Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Литературный обзор 7
1.1. Иммунная система насекомых 7
1.1.1. Клеточный иммунный ответ 7
1.1.1.1. Фагоцитоз 8
1.1.1.2. Образование узелков и капсул 9
1.1.2. Гуморальный иммунный ответ 10
I.1.2.1.Антимикробные пептиды 11
1.1.2.2. Коагуляция гемолимфы 16
1.1.2.3. Фенолоксидазная система 18
1.1.2.4. Эпителиальный иммунный ответ 19
1.2. Личиночная терапия 21
I.2.1. Антибактериальные свойства экзосекрета 24
Глава II. Материалы и методы исследования 29
11.1. Биологический материал 29
11.1.1. Краткая характеристика основного модельного объекта исследования Lucilia sericata 29
11.1.2. Методика лабораторного содержания 29
11.2. Методы 30
11.2.1. Инфицирование насекомых 30
II.2.1.1. Получение бактериальной суспензии для иммунизации 30
11.2.2. Сбор гемолимфы 30
11.2.3. Сбор экзосекрета 30
11.2.4. Анализ антимикробной активности 31
11.2.5. Анализ фунгицидной активности 32
11.2.6. Методы концентрации и очистки исследуемых образцов 32
11.2.6.1. Метод твердофазной экстракции 32
11.2.6.2. Хроматографическое фракционирование 33
11.2.7. Масс-спектрометрия 33
11.2.8. Методы исследования живых гемоцитов 34
11.2.9. Статистическая обработка экспериментальных данных 34
Глава III. Фунгицидная активность экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia sericata 35
III.1. Фунгицидная активность гемолимфы личинок Lucilia sericata 35
III.2. Фунгицидная активность цельного экзосекрета личинок Lucilia sericata, Calliphora vicina, Musca domestica 36
111.2.1. Фунгицидная активность экзосекрета Lucilia sericata.. 36
111.2.2. Фунгицидная активность экзосекрета Calliphora vicina 39
111.2.3. Фунгицидная активность экзосекрета Musca domestica. 40
111.3. Фунгицидная активность фракционированного экзосекрета личинок Lucilia sericata 41
111.3.1. Фунгицидная активность гидрофобной фракции экзосекрета 41
111.3.2. Фунгицидная активность хроматографических фракций экзосекрета 42
111.4. Выводы 43
Глава IV. Антибактериальная активность экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia sericata 45
IV.1. Антибактериальная активность цельных экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia sericata 45
IV.2. Антибактериальная активность гидрофобных фракций экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia sericata 48
IV.3. Антибактериальная активность хроматографических фракций экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia sericata 52
IV.4. Выводы 57
Глава V. Масс-спектрометрический анализ 58
Глава VI. Особенности клеточного состава гемолимфы личинок Lucilia sericata 84
VI.1. Основные типы гемоцитов Lucilia sericata 84
VI.2. Иммунологические реакции гемоцитов 92
VI.3. Выводы 93
Глава VII. Обсуждение 94
VII.1. Фунгицидная активность гемолимфы и экзосекрета личинок Lucilia sericata 94
VII.2. Антибактериальная активность экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia sericata VII.3. Особенности клеточного состава гемолимфы личинок Lucilia sericata 101
Заключение 106
Выводы 109
Список литературы 111
- Образование узелков и капсул
- Инфицирование насекомых
- Фунгицидная активность цельного экзосекрета личинок Lucilia sericata, Calliphora vicina, Musca domestica
- Антибактериальная активность гидрофобных фракций экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia sericata
Введение к работе
Актуальность исследований. В естественных местообитаниях основными конкурентами личинок мух являются микроорганизмы, грибы и бактерии. В целях адаптации к меняющимся условиям окружающей среды и защиты пищевого субстрата экзосекрет этих насекомых, по всей видимости, должен содержать антимикробные и фунгицидные соединения. Некоторые виды насекомых, как и позвоночные, выделяют на поверхность слизистых оболочек антимикробные пептиды. Для растений и грибов характерно использование вторичных метаболитов в качестве защиты от вредителей и патогенов, а также в борьбе с конкурентами. Антимикробные пептиды, как известно, являются важнейшим элементом в иммунной системе насекомых, и, в основном, синтезируется клетками жирового тела, выделяясь в гемолимфу. Однако, у личинок L. sericata подобные особенности иммунного ответа до сих пор не были исследованы.
Мухи вида L. sericata имеют огромное экономическое и клиническое значение, поскольку являются факультативными паразитами, вызывающими кожные миазы прежде всего у овец несмотря на то, что могут поражать и других диких и домашних животных и человека. Однако, эта особенность жизненного цикла личинок мух может быть использована человеком в собственных интересах. На сегодняшний день огромное количество публикаций посвящено выдающимся эффектам личиночной терапии, по сути являющейся искусственно индуцированным миазом, главные из которых очищение, дезинфекция и быстрое заживление хронических ран, зачастую не поддающихся лечению методами традиционной медицины. Достоверно известно, что личинки эффективно очищают раны, зараженные таким опасным патогеном, как метициллин-устойчивый золотистый стафилококк (MRSA), который является возбудителем одной из госпитальных инфекций и относится к группе бактерий, устойчивых почти ко всем ныне существующим антибиотикам. Поэтому эффективность хирургических личинок и компонентов, синтезируемых ими, в отношение MRSA, имеет огромное значение.
Кроме того, личинки многих мух, особенно личинки Calliphoridae, питаются на разлагающихся субстратах и являются пассивными переносчиками огромного количества патогенных бактерий. Поэтому исследование антимикробных компонентов у разных видов мух представляется особенно актуальным.
Цель работы: изучение факторов гуморального и клеточного иммунитета личинок Lucilia sericata и их роли в контроле внешней и внутренней среды. Для выполнения целей работы были поставлены следующие задачи:
Исследование состава и титра антибактериальных компонентов в экзосекрете и
гемолимфе иммунизированных личинок Lucilia sericata.
Исследование состава и титра фунгицидных компонентов в гемолимфе и экзосекрете личинок Lucilia sericata, а также в экзосекрете личинок Musca domestica и Calliphora vicina.
Исследование клеточных защитных механизмов личинок Lucilia sericata: описание основных типов гемоцитов; изменение состава гемоцитов в ходе развития; иммунологические реакции гемоцитов.
Научная новизна. В работе впервые был проведен сравнительный анализ двух защитных систем личинок L. sericata, выполняющих основные функции: временное блокирование роста сапрофитных микроорганизмов в окружающей среде (функция защиты пищевого субстрата) и уничтожение патогенов, проникших в гемолимфу (функция иммунологической защиты). В гемолимфе личинок зеленой мясной мухи впервые были описаны диптерицины и пролин-богатые пептиды. В экзосекрете были обнаружены пептидные компоненты и низкомолекулярные соединения. Удалось выяснить, что общим антимикробным фактором гемолимфы и экзосекрета является диптерицин, остальные компоненты экзосекрета и гемолимфы личинок отличаются по структуре и биологической активности. Важной отличительной особенностью экзосекрета является наличие низкомолекулярных соединений с анти-MRSA активностью. В работе были описаны их антибиотическая активность, хроматографическая подвижность и определены молекулярные массы.
Практическая ценность. На сегодняшний день хирургические личинки применяются в медицине для лечения хронических ран. Обобщение уже известных и получение новых данных о механизмах действия личинок в ране представляет собой неоспоримую ценность. Экзосекрет личинок зеленой мясной мухи в отличие от гемолимфы подавляет рост и развитие полирезистентного штамма MRSA. Таким образом, экзосекрет является потенциальным источником новых лекарственных средств, способных бороться с возбудителями различных бактериальных заболеваний, в том числе с одной из самых распространенных госпитальных инфекций, с MRSA. Ценной особенностью антибиотических компонентов как экзосекрета, так и гемолимфы, выгодно отличающей их от синтетических антибиотиков, является способность не вызывать развития устойчивости у бактерий.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Международной конференции «Ломоносов-2010» (Москва, 12-15 апреля 2010 г.), 14 Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино,
19-23 аперля 2010 г.), VII Всероссийской межвузовской конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 20 - 23 апреля 2010 г.), Международной научной школе для молодежи «Методология и организация инновационной деятельности в сфере высоких технологий» (Санкт-Петербург, 22 - 27 сентября 2010 г.) и Международной научной конференции «Фундаментальные проблемы энтомологии в XXI веке» (Санкт-Петербург, 16-20 мая 2011 г.). По теме диссертации опубликовано 7 работ из них 3 статьи в отечественных рецензируемых журналах и одна монография.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах, включает введение, семь глав, заключение и список литературы, содержит 28 рисунков и 18 таблиц. Список литературы состоит из 166 источников, из них - 158 на иностранных языках.
Образование узелков и капсул
Основными структурными элементами, участвующими в формировании клеточного иммунного ответа насекомых, являются клетки кроветворной ткани, перикардиальные клетки, фиксированные и свободноживущие клетки гемолимфы – гемоциты. Гемоциты представляют собой гетерогенную популяцию клеток, принимающих активное участие в иммунных реакциях. На сегодняшний день существует множество классификаций гемоцитов насекомых и есть мнение, что единой системы деления гемоцитов на группы нет (Тулин, Чага, 2003). Традиционно у насекомых выделяют шесть типов гемоцитов: прогемоциты, плазматоциты, гранулоциты, сферулоциты, цистоциты и эноцитоиды; эта классификация основана на исследованиях гемлимфы чешуекрылых (Gupta, 1985; Lackie, 1988; Price et Ratcliffe, 1974; Ratcliffe et Rowley, 1981).
Прогемоциты являются базовым типом клеток, из которых дифференцируются все остальные гемоциты (Lackie, 1988). Плазматоциты представляют собой чаще всего агранулярные клетки, обычно специализированные на выполнении фагоцитарных функций. Практически все эти клетки содержат лизосомальные ферменты. В некоторых плазматоцитах выявляется пероксидазная и эстеразная активность, а у представителей отрядов Odonata и Coleoptera – еще и фенолоксидазная активность. Определенная часть этих клеток способна синтезировать лектины (Lackie, 1988).
Гранулоциты - клетки со специфическими включениями в цитоплазме метаболического характера. Эти клетки высвобождают содержимое гранул, например, в процессе капсулообразования. Доказанной функцией гранулярных гемоцитов бабочек является фагоцитоз, кроме того они первыми контактируют с чужеродным объектом в гемолимфе и секретируют содержимое своих гранул (Ribeiro et Brehelin, 2006). У личинок Calliphoridae настоящих гранулярных клеток не обнаружено, поскольку включения плазматоцитов имеют доказанное катаболическое происхождение (Тулин, Чага, 2003; Кинд, 2007).
Сферулоциты – большие округлые клетки, которые содержат небольшое количество крупных включений, сферул. О функциях этих клеток ничего неизвестно (Lackie, 1988; Ribeiro et Brehelin, 2006).
Чаще всего к группе эноцитоидов относят клетки, содержащие фенолоксидазу (Ribeiro et Brehelin, 2006). У дрозофилы это хорошо описанные кристаллические клетки (Lemaitre et Hoffmann, 2007).
Цистоциты иногда описывают как коагулоциты. Они содержат большое количество гранул, которые активно высвобождаются при препарировании. Возможно, это определенный тип гранулоцитов, принимающих участие в коагуляции гемолимфы (Price et Ratcliffe, 1974; Ratcliffe et Rowley, 1981).
Результатом гемоцитарных защитных реакций является изоляция «чужого» от внутренней среды организма в результате фагоцитоза либо образования многоклеточных узелков и капсул вокруг патогена.
Фагоцитоз является первым механизмом защиты насекомых от патогенов. Он является специализированной формой рецептор-опосредованного эндоцитоза. Фагоцитироваться могут разнообразные нерастворимые субстанции, от инертных частичек (тушь, латекс) до мелких биологических объектов, таких как бактерии.
Фагоцитирование чужеродной частицы – это многоступенчатый процесс. Первым этапом фагоцитоза является аггрегация гемоцитов в месте повреждения. Далее происходит прикрепление фагоцита к частице и ее распознавание. Этап распознавания является ключевым в формировании иммунного ответа. При встрече с чужеродным агентом гемоциты могут использовать весь «арсенал» рецепторов, способных связываться с инородными телами, в том числе и рецепторы, экспрессированные после индукции какого-либо сигнала. Распознавание антигенов осуществляется при помощи специфических рецепторов к основным микробным детерминантам, расположенных на поверхности клетки, либо гуморальных факторов, выполняющих роль опсонинов. В качестве опсонинов у насекомых были идентифицированы следующие соединения: лектины, гемолин (входит в состав иммуноглобулинового семейства), ЛПС-связывающий белок, белок, распознающий грамотрицательные бактерии, белок, распознающий пептидогликаны и тиоэфир-содержащий белок EP1, близкий к 2-макроглобулину позвоночных (Bulet et al., 1999; Schmidt et al., 2001). Исследования показали, что некоторые из этих факторов действительно усиливают фагоцитоз, образование узелков и капсул. Например, у Anopheles gambiae EP1 связывается с грамотрицательными бактериями, и подавление этого фактора с помощью интерферирующей РНК приводит к снижению фагоцитоза бактерий гемоцитами (Lavine, 2002). Связывание антигена с рецептором запускает процесс передачи сигнала в ядро иммуноцита. Следствием этого является образование клеткой псевдоподий, поглощение чужеродной частицы и образование фагосомы (Hoffman et Lemaitre, 2007). Механизм, по которому идет уничтожение патогена внутри фагосомы, до конца не изучен. Есть основания полагать, что поглощенные бактерии элиминируются под действием активных соединений кислорода и азота, выделяемых в фагосому.
Более сложным механизмом изоляции патогена является образование капсул, или инкапсуляция. Формирование капсул может происходить также вокруг собственных поврежденных тканей насекомого – процесс, лежащий в основе регенерации. Этот процесс осуществляется при согласованном участии нескольких типов гемоцитов. Различают две формы инкапсуляции: 1) образование узелков – многоклеточных образований, способных изолировать сразу несколько мелких патогенов, например бактерии; 2) формирование капсул – многослойных скоплений гемоцитов, изолирующих объекты, размер которых превышает размер гемоцита: простейших, многоклеточных паразитов, личинки и яйца паразитоидов (Hoffman et Lemaitre, 2007). Принципиальных различий между этими процессами нет. Сигнальными молекулами, запускающими образование капсулы, являются микробные детерминанты типа липополисахаридов, зимозана, ламинарина или молекул гликополипротеинов (Lackie, 1988). Как при образовании узелков, так и при образовании капсул гемоцитами формируется псевдоткань, изолирующая проникший в гемоцель объект.
Инфицирование насекомых
Поскольку барьерный эпителий постоянно контактирует с огромным количеством микроорганизмов, его поверхность должна быть снабжена эффективной системой распознавания и контроля. Это особенно важно для насекомых, и в первую очередь для тех из них, чьи личинки развиваются в разлагающихся субстратах, например личинки мясных мух или фруктовых мушек. Просвет кишки этих насекомых является не очень подходящей средой для микробной колонизации благодаря физическим и физиологическим свойствам, а также секреции лизоцима (Hoffmann et Lemaitre, 2007). Вдобавок, локальная продукция антимикробных пептидов и активных форм кислорода обеспечивает двойную индуцибельную систему, защищающую барьерный эпителий. В ряде работ была показана локальная продукция антимикробных пептидов клетками поверхностного эпителия. При воздействии живых бактерий или компонентов бактериальной клеточной стенки на поврежденные участки эпикутикулы личинок Bombyx mori и Hyalophora cecropia эпителиальные клетки, подлежащие под поврежденным слоем, и клетки жирового тела начинают экспрессировать ген цекропина (Brey et al., 1993). Исследования на дрозофиле с использованием гена GFP показали экспрессию генов антимикробных пептидов в клетках некоторых поверхностных эпителиев. К ним относятся гиподерма, репродуктивная система, пищеварительный и респираторный тракты. Антимикробные пептиды, синтезирующиеся в этих тканях, обеспечивают локальный иммунный ответ и не всегда являются индуцибельными. Так гены дрозомицина в слюнных железах и сперматеке экспрессируются конститутивно (Tzou et al., 2000). Клетки эпидермиса, в т.ч. клетки трахейной системы, у личинок Galleria melonella в больших количествах содержат лизоцим (Vilcinscas et Gotz, 1999). Однако локальный синтез дрозомицина и диптерицина индуцируется и в трахеях, и в кишечном эпителии дрозофилы в ответ на заражение грамотрицательными бактериями (Tzou et al., 2000). Кроме того, авторами данного исследования на личинках и имаго дрозофилы был показан эффект тканеспецифичной экспрессии генов тех или иных антимикробных пептидов. Так у личинок плодовой мушки дрозоцин и дрозомицин секретируются в просвет трахей; дефензин и мечниковин синтезируются в эпителиальных клетках ротовых органов и пищевода; дефензин, диптерицин и аттацин обнаружены на всем протяжении пищеварительного тракта. У имаго дрозофилы в лабелярных железах на конце хоботка были идентифицированы дефензин и мечниковин; в слюнных железах – дроцомицин; в кардиальном отделе желудка и средней кишке – диптерицин (Tzou et al., 2000).. Интересно, что почти во всех исследованных тканях детектируется экспрессия как минимум двух типов антимикробных пептидов с комплементарным спектром активности (Tzou et al., 2000), что характерно и для слизистых оболочек млекопитающих (Huttner et Bevins, 1999). Тканеспецифичная экспрессия очень характерна для слизистых оболочек позвоночных (Wah, 2006) и даже для поверхностных эпителиальных клеток некоторых видов растений (Thomma et Broekaert, 1998). Например, -дефенсины продуцируются клетками Панета, нейтрофилами и альвеолярными макрофагами (Ouellette, 2005). -дефенсины характерны для эпителия пищеварительного тракта в целом, ресничного эпителия трахей, эпителия почек, мочеполового тракта, потовых и слюнных желез (Chen et Fang, 2004).
Эпителиальные защитные реакции могут обеспечиваться не только антимикробными пептидами, участвующими в системном ответе, но и бактерицидными белками, характерными только для данного типа тканей. В средней кишке мухи Stomoxys calcitrans конститутивно экспрессируются тканеспецифичные дефензины Smd-семейства (Munks et al., 2001). Группой ученых был обнаружен полипептид, андропин, который синтезируется в семяпроводе у самцов дрозофилы в ответ на спаривание и не индуцируется при микробной инвазии, несмотря на то что ген, кодирующий андропин, находится в локусе цекропинов. Андропин более эффективен в отношении грамположительных бактерий, но в высоких концентрациях демонстрирует и антиграмотрицательную активность (Samakoviis et al., 1991).
Кроме антимикробных пептидов барьерные эпителии насекомых выделяют вторичные метаболиты, обладающие бактерицидными и фунгицидными свойствами. Секреторные железы личинок горчичного листоеда Phaedon cochleariae выделяют фунгицидные соединения, прежде всего монотерпеновые иридоиды, ингибирующие рост и созревание спор паразитических грибов Beauveria bassiana, специфичных для данного вида жуков, а также вещества, характеризующиеся антиграмотрицательной активностью (Gross et al., 1998). Фитопатогенный клоп Nezara viridula выделяет гексеналь и десеналь, которые действуют одновременно и как феромоны тревоги, и как ингибиторы роста грибов Metarhizium anisopliae (Gross et al., 1998). I.2. Личиночная терапия
История применения «хирургических личинок» уходит своими корнями в далекое прошлое. Существуют данные о том, что личинок использовали представители различных древних культур, таких как аборигены племени Нгемба Нового Южного Уэльса в Австралии (Dunbar, 1944), племена на севере Бирмы (Greenberg, 1973) и целители Майя в Центральной Америке (Sherman, 1988). Исследователи полагают, что Майя вымачивали одежду в крови крупного рогатого скота и оставляли ее на солнце, перед тем как нанести на рану, для того чтобы обеспечить присутствие личинок мух (Dunbar, 1944).
Французский хирург, Амбруаз Паре (1510-1590), был первым врачом, отметившим замечательное влияние личинок мух на заживление ран (Whitaker et al., 2007). Он, однако, настаивал на деструктивной природе личинок и препятствовал заражению ран пациентов. Но однажды Паре исследовал случай глубокого повреждения черепа. Рана не заживала в течение длительного времени. Только после того, как произошло заражение огромным количеством личинок мух и, несмотря на серьезные повреждения костной ткани, пациент вылечился. Впоследствии Паре оставлял личинок развиваться в ранах и усиливать восстановительные процессы.
Другой французский хирург, Доминик Жан Ларей (1766-1842), выдающийся французский военный хирург, участник всех походов Наполеона I, один из основоположников военно-полевой хирургии, во время Египетского похода заметил, что личинки синей мухи питаются только мертвыми тканями и оказывают положительное влияние на нижележащие живые (Whitaker et al., 2007).
Фунгицидная активность цельного экзосекрета личинок Lucilia sericata, Calliphora vicina, Musca domestica
У молодых питающихся личинок начинается быстрое образование стекловидных гиалиновых клеток, которые в этот период составляют наиболее заметную часть дифференцированных гемоцитов. Они четко подразделяются на две генерации. Стабильные гиалиновые клетки (по Кинд, 2007) или тромбоцитоиды (по Тулину и Чаге, 2003) имеют более или менее правильную округлую форму и являются предшественниками тромбоцитоидов. Размеры клеток сильно варьируют: от небольших (15 мкм) до огромных (85-90 мкм) (Рисунок 24 б). Стабильные гиалиновые клетки появляются в гемолимфе молодых личинок и сохраняются влоть до подготовки к пупаризации (см. Таблицу 18).
Крупные (20-30 мкм) нестабильные гиалиновые клетки (по Кинд, 2007) или кристаллические клетки (по Тулину и Чаге, 2003), очевидно, являются аналогами кристаллических клеток Drosophila и содержат профенолоксидазу (Тулин и Чага, 2003; Crossley, 1964). На временных препаратах после смешивания гемолимфы с физиологическим раствором их цитоплазма становится грубоструктурированной и они быстро, в течение 2 – 5 мин, выделяют фермент в крупные ограниченные мембраной периферические пузыри (Рисунок 24 в). Эти клетки присутствуют только на протяжении периодов питания и опустошения зоба, а на более поздних стадиях полностью исчезают из гемолимфы (см. Таблица 18).
Тромбоцитоиды (по Кинд, 2007) представляют собой аналог тромбоцитоидов позвоночных и родственны ламеллоцитам дрозофилы (Кинд, 2007). Это клетки неправильной формы с гранулированной цитоплазмой (Рисунок 24 г), впоследствии распадаются на множество мелких фрагментов цитоплазмы и т. н. «голые ядра» или ранние посттромбоцитоиды (по Тулину и Чаге, 2003) (Рисунок 24 д), окруженные тонким цитоплазматическим ободком. При подготовке к пупаризации появляется еще один тип клеток – веретеновидные (по Кинд, 2007) или поздние посттромбоцитоиды (по Тулину и Чаге, 2003) (см. Таблицу 18), небольшие вытянутые клетки, способные к адгезии (Рисунок 25 г). Клетка, оседая на стекло, образует многочисленные отростки разной длины. Веретеновидные клетки наряду с немногочисленными пластинками принимают участие в образовании сетей (Тулин и Чага, 2003).
Плазматоциты содержат в цитоплазме гранулы, по всей вероятности, не синтезированные клеткой, а катаболические жировые или жиро-белковые капельки (Тулин и Чага, 2003; Zachary et Hoffmann, 1973). С морфологической точки зрения им свойственно наличие значительного количества тонких филоподий или микроворсинок, а основным характерным физиологическим признаком служит сильно выраженная способность к адгезии (Рисунок 24 е). Плазматоциты являются также основными фагоцитирующими клетками (Кинд, 2005). Данный тип клеток представлен двумя генерациями. Ювенильные плазматоциты (по Кинд, 2007) или филоподоциты (по Тулину и Чаге, 2003) (Рисунок 25 а) характеризуются крупными размерами и наличием филоподий и наблюдаются в небольшом количестве, начиная с середины периода питания и кончая последними этапами опустошения зоба (см. Таблица 18). Поздние плазматоциты (по Кинд, 2007) или гистолицоциты (по Тулину и Чаге, 2003) (Рисунок 25 б) отличаются меньшей величиной и появляются у опустошающих зоб личинок (см. Таблицу 18).
Для индукции клеточной защитной реакции личинкам различного возраста инъецировали по 10 мкл стерильной 2-5 % суспензии мелко растертого медицинского активированного угля в физиологическом растворе. Уже через 3 минуты наблюдается адгезия частиц к мембране плазматоцитов и их поглощение небольшими фрагментами цитоплазмы тромбоцитоидов. Через 7 мин частицы обнаруживаются и в цитоплазме плазматоцитов, а тромбоцитоидные фрагменты объединяются в довольно крупные агглютинаты, округлые или с многочисленными длинными филоподиями. Через 30 мин гемолимфа почти полностью освобождается от чужеродных частиц, однако процесс заполнения плазматоцитов углем и укрупнение агглютинатов продолжается, и через 1 час после инъекции в плазматоцитах накапливается столько частиц угля, что они маскируют ядро (Рисунки 26 и 27).
У опустошивших зоб личинок наряду с фагоцитозом и агглютинацией начинает проявляться еще один тип защитной реакции – образование скоплений плазматоцитов вокруг либо комков слипшихся чужеродных частиц, либо вокруг уже образовавшихся агглютинатов (Рисунок 28). Отдельные плазматоциты начинают контактировать с агглютинатами через 5-10 мин после инъекции. Со временем количество примкнувших клеток увеличивается, и через 30-60 мин многие агглютинаты становятся почти полностью или полностью окруженными слоем плазматоцитов (Рисунок 28 б, г). Часто наблюдаются и многослойные капсулы. Способность агглютинатов к адгезии широко варьирует. Наряду с полностью окруженными плазматоцитами агглютинатами обычно имеются и «голые», вокруг которых плазматоциты не конденсируются и не образуют капсул (Рисунок 28 г).
Как известно, гемолимфа насекомых содержит ряд фунгицидных пептидов, которые могут синтезироваться постоянно, как полипептид, выделенный из гемолимфы S. peregrina (Iijima et al., 1993), или под действием септической травмы, как дрозомицин D. melanogaster (Fehlbaum et al., 1994) или танатин P. maculiventris (Fehlbaum et al., 1996). К тому же было показано, что существует синергизм в действии фунгицидных белков и антимикробных пептидов. Небольшое количество саркотоксина I значительно усиливает летальный эффект фунгицидного белка S. peregrina по отношению к C. albicans (Iijima et al., 1993). В интактных условиях уровень антимикробных пептидов в гемолимфе значительно снижен. Но, возможно, в гемолимфе L. sericata также присутсвует конститутивно синтезирующийся фунгицидный пептид, и незначительного количества антимикробных пептидов может быть достаточно для усиления его активности. Это предположение может объяснить сходство эффектов, производимых гемолимфой иммунизированных и гемолимфой интактных личинок на развитие мицелия грибов, и даже более значительную активность гемолимфы интактных личинок по отношению к A. flavus.
Похожие данные были получены при исследовании фунгицидной активности гемолимфы C. vicina (Дольник , неопубликованные данные). Тест-объектами в этой работе были Aspergillus sp. и Rhizopus nigricans. Гемолимфа иммунизированных личинок C. vicina несколько ингибировала рост колоний аспергилла и значительно (на 4 суток) задерживала процесс созревания конидий. Гемолимфа интактных личинок C. vicina полностью ингибировала рост колоний Rhizopus nigricans, и споры практически не созревали.
Естественная среда обитания личинок мясных мух делает их основными конкурентами как сапротрофные виды бактерий, так и различные низшие грибы. Поскольку чаще всего личинки мух перерабатывают субстрат совместно и зачастую эффективно борются с микроорганизмами, можно предположить, что они обладают слаженным механизмом борьбы и, вероятно, вместе с пищеварительными ферментами выделяют противогрибковые компоненты. Известно, что и у растений, и у насекомых, и у грибов существует огромный арсенал фунгицидных белков (Selitrennikoff, 2001), которые в основном являются гидрофобными, как дрозомицин или антифунгальный белок S. peregrina. Подобные компоненты должны быть сконцентрированы в гидрофобной
Антибактериальная активность гидрофобных фракций экзосекрета и гемолимфы личинок Lucilia sericata
Фунгистатический эффект экзосекрета личинок может быть связан с особенностями их естественных местообитаний. Вероятно, быстро развивающимся личинкам падальных мух достаточно в течение нескольких дней подавлять сапрофитные грибы, конкурирующие с ними за пищевой субстрат, не оказывая фунгицидного действия. Эта особенность также может быть связана с низкой концентрацией антибактериальных компонентов, которые, вероятно, оказывают скорее бактериостатическое действие, чем бактерицидное. Однако при попадании патогена или чужеродного микроорганизма в гемолимфу начинают действовать механизмы, активирующие синтез как фунгицидных, так и бактерицидных веществ; очевидно, что временного подавления патогенного организма недостаточно и необходимы более эффективные способы борьбы. Обнаруженные в гемолимфе L. sericata антимикробные пептиды, действущие на основные типы патогенов, подтверждают это предположение. В гемолимфе L. sericata, по всей видимости, присутствуют дефензины, диптерицины и Р-пептиды, т.е., за исключением цекропинов, все классы бактерицидных пептидов, характерные для C. vicina. Вероятно, эти антибиотические молекулы являются общими на уровне семейства, в то время как существуют пептиды, характерные для конкретного вида и отличающиеся от пептидов других представителей семейства.
Антимикробные пептиды, как известно, являются одним из эффекторных звеньев гуморального иммунного ответа в организме насекомых. Однако существуют и клеточные механизмы защиты. В работе были охарактеризованы основные типы гемоцитов L. sericata и описаны основные типы иммунологических реакций при попадании в организм чужеродных частиц, к которым относятся фагоцитоз и инкапсуляция.
Гемолимфа личинок L. sericata очень близка по гемоцитарному составу и защитным механизмам к гемолимфе C. vicina. Эта особенность также объясняется близостью видов, принадлежащих к одному семейству. В то же время существуют и отличия, характеризующие отдельные виды.
Обобщая полученные результаты, следует в заключение подчеркнуть, что личинки L. sericata обладают, по крайней мере, тремя уровнями защиты. Первый уровень представлен определенными типами гемоцитов, тромбоцитоидами и фагоцитирующими плазматоцитами. Реакция этих гемоцитов начинается в первые секунды после инвазии. Второй уровень – это нодуляция и инкапсуляция чужеродных объектов, а также медленный фагоцитоз, характерный для поздних плазматоцитов. И, наконец, третий уровень представлен гуморальными механизмами защиты - выработкой антибактериальных и фунгицидных пептидов и низкомолекулярных соединений. Антимикробные соединения, синтезируемые личинками L. sericata, выполняют две основные функции – уничтожение патогенов, проникших в гемолимфу (функция иммунологической защиты), и временное блокирование роста сапрофитных микроорганизмов в окружающей среде (функция защиты пищевого субстрата). Функция иммунологической защиты обеспечивается каскадом реакций на микробную инвазию, конечным звеном которого служит индукция синтеза и секреции в гемолимфу антимикробных пептидов клетками жирового тела и гемоцитами. Функция защиты пищевого субстрата обеспечивается выделением в окружающую среду экзосекрета, содержащего антимикробные метаболиты, источником которых, по-видимому, служат слюнная железа и кишечный эпителий.
В состав экзосекрета, как нам удалось установить, входят пептиды аналогичные или идентичные антимикробным пептидам гемолимфы (диптерицины), высокомолекулярные соединения (вероятно, также пептидной природы), отличные от известных компонентов гемолимфы, и низкомолекулярные соединения, главной особенностью которых является способность подавлять рост метициллин-устойчивого золотистого стафилококка in vitro. Было выявлено, что фракции экзосекрета, ингибирующие MRSA, включают один общий компонент, молекулярная масса которого 524 Да. Природа низкомолекулярных компонентов остается неизвестной, однако в качестве рабочей гипотезы можно предположить, что они относятся к вторичным метаболитам, функционально сходным с антибиотиками микробного происхождения. В пользу этой гипотезы свидетельствует тот факт, что известные антибиотики микробного происхождения также выполняют функцию подавления пищевых конкурентов. Если эта гипотеза найдет в будущем подтверждение, то экзосекрет личинок L. sericata и других двукрылых-сапрофагов может оказаться ценным источником для поиска новых природных антибиотиков.
1. Трофические связи, характерные для зеленой мясной мухи Lucilia sericata (питание мертвыми и живыми тканями млекопитающих) обусловили формирование двух антимикробных комплексов, используемых личинками при контакте с микробиотой: комплексы гемолимфы и экзосекрета.
2. Антимикробный комплекс гемолимфы L. sericata, как и других мух-каллифорид, формируется в процессе иммунного ответа личинок на инфекцию и включает представителей трех известных семейств антимикробных пептидов – дефензинов, дипетрицинов и Р-пептидов. В его составе также обнаружены и частично охарактеризованы методами хроматографии и масспектрометрии неизвестные ранее пептиды и низкомолекулярные соединения с антибактериальной активностью.
3. Экзосекрет, выделяемый во внешнюю среду слюнными железами и кишечником в период активного питания личинок L. sericata, обладает выраженной антибактериальной и антифунгальной активностью и содержит как пептиды, так и низкомолекулярные компоненты с антимикробной активностью.
4. Общим антимикробным компонентом гемолимфы и экзосекрета L. sericata является пептид диптерицин, участвующий как в иммунном ответе, так и пищевых реакциях личинок. На примере диптерицина можно видеть уникальный механизм адаптации к обитанию в агрессивном микробном окружении – секреции компонента иммунного ответа в окружающую среду для подавления потенциальных патогенов и пищевых конкурентов.
5. Другие антимикробные компоненты гемолимфы и экзосекрета, по данным хроматографического, масспектрометрического и микробиологического анализа, различаются по структуре и биологической активности.
6. Антифунгальная активность экзосекрета L. sericata обусловлена компонентами двух типов: гидрофобные соединения, относящиеся к диптерицинам и, вероятно, другим катионным пептидам и гидрофильные соединения неизвестной природы.
7. Высокая антифунгальная активность является общим свойством экзосекрета не только L. sericata, но и личинок других видов сапротрофных двукрылых, в частности копронекрофага Calliphora vicina и пантофага Musca domestica. Это обстоятельство указывает на важное адаптивное значение противогрибковых компонентов экзосекрета двукрылых-сапробионтов с различной пищевой специализацией.
