматином трофоцитов. Получена информация об особенностях гибридизации ДНК-проб с хроматином, находящимся на различных стадиях эндомитотического цикла. Впервые показано, что у С. erythrocephala в ядрах
7 трофоцитов яичников, имеющих ретикулярную структуру хроматина, материал отдельных хромосом локализуется в определенных хромосомных территориях.
Основные результаты получены автором самостоятельно. Микродиссекция, DOP-ПЦР и FISH проводились на базе лаб. морфологии и функции клеточных структур (ИЦиГ СО РАН) совместно с д.б.п. Н. Б. Рубцовым и к.б.н. Т.В, Карамышевой.
Практическая ценность работы.
Практический интерес имеет применение методики микродиссекции политенных хромосом для изучения пространственной организации интерфазных ядер, модификация методики флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) для работы с хромосомами трофоцитов яичников насекомых. Работа имеет теоретическое значение в области цитогенетики.
Апробация результатов.
Результаты исследований были представлены на Научных чтениях "Проблемы эволюционной цитогенетики, селекции и интродукции", посвященных 100-летию профессора В.П. Чехова, Томск (1997); Конференции «Сибирская школа молодого ученого», Томск (1998); II Съезде ВОГиС, С-Петербург (2000); XIV Всероссийском совещании «Структура и функции клеточного ядра», С-Петербург (2002); I Съезде Общества клеточной биологии и Международном симпозиуме по проблемам мейоза, С-Пстсрбург (2003).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 7 работ.
Благодарности.
Выражаю глубокую признательность и благодарность В.Н.Стегнию за руководство и помощь в проведении исследований и написании диссертации. Особая благодарность Н.Б.Рубцову и Т.В.Карамышевой за руководство, огромную помощь, максимальное содействие и обсуждение молекулярно-цитологической части раборты. Хочу искренне поблагодарить Т.Г.Зыбину,
8 Б.Н.Кудрявцева, Н.А.Попову и Л.П.Кузнецову за цепные комментарии и проявленный интерес к работе, И.Э.Вассерлауф за постоянную поддержку и ценные советы при написании диссертации, А.К.Сибатаева за методическую и организационную помощь, А.Е.Ведерникова за помощь в культивировании и участие в работе по микродиссекции и флуоресцентной in situ гибридизации. Большое спасибо моим коллегам из лаборатории эволюционной цитогенетики НИИ Биологии и Биофизики за участие, моральную поддержку и постоянный интерес к проводимым исследованиям.
Политенизация хроматина трофоцитов яичников: формирование первичных политенных хромосом
Процесс политеиизации хромосом, происходящий в трофоцитах насекомых на ранних стадиях развития приводит к увеличению количества ДНК до 32-64С и проходит без митотических преобразований ядра. Процесс политеиизации отличается от эндоредупликации полным и необратимым блокированием митотической активности (Бродский, Урывасва, 1981). Если в полиплоидных гепатоцитах мыши наблюдается четкое соответствие между числом центриолей и количеством хромосомных наборов (Онишенко, 1978), то в клетках с политенными хромосомами имеет место полное разобщение циклов репродукции ДНК и центриолей, т.е. отсутствие клеточного центра, содержащего центриоли (Онищенко, 1993). Это относиться как к клеткам, имеющим классические политенные хромосомы (Прокофьсва-Бсльговская, 1986), так и в случае неклассической политении (King, 1970; Жимулев, Лычев, 1972; Зыбина, 1986).
В процессе оогенеза дрозофилы в делениях созревания центриоли отсутствуют, но после завершения мейоза в яйцо мигрирует множество центриолей из питающих клеток. Эта миграция начинается когда будущий ооцит уже определен и происходит перед полиплоидизацией питающих клеток, вероятно в результате пассивного движения цитоплазмы. В ооците было обнаружено от 14 до 17 центриолей. Не все центриоли питающих клеток локализуются в ооците. Причина такой избирательности неизвестна. Позднее эти центриоли локализуются между ядром ооцита и фолликулярными клетками. Затем они агрегируют друг с другом. Дальнейшая судьба центриолей неизвестна - они перестают визуализироваться (Mahowald, Strassheim, 1970; Mahowald et аЦ 1979).
После определения ооцита в трофоцитах начинается эндомитотическая репликация хроматина и формируются политенные хромосомы (Koch, King, 1966; Dej, Spradling, 1999), Политенные хромосомы в трофоцитах яичников впервые были описаны у D. melanogaster Пайіггером и Рейпдорпом. Было показано, что трофоциты D. melanogaster отличаются по размерам и степени компактизации хроматина, которая варьирует от хорошо окрашиваемых хромосом до ядер с ретикулярной структурой (Painter, Reindorp 1939; Хвостова, 1980). Хромосомы трофоцитов укорочены, рыхлые и не имеют дискового рисунка. Такие хромосомы были названы первичными политенными хромосомами (Bier, 1958). Они были обнаружены у CalUphora erihrocephala, LttcUia caesar, Pollentia atromentaria (Bier, 1958), некоторых представителей сем. Larvivoridae (Хвостова, 1980), у видов Drosophila подгруппы melanogaster (Painter, Reindrop, 1939; Степшй, Вассерлауф, 1991; Вассерлауф, Стсгний, 1992).
Во время перехода от 16С к 32С (или от 32С к 64С) первичные политенные хромосомы укорачиваются. По-видимому, коньюгация индивидуальных хроматид нарушается. В результате только некоторые хромомеры контактируют с гомологичными соседними хромомерами, причем, чем крупнее хром ом ер, тем, вероятно, сильнее коньюгация хроматид в этом участке, поэтому особо крупные диски просматриваются и в укороченных хромосомах (Жимулев, 1992).
В оогенезе насекомых с мероистическим типом созревания яйца ооцит и трофоциты происходят из клеток зародышевого пути и трофоцнты несут основную функциональную нагрузку по обеспечению ооцита необходимыми веществами. Следовательно, пространственное расположение хромосом в ядре трофоцита может играть определяющую роль в организации цитоплазмы ооцита, которая создается еще до оплодотворения яйца (Хвостова, 1980). В то же время пространственное расположение хромосом трофоцитов является видоспецифичным признаком (Стегний, 1993) и может служить одним из критериев в определении филогенетической позиции вида.
В результате изучения пространственной организации хромосом в трофоцитах 7 видов малярийных комаров Anopheles комплекса maciiiipennis (Стегиий, 1979, 1987) было показано, что имеет место кардинальная реорганизация архитектоники интерфазных ядер в онто- и филогенезе малярийных комаров. Помимо тканеспецифичности архитектоники политенных ядер, обнаружена видоспецифичность взаиморасположения хромосом в ядрах генеративной ткани, которая проявляется в следующих показателях: 1. наличие-отсутствие объединения хромосом в локальный или диффузный хромоцентер; 2. наличие-отсутствие связей хромосом с ядерной оболочкой и локализация мест контактов на хромосомах; 3. морфология хромосомных участков прикрепления; 4. разобщенность локусов прикрепления гомеологичиых хромосом у близких видов на ядерной оболочке (Стегний, 1993,1996).
Большой интерес здесь представляет наличие хромосомно-мембранных связей. Хромосомы могут крепиться к ядерной оболочке центромерными, теломерными районами или интеркалярными блоками и места прикрепления хромосом отличаются веерообразным расплетснисм и асинапсисом гомологов. Видовая специфика проявляется по признаку наличия-отсутствия связей хромосом с оболочкой и по морфологическим особенностям зон прикрепления хромосом (Стегний, 1987; 1991; 1993)
Анализ архитектоники ядер трофоцитов у видов Drosophila подгруппы metanogaster полностью подтвердил положение о видоспецифичности архитектоники ядер трофоцитов. У D. metanogaster, D, simulans, D. mauritiana и D. sechellia первичные политенные хромосомы трофоцитов не имеют локального хромоцентра, подобного таковому в слюнных железах. Хромосомы рассредоточены в пространстве ядра. D. simulans и D. sechellia имеют растянутый по переферии ядра "мостик", объединяющий все центромерные районы, а у D, erecta, к тому-же, 2-я и 3-я хромосомы имеют связь с ядерной оболочкой. У D. melanogaster и D. teissieri хромосомы кренятся центромерными районами на ядерной оболочке и не имеют между собой видимых связей. D. yakuba отличается от других видов плотным объединением плеч в центромерах хромосом 2 и 3 и отсутствием явной связи хромосом между собой и с ядерной оболочкой. Для D. огепа характерна типичная хромоцентральная организация с большим гетерохроматиновым блоком в центре (Стегний, Вассерлауф, 1991а, б). Видоспецифичность архитектуры трофоцитов была показана и у 12 видов Drosophila группы virilis (Стегний и др., 1996).
Прикрепление хромосом к ядерной оболочке осуществляется гетерохроматиновыми районами. В зонах контакта Р-гетерохроматин представлен большими блоками, внедряющимися в мембрану ядра (Стегний, 1993). Детальное изучение прицентромерного гетерохроматипа в трофоцитах An. messeae показало, что как в соматических тканях, так и R трофоцитах яичников имеется прицентромерный гетерохроматин а- и Р-типа (Стегний, Шарахова, 1991).
Современные представления о структуре интерфазного ядра: компартментализация ядра, хромосомные территории, территории активных и неактивных генов, хромосомная динамика, регуляторные взаимодействия между хромосомами
Чадов с соавт, (Чадов, 1993) предложили новый метод определения взаиморасположения негомологичных хромосом в профазе ооцита. Он заключается в использовании критерия частоты коориентации 2-х не гомологов как меры расстояния между ними. Определенный с помощью этого метода порядок расположения проксимальных районов хромосом совпал с порядком, определенным другими методами. Это позволяет уверенно говорить о наличии строгой детерминации расположения проксимальных районов хромосом в хромоцентрс и о важности дистанции между проксимальными р ионам и негомологов для их коориентации .
Однако, все попытки построить модель интерфазного ядра , основываясь на анализе прометафазных, мстафазных и телофазных ядер не могут привести к полному пониманию устройства интерфазного ядра. Только изучая интерфазное ядро, можно выявить все тонкости функционирования и организации хроматина в интерфазе. Это стало возможным благодаря развитию методов молекулярной биологии, позволяющим изучать клетки in vitro и in vivo, и систем анализа изображения - 3D и 4D микроскопии.
Компартментализация ядра. Впервые описанные Брауном в 1831 г. клеточные ядра являются наиболее известными и хорошо изученными клеточными органеллами. Структурная и функциональная организация ядра остается объектом энергичных дебатов. Понимание принципов молекулярной организации деталей ядра - включая взаиморасположение ДНК хромосом и каким образом координируется и регулируется синтез, процессинг, сбор и транспорт макромолекул - глобальная цель для клеточной биологии (Lamond, Emshaw, 1998). Еще в 1977 г. Стефенсон (Steffensen 1977) высказал мнение, что гены, хромосомные сегменты и геном как целое трехмерно упорядочены в пространстве ядра, и их специфические ассоциации позволяют регулировать позиции определенных генных продуктов внутри ядра и их транспорт в цитоплазму. В основе трехмерной организации интерфазного ядра эукариот лежит дифференциальное позиционирование различных районов хромосом относительно друг друга и ядерной оболочки. Пространственная компартментализация хроматина и функциональных областей поддерживается скаффолдом, определяющим более высокий порядок ядерной организации. Стабилизирующий эффект обеспечивается взаимодействием рибонуклеиновой кислоты с ламипом и/или ядерным белком митотического аппарата (NuMA). Поэтому, целостность ядерной рибонуклеиновой кислоты должна быть гарантирована в максимально возможной степени, чтобы защитить, насколько возможно, изолированную матрицу в нативной форме (Barboro, D Arrigo et al., 2003).
Ядра клеток представляют собой пространственно разделенные (компартментализованные) структуры (van Drcil, Wansink et al., 1995; Singer, Green, 1997). Выделяют три ядерных области: "открытая" область хроматина более высокого порядка содержит активные гены, имеющие доступ к транскрипции; "закрытая" область хроматина включает бездействующие гены, объединенные в хроматиновые домены и находящиеся в топологически упорядоченном и уплотненном состоянии, которое запрещает доступ генов к комплексам транскрипции (Swedlow, Lamond, 2001); область межхроматина (ICD), которая содержит макромолскулярные комплексы для транскрипции, 29 сплайсинга, репликации ДНК, и репарации (Zirbel et al. 1993; Cremer et al. 1993; Cremer et al., 2000). Хромосомные территории В архитектуре ядра ключевым моментом является разделение его на территории, соответствующие индивидуальным хромосомам. Прогресс в специфичном флуоресцентном мечении хроматина фиксированных и живых клеток человека в комбинации с 3D и 4D микроскопией открыли путь для детального исследования динамики и архитектуры хроматина в ядре клетки человека и его потенциальной роли в генной регуляции (Cremer et al., 2000).
В пространстве ядра хромосомы занимают отдельные области, названные хромосомными территориями, которые разделены каналами, называемыми межхромосомными областями (Manuelidis, 1985; Hochstrasser et al,, 1986; Lichter et al., 1988; Lichter et al„ 1990; Cremer et al., 1995). При изучении интерфазных хромосом человека были показаны значимые различия во внутриядерной позиции, хромосомной морфологии и взаимодействии с ядерными субструктурами для хромосом 18 и 19. Хромосома 19 занимает более внутреннюю позицию в ядре, чем хромосома 18 и более слабо ассоциирует с ядерным матриксом. Периферийная локализация хромосомы 18 устанавливается рано и сохраняется в клеточном цикле (Croft, Bridger, 1999). Локализация хромосом 18 и 19 в разных компартмеитах интерфазного ядра наблюдается у всех приматов Старого Света (Tanabe et al., 2002), Такой консерватизм в пространственной организации интерфазного ядра предполагает, что эта форма организации может играть важную роль в функционировании генома (Серов, 2003)
Территории хромосом, в свою очередь, содержат определенные хромосомные домены и меньшие области с диаметром приблизительно 300 - 800 им и содержанием ДНК порядка 1 Mb (Cremer et al., 2000). Для более детального изучения внутрихромосомного расположения ДНК были выделены GC- и АТ богатые фракции ДНК, обогащенные генами, ЛТ-богатыс фрагменты - G/Q полосы, содержащие позднореплицирующийся факультативный гетерохроматин. GC-богатые фрагменты - R-полосы, включают до 80% известных генов и большинство alu последовательностей и являются рано-ре илицирующимися (Cook, 1995). Трехмерная лазерная (конфокальная) микроскопия показала значительное различие во внутритерриториальном распределении этих двух классов последовательностей ДНК. Оказалось, что GC-богатые последовательности показывают намного более высокую вариабильность в их внутритерриториальной локализации, чем АТ-богатыс фрагменты ДНК (Tajbakhsh, Luz, 2000).
Морфология хроматина трофоцитов яичников С. erythrocephala.Формирование первичных политенных хромосом
На ранних стадиях развития имаго (1-2 день после выхода из пупария) в фолликулах наблюдали мелкие ядра с ретикулярной структурой или ядра с тонкими, переплетенными фибриллами. Хроматин трофоцитов окрашен слабо, отдельные хромосомы не выявляются (Рис. 2.1. а, б). Коньюгация хроматиновых фибрилл приводит к появлению рыхлых жгутов хроматина с редкими гетерохроматиновыми блоками. Отдельные хромосомы еще не сформированы (Рис, 2.1. в).
Следующая стадия - ядра с вполне сформированными тонкими длинными политенными хромосомами, плохо структурированными и переплетенными между собой (Рис. 2.1. г). Постепенная компактизация хроматина (возможно и дальнейшая политенизация) приводит к образованию первичных политенных хромосом. В результате соматической конъюгации гомологов мы наблюдаем гаплоидный набор хромосом - 5 крупных и 1 маленькая, гетерохроматическая (Рис. 2.1. д). У хромосом на этой стадии наблюдаются ярко окрашиваемые блоки хроматина. Именно на этой стадии хромосомы приобретают характерную для первичных политенных хромосом морфологию и имеют максимальное количество блоков, что позволяет их идентифицировать.
Дальнейшая компактизация ведет к значительному укорочению первичных политенных хромосом. Блоки, которые выявлялись на предыдущей стадии, сливаются вместе, образуя большие участки хорошо окрашиваемого хроматина. Структура хромосом становиться более рыхлой в результате неплотной конью-гации хроматид, из которых они состоят. Однако, на этой стадии еще видна характерная морфология каждой хромосомы (Рис. 2.1. е). Конъюгация гомологов первичных политенных хромосом может быть нарушена. В норме может наблюдаться как частичный асинапсис - характерен для одной хромосомы (Рис. 2.1. ж), так и редко встречаемый полный асинапсис гомологов некоторых хромосом. Полный асинапсис гомологов имеет место у потомства, полученного при скрещивании мух из разных популяций (популяции яичников С. erythrocephala а, б, в - первичные ретикулярные ядра; г, д, е - стадии постепенной компактизации хроматина первичных политенных хромосом; ж, з - первичные политенные хромосомы с нарушенной соматической конъюгацией гомологов. Окраска лактоацето-орсеином. Шкала- 10 мкм. х 100. " - блоки компактного хроматина; - хромосома 6; - районы асинапсисов гомологов первичных политенных хромосом Алматы и г. Томска) и имеет большее проявление в укороченных хромосомах с рыхлой структурой (Рис. 2.1. з).
Современные представления о процессе политенизации и формировании политенных хромосом, основанные на многочисленных исследованиях различных тканей и объектов, позволяют объяснить изменение структуры хроматина трофоцитов С. erythrocephala . Известно, что в политенных ядрах низких уровней плоидности политенные хромосомы не обнаруживаются (Зыбина, 1986). Мелкие ядра имеют ретикулярную структуру. Рост политении приводит к агрегации хроматина отдельных хромосом, образованию топких рыхлых жгутов. Политенизация, происходящая на этой стадии, вероятно необходима для наработки необходимого количества ДНК в немногочисленных активных районах.
Известно, что первичные политенные хромосомы сохраняют свою морфологию до момента, когда количество ДНК становиться 32С или 64С (Bier, 1958). После этого начинается их конденсация. Интересен факт, что при индукции има-гинальной диапаузы оогенез останавливается примерно на этой же стадии. Л при повышении температуры возможен выход из диапаузы и продолжение формирования и созревания яйца (Виноградова 1991). Очевидно, на стадии первичных политенных хромосом активны только некоторые районы хромосом (районы образования пуфов), большие участки генома инактивировапы (районы дисков) и еще не запущены механизмы активного формирования яйца и вителогепеза.
Соматическая конъюгация, свойственная политенным хромосомам Diptera, имеет место и в трофоцитах у С. erythrocephala. Асииапсис участка одной хромосомы, встречаемый практически во всех ядрах - специфика этого района, а не результат раздавливания ядер в ходе приготовления препаратов. По литературным данным, варьирование методов приготовления препаратов не влияет па наличие и протяженность асинапсиса (Куличков, Беляева, 1975). Причиной асинапсиса гомологов у потомства, полученного от скрещивания особей из разных популяций, может быть разнокачественность структуры гомологов, обусловленная как наличием хромосомных перестроек (Beermann, 1962), так и накоплением мобильных элементов генома в удаленных популяциях (Riede, Renz, 1983).
Конденсация хроматина и ослабление связи между хромати дам и приводит к тому, что хромосомы принимают овальную форму с хорошо видимой перетяжкой в цєі промерном районе (Рис. 2.2. а).
В ходе очередного полиплоидного эндомитоза во время перехода от 16 С к 32 С (или от 32 С к 64 С) первичные политенные хромосомы укорачиваются еще сильнее и распадаются на составляющие их эидохромосомы (Bier, 1958). Нами обнаружено, что распад политенных хромосом на эидометафазные происходит асинхронно: одна из хромосом начинает распадаться первой, в то время как другие 4 большие хромосомы еще сохраняют свою форму (Рис. 2.2. а, б, в). Некоторое время эидометафазные хромосомы еще сохраняют свою территориальность в ядре и располагаются отдельными группами (Рис. 2.2. г). Но затем они рассеиваются, равномерно заполняя все пространство ядра (Рис. 2.2. д).
Следующая стадия - эндоанафаза - постепенная декомпактизация эидоме-тафазных хромосом (Рис. 2.2. є, ж, з). В ядрах, находящихся па этой стадии, тонкие хроматиновые нити соседствуют с участками еще не декомпактизованного хроматина. Стадия эпдоанафазы заканчивается полной декомпактизацией хроматина и образованием ядра с ретикулярной структурой. После начала эндометафазного распада и вплоть до формирования ретикулярного ядра материал маленькой гетерохроматической хромосомы 6 выявить практически невозможно. Он теряется в общей массе хроматина и вторично (после стадии первичных политенных хромосом) начинает проявляться в виде ярко окрашиваемого района только в ядрах с ретикулярной структурой. Структура хроматина ретикулярных ядер может варьировать: встречаются ядра с равномерно распределенными по кариоплазме хроматииовыми нитями, образующими однородную массу в которой выделяется один более темный участок (предположительно район маленькой хромосомы 6) (Рис. 2.2. и). И ядра, в которых в массе однородно окрашенного хроматина встречаются участки компактного, ярко окрашенного хроматина (Рис. 2.2. к).
Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) ДНК-библиотек, полученных методом микродиссекции, на первичные политенные хромосомы трофоцитов С. erythrocephala
Архитектоника ядра с политенными хромосомами достаточно хорошо изучена у многих представителей Diptera как в соматических, так и в генеративной тканях (Hochstrasscr et al., 1987; Прокофьсва-Бельговская, 1967; Стегний, 1987. 19916). Однако у С. erythrocephala этот вопрос изучен не был.
Анализ взаиморасположения первичных политенных хромосом трофоцитов яичников С. erythrocephala не выявил объединения хромосом и их плеч в общий центромерный район - локальный хромоцентр. Хромосомы рассредоточены в пространстве ядра и, по видимому, располагаются в определенном порядке по отношению друг к другу. Тяготение отдельных районов хромосом к ядерной оболочке может свидетельствовать о наличии прикреплений, Об этом же говорят и тонкие тяжи хроматина, отходящих от некоторых хромосом к оболочке ядра. Однако хорошо выраженные прикрепления (веерообразное расплс-тение хромосомы в районе прикрепления) обнаружены не были (Рис. 5 а-г).
Отсутствие локального хромоцептра и рассредоточен и ость хромосом в пространстве ядра в ядрах трофоцитов, характерное для видов Anopheles (Стегний, 1979) и Drosophila (Стегний, Вассерлауф, 1991 а, б; Стегний и др., 1996) выявлено и у С erythrocephala. У видов Anopheles места прикрепления хромосом к ядерной оболочке отличаются веерообразным рас плетением и асинапсисом гомологов (Стегний, 1987; Стегний, Шарахова, 1991), у видов Drosophila такие прикрепления представлены тонкими гетерохроматиновыми тяжами (Стегний, Вассерлауф, 1991а). Места прикрепления хромосом к ядерной оболочке у С. erythrocephala еще менее выражены, чем у дрозофилы, и в данной работе не анализируются.
Изучение морфологии хроматина трофоцитов яичников С. erythrocephala показало, что идентифицировать хромосомы и анализировать пространственную организацию ядра можно лишь па протяжении очень короткого времени развития яичников - на стадии первичных политенных хромосом. Однако существование и функционирование трофоцитов на этой стадии не заканчивается. Морфогенез хроматина от политенных хромосом до крупных ретикулярных ядер сопровождается сложными морфологическими преобразованиями, многократным увеличением уровня плоидности (до 4096 С, Bier, 1957, 1958) и изменением структуры хроматина. Если в ядрах трофоцитов с политенпыми хромосомами прослеживаются определенные закономерности в упорядоченности хромосом, то сохранятся ли они при переходе хроматина в ретикулярное состояние? То, что каждая хромосома занимает в ядре определенное пространство - доказанный факт. Такие исследования были проведены на интерфазных диплоидных ядрах многих организмов (Manuelidis, 1985; Hochslrasser et al., 1986; Lichter et al., 1988; Lichter et al., 1990; Cremer et al., 1995; Croft, Bndger, 1999). Но что происходит в ядре при многократном увеличении плоидности и конденсации-деконденсации хроматина в ходе эндомитотического цикла? Ответить на этот вопрос можно используя хромосомо-специфичпые ДНК-зонды, позволяющие увидеть материал отдельных хромосом в общей массе диспергированного хроматина.
С, erythrocephala является малоизученным с точки зрения молекулярной биологии видом. Интересные результаты получены Пазимиком с соавт. (Nazimiec, Beckingham 1986). Из клеток гермарной линии была выделена и секве-нирована ЛТ-богатая саттелитная последовательность, которая гибридизовалась в центромерные районы 4 аутосом. Следовательно, эта последовательность не является маркером для определенной хромосомы и не подходит для наших целей. Использование зондов из ДНК других организмов также не представляется перспективным. Наиболее оптимальным в этой ситуации является получение зондов непосредственно из ДНК С. erythrocephala.
Перед нами стояла задача - проследить упорядоченность хроматина в ходе сложного эндомитотического цикла и в ретикулярных ядрах высокой плоидно-сти. Сложность заключалась в отсутствии маркеров на определенные хромосомы С. erythrocephala. Эта проблема была решена путем получения хромосомо- и районо-специфичных ДНК библиотек методом микродиссекции хорошо определяемого теломерного участка первичной политенной хромосомы 2 и хромосом 3 и 6 (Рис. 6). Для проверки специфичности полученных ДНК-библиотек была проведена флуоресцентная in situ гибридизация ДНК-проб с первичными поли-тенными хромосомами.
ДНК-библиотека хромосомы 6 была получена микроманипуляционным сбором материала с воздушно-высушенных неокрашенных препаратов и последующей амплификацией ДНК в полимеразной цепной реакции с частично вырожденным праймером (DOP-PCR).
При анализе результатов FISH-гибридизации хромосомо-специфичной ДНК-библиотеки хромосомы 6 с первичными политенными хромосомами оказалось, что ДНК-библиотека окрашивала только хромосому 6, сайты гибридизации пробы на других хромосомах не выявлены (Рис. 7. а, б). ДНК-библиотека локализовалась не только на хромосоме 6 политенных ядер трофоцитов, но также были обнаружены сигналы в клетках фолликулярного эпителия — метафазных (Рис. 7. в) и интерфазных (Рис. 7. г).
Выбор хромосомы 6 для получения ДНК-библиотеки основывался на специфике ее функции и морфологии: Во-первых, эта хромосома является ядрышкообразующей (Ribbert, 1979). Локализация ядрышкообразующего района в области вторичной перетяжки гетерохроматических половых хромосом имеет место у многих видов семейства Calliphoridae (Bedo, 1992; Parise-Maltempi, Avancini, 2001). Во вторых, эта хромосома резко отличается размерами и хорошо визуализируется на воздушно-высушенных неокрашенных препаратах политенных хромосом разной степени компактности.
Анализ локализации ДНК-библиотеки на материале политенной хромосомы 6 выявил особенности морфологии хроматина этой хромосомы: наличие двух плотно-компактизованных блоков в цегггромерном районе, которые не метятся зондом, и яркое окрашивание эухроматиновых плеч (Рис. 7 а, б). Отсутствие сигнала в районе прицен-тромерного гетерохроматина может быть объяснено плотной упаковкой ДНК этого района и, как следствие, ее недоступностью для меченых фрагментов гомологичной ДНК при проведении FISH. Причиной имеющихся вариаций в размере хромосомы 6 может быть различная степень раегшастанности материала в процессе приготовления воздушно-высушенных неокрашенных препаратов.
