Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы .9
1.1. Иммунная система насекомых 9
1.1.1. Распознавание «чужого» 10
1.1.2. Элиминация «чужого» 1.1.2.1. Фагоцитоз 12
1.1.2.2. Инкапсуляция и образование морул .13
1.1.2.3. Коагуляция гемолимфы .14
1.1.2.4. Цитотоксическая реакция .15
1.1.2.5. Меланизация .16
1.1.2.6. Антимикробные пептиды .18
1.2. Антимикробные пептиды насекомых 19
1.2.1. Структурное разнообразие антимикробных пептидов 20
1.2.1.1. Цекропины .20
1.2.1.2. Пептиды, содержащие дисульфидные связи .21
1.2.1.3. Пептиды с регулярно повторяющимися аминокислотами 1.2.2. Механизм действия антимикробных пептидов .23
1.2.3. Жировое тело и его роль в синтезе антимикробных пептидов 24
1.2.4. Другие источники антимикробных пептидов .25
1.2.5. Индукция синтеза антимикробных пептидов 26
1.2.6. Роль эпителия и гемоцитов в индукции синтеза антимикробных пептидов клетками жирового тела
1.2.6.1. Роль эпителия в индукции синтеза пептидных антибиотиков 28
1.2.6.2. Роль гемоцитов в индукции синтеза пептидных антибиотиков .29
1.2.7. Cинтез антимикробных пептидов у Calliphora vicina .30
1.3. Взаимодействие иммунной и нейроэндокринной системы 31
1.3.1. Структурная организация нейроэндокринной системы .31
1.3.2. Основные гормоны насекомых 1.3.2.1. Экдистероиды .32
1.3.2.2. Ювенильный гормон .32
1.3.2.3. Адипокинетический гормон .33
1.3.2.4. Биогенные амины .33 I.3.3 Иммуно-нейроэндокринные взаимодействия .33 1.3.4. Влияние нейроэндокринной системы на иммунные процессы
у Calliphora vicina 35
1.3.5. Роль гормонов в регуляции иммунных процессов у насекомых .36
Глава II. Материал и методы .38
11.1. Биологический материал .38
11.2. Методы 39
11.2.1. Микрохирургические вмешательства .39
11.2.1.1. Инфицирование насекомых .39
11.2.1.2. Наложение лигатур и термическое воздействие 39
11.2.1.3. Сбор гемолимфы и отделение плазмы .40
11.2.1.4. Отделение покровов .40
11.2.1.5. Выделение жирового тела .41
11.2.1.6. Определение жизнеспособности культивируемых клеток 41
11.2.2. Методы концентрации и очистки веществ .41
11.2.2.1. Избирательная денатурация под действием температуры .41
11.2.2.2. Метод твердофазной экстракции 42
11.2.2.3. Метод ультрафильтрации 42
11.2.2.4. Хроматографическое фракционирование .42
11.2.2.5. Масс-спектрометрия
1.2.3. Анализ антимикробной активности материала .43
11.2.4. Статистическая обработка экспериментальных данных 45 Глава III. Индукция синтеза антимикробных пептидов in vivo 111.1. Эффект инфицирования .47
111.2. Эффект стрессорного воздействия
111.2.1. Эффект лигатурного стресса 50
111.2.2. Эффект термического ожога
111.3. Состав антимикробных пептидов, синтезируемых in vivo 53
111.4. Заключение .57
Глава IV. Синтез антимикробных пептидов клетками жирового тела in vitro 61
IV.1. Разработка органной культуры жирового тела .61
IV.1.1. Выбор базового состава культуральной среды 61
IV.1.2. Выживаемость культивируемых клеток .65
IV.1.3. Индукция антимикробной активности in vitro .67
IV.1.3.1. Роль «фактора плазмы» в активации жирового тела 68
IV.1.3.2. Роль «фактора покровов» в активации жирового тела 70 IV.1.3.3. Роль гормонов в активации жирового тела .72 IV.1.4. Стерилизация культуры жирового тела .74 IV.1.5. Температура культуральной среды .79 IV.1.6. Перемешивание культуры 79 IV.1.7. Газообмен в культуре жирового тела 81 IV.1.8. Геометрические параметры культуральной ячейки 83 IV.1.9. Продолжительность цикла культивирования .85 IV.2. Количественные характеристики метода получения антимикробных пептидов
in vitro 87
IV.3. Состав антимикробных пептидов, синтезируемых in vitro 89
IV.4. Заключение .95
Глава V. Поиск факторов активации жирового тела и изучение их свойств 97
V.1. Термостабильность факторов активации жирового тела 97
V.1.1. Термостабильность факторов активации, локализованных в плазме .97
V.1.2. Термостабильность факторов активации, локализованных в покровах .98
V.2. Молекулярная масса факторов активации жирового тела .99
V.3. Хроматографические характеристики факторов активации жирового тела 101
V.4. Видоспецифичность факторов активации жирового тела .102
V.5. Заключение 104
Глава VI. Обсуждение .105
VI.1. Травмогенная индукция синтеза антимикробных пептидов 105
VI.2. Нейрогенная индукция синтеза антимикробных пептидов 111
VI.3. Органная культура жирового тела в иммунологии и биофармакологии насекомых 117
VI.3.1. Органная культура жирового тела как инструмент для изучения механизмов индукции антимикробной активности .117
VI.3.2. Органная культура жирового тела как перспективный источник белков медицинского назначения .119
Выводы .122
Список употребляемых в работе сокращений 124
Список литературы .
- Антимикробные пептиды насекомых
- Определение жизнеспособности культивируемых клеток
- Индукция антимикробной активности in vitro
- Термостабильность факторов активации, локализованных в покровах
Введение к работе
Актуальность исследований. Мясные мухи семейства Calliphoridae являются традиционным объектом энтомологических исследований. Их изучение внесло значительный вклад в развитие физиологии, экологии, морфологии и других разделов общей энтомологии (Виноградова, 1984). Интерес к мухам-каллифоридам обусловлен той ролью, которую многие представители данного семейства играют в жизни и хозяйственной деятельности человека. В частности, хорошо известно, что синантропные виды мясных мух, в силу своей пищевой специализации, являются одними из основных переносчиков бактериальных инфекций. Питаясь экскрементами и трупами животных, мухи-каллифориды переносят множество патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (Paraluppi et al., 1996; Sukontanson et al., 2000; Habeeb, Mahdi, 2012). Менее известно, что мясные мухи представляют большой интерес в качестве объекта технической энтомологии. Личинки некоторых видов издавна используются в медицине как средство лечения инфицированных ран и язв (Sherman et al., 2000; Sherman, 2009). Находят они применение также в системах утилизации отходов мясной и рыбной промышленности (Колтыпин, 1977).
Особый интерес с точки зрения задач как общей, так и прикладной (технической) энтомологии представляет изучение иммунной системы мух-каллифорид. В основе их устойчивости к бактериальным инфекциям, наряду с другими механизмами, лежит способность синтезировать и накапливать в гемолимфе антимикробные пептиды. Особенности жизненной стратегии синантропных мух привели к возникновению комплексов антимикробных пептидов, эффективных в отношении патогенов человека. Прежде всего, это касается постоянного компонента их среды обитания - кишечной палочки и других энтеробактерий (Черныш, Гордя, 2011).
Целью исследования являлось изучение механизмов регуляции синтеза антимикробных пептидов в процессе иммунного ответа личинок мух-каллифорид. Этот вопрос является ключевым для понимания стратегий адаптации данной группы насекомых к обитанию в экстремальной с точки зрения контаминации потенциально опасными микроорганизмами среде. Для достижения цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:
Оценка влияния различных факторов инфекционной и неинфекционной природы на титр антимикробных пептидов в гемолимфе личинок;
Сравнение состава антимикробных пептидов, продуцируемых иммуноцитами при воздействии на личинку септических и асептических раздражителей;
Изучение спектра бактерицидной активности антимикробных пептидов личинки;
Разработка культуры жирового тела - модели для изучения механизмов регуляции синтеза антимикробных пептидов in vitro]
Сравнение состава антимикробных пептидов, продуцируемых иммуноцитами in vivo и in vitro;
Поиск в организме личинки соединений, влияющих на синтез антимикробных пептидов клетками жирового тела;
Оценка возможностей использования культуры жирового тела в качестве продуцента биологически активных веществ.
Научная новизна. В настоящей работе впервые доказано прямыми экспериментами in vitro, что источником пептидных антибиотиков в организме личинок мух-каллифорид является жировое тело, которое активно выделяет антимикробные компоненты в гемолимфу в ответ на микробную инвазию, механическое повреждение покровов либо при стрессе. Установлено, что состав продуцируемых клетками жирового тела антимикробных пептидов не зависит от природы повреждения и включает дефензины, цекропины, диптерицины и пролин-богатые пептиды. Комплекс этих пептидов обладает выраженной активностью в отношении энтеробактерий, а также условно-патогенных обитателей кожных покровов человека и животных. В гемолимфе личинок мух-каллифорид обнаружены неизвестные ранее растворимые факторы, необходимые для запуска синтеза антимикробных пептидов клетками жирового тела и выделяемые, по-видимому, клетками покровного эпителия при повреждении. Впервые показано, что синтез антимикробных пептидов жировым телом находится под контролем т. н. «гормонов стресса», которые оказывают прямой дозозависимый эффект на активность иммунокомпетентных клеток. Разработанную автором технологию культивирования жирового тела предложено использовать в технической энтомологии для получения фармакологически активных веществ, предназначенных для лечения бактериальных инфекций человека и животных.
Практическая ценность. Изучение механизмов регуляции синтеза пептидных антибиотиков у мух-каллифорид не только расширяет представления об организации иммунной системы беспозвоночных, но и решает ряд прикладных задач, связанных с разработкой принципиально новых антимикробных препаратов. Дело в том, что комплексы антимикробных пептидов мясных мух обладают уникальной способностью блокировать развитие лекарственной устойчивости у бактерий, и это выгодно отличает их от большинства современных антибиотиков (Черныш, Гордя 2011). Однако ввиду многокомпонентности антимикробных комплексов, их получение для практических нужд известными методами химического или биологического синтеза на данный момент представляет значительные трудности. Разработанная автором методология органной культуры жирового тела
предлагает новое решение этой проблемы, позволяя получать антимикробные комплексы с использованием стандартного оборудования, используемого в клеточной инженерии.
Апробация результатов работы. Материалы диссертации доложены на XIII съезде Русского энтомологического общества (Краснодар, 9-15 сентября 2007 г.), 14-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 19-23 апреля 2010 г.) и Международной научной конференции «Фундаментальные проблемы энтомологии в XXI веке» (Санкт-Петербург, 16-20 мая 2011 г.). По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 3 статьи в отечественных рецензируемых журналах, и создано одно изобретение «Способ получения комплекса антимикробных пептидов насекомого» (26 декабря 2013 г. подана заявка №2013157808 на выдачу патента РФ).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста, состоит из введения, 6 глав, выводов, списка сокращений и списка литературы. Работа иллюстрирована 35 рисунками и содержит 2 таблицы. Список литературы включает 240 работ, из них - 210 на иностранных языках.
Антимикробные пептиды насекомых
Антимикробные пептиды были впервые обнаружены у насекомых в 50-х гг. XX века (Briggs, 1958). Однако их интенсивное изучение началось с работ коллектива Ганса Бомана, выполненных на сатурнии Hyalophora cecropia (Pye, Boman, 1977). На сегодняшний день в базе данных (http://aps.unmc.edu/AP/main.php) насчитывается более 800 пептидных антибиотиков природного происхождения, и около половины из них «принадлежит» насекомым.
Изначально антибактериальную активность гемолимфы в основном отождествляли с активностью лизоцима. Лизоцим представляет собой муколитический фермент, гидролизующий гликозидную связь между N-ацетилглюкозамином и N-ацетилмурамовой кислотой пептидогликана клеточной стенки бактерий. Как и большинство антимикробных пептидов насекомых, лизоцим характеризуется индуцибельным характером синтеза: титр фермента возрастает в десятки, или даже сотни, раз при септическом заражении (Dunn, 1986).
Примечательно, что лизоцим активен исключительно в отношении грамположительных бактерий. Вероятно, это связано с отсутствием у последних наружной мембраны и доступностью пептидогликанового слоя. Однако большинство исследователей полагает, что бактерицидные свойства лизоцима не являются превалирующими. Основная же функция этого фермента, по-видимому, связана с удалением фрагментов клеточных стенок, которые остаются в гемолимфе после действия антимикробных пептидов (Kanost, 1988). Помимо этого лизоцим осуществляет «презентацию» коротких фрагментов петидогликанового слоя другим распознающим молекулам и, в конечном счете, эффекторным клеткам иммунной системы. Результатом распознавания является синтез антимикробных пептидов и запуск клеточных механизмов защиты (Morishima, 1992). I.2.1. Структурное разнообразие антимикробных пептидов
Цекропины – это линейные катионные пептиды, состоящие из 35-39 аминокислотных остатков. Молекулу цекропина можно условно разделить на полярный положительно заряженный N-концевой участок, переходящий в преимущественно гидрофобный срединный отрезок, соединяемый пролином и/или глицином с С-концевой последовательностью. Все С-концевые аминокислоты известных цекропинов насекомых амидированы. Вторичная структура представляет собой неупорядоченный N-концевой участок, переходящий в классическую амфипатическую -спираль, которая шарнирной последовательностью соединена с С-концевой, преимущественно гидрофобной -спиралью (Кокряков, 1999; Holak et al., 1988).
Цекропины описаны у представителей отрядов Lepidoptera и Diptera (Cociancich et al., 1994b). На сегодняшний день это, пожалуй, наиболее изученная группа антимикробных пептидов. Цекропины проявляют активность в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибков, опухолевых клеток, простейших, вирусов и даже некоторых круглых червей (Ratcliffe et al., 2011). Однако спектр активности цекропинов варьирует в зависимости от видовой принадлежности объекта. Так, например, цекропины чешуекрылых активны против грамотрицательных и грамположительных бактерий, но не проявляют активности в отношении эукариотических клеткок (Boman et al., 1991), в то время как цекропины двукрылых активны исключительно против грамотрицательных бактерий (Chernysh et al., 2000). Более узкий спектр действия цекропинов двукрылых вероятно связан с наличием дополнительной группы пептидов – дефензинов, которых у чешуекрылых нет. I.2.1.2. Пептиды, содержащие дисульфидные связи
К данной группе относятся преимущественно дефензины – катионные пептиды, состоящие из 34-51 амикокислотных остатков. Для всех дефензинов насекомых характерно присутствие 6 консервативно расположенных цистеиновых остатков, образующих три внутримолекулярных дисульфидных мостика (Hoffmann et Hetru, 1992). В молекуле дефензина можно выделить три участка: гибкий и малоупорядоченный N-концевой, центральный, представленный амфипатической -спиралью, и С-концевой. С-концевой участок дефензина является -слоем, сформированным двумя антипараллельными -тяжами (Bonmatin et al., 1992). Дисульфидные мостики стабилизируют вторичную структуру пептида и поддерживают его третичную структуру, которая необходима для максимальной реализации антимикробных свойств молекулы (Bulet, Stocklin, 2005). Два мостика связывают -спираль с одним из -тяжей, а третий мостик – другой -тяж с N-концевым участком.
Дефензины обнаружены у представителей отрядов Diptera, Coleoptera, Hemiptera, Hymenoptera, Trychoptera и Odonata (Dimarcq et al., 1994; Moon et al., 1994; Cociancich et al., 1994a; Chernysh et al., 1996; Rees et al., 1997; Bulet et al., 1992). Антибиотики данной группы токсичны только для грамположительных бактерий и почти не проявляют активности в отношении грамотрицательных бактерий и эукариотических клеток (Lehrer et al.,1993).
Помимо дефензинов у насекомых были обнаружены и другие пептиды, стабилизированные дисульфидными мостиками. Один из них – дрозомицин - был описан у плодовой мушки Drosophila melanogaster (Fehlbaum et al., 1994). Молекула дрозомицина состоит из 44 аминокислотных остатков и содержит 4 сульфидных мостика, образуемых 8 остатками цистеина. Дрозомицин оказывает мощное фунгицидное действие. При этом ни на клетки бактерий, ни на клетки животных этот пептид не оказывает токсического эффекта.
Другой пептид – танатин – был найден у клопа Podisus maculiventris (Fehlbaum at al., 1996). Танатин – это катионный, относительно гидрофобный пептид, состоящий из 21 аминокислотного остатка. Единственная дисульфидная связь в молекуле танатина формирует петлю. Танатин обладает широким спектром цитотоксического действия. Он токсичен для многих грамотрицательных и грамположительных бактерий, а также для клеток грибов. В то же время танатин не проявляет активности в отношении клеток животных.
Пептиды с высоким содержанием какой-либо из аминокислот, обычно - пролина, глицина или аргинина, встречаются у насекомых достаточно часто. К данной группе относят апидацин (Casteels et al.,1989) и абецин (Casteels et al., 1990), выделенные из медоносной пчелы Apis mellifera. В молекуле апидацина 29% аминокислотного состава приходится на пролин и 17% - на аргинин. Эти аминокислотные остатки встречаются в виде последовательностей PRP и PP. Пептид, содержащий сходные последовательности -дрозоцин, был выделен из гемолимфы плодовой мушки Drosophila melanogaster (Bulet et al., 1993). К этой же группе пептидов относится пиррокорицин клопа Pyrrhocoris apterus (Cociancich et al., 1994a). И дрозоцин, и пиррокорицин являются гликопептидами. В отличие от пиррокорицина метальниковины - пептиды, обнаруженные в гемолимфе клопов из семейства Pentatomidae, не гликозилированы и проявляют более слабую антимикробную активность (Chernysh et al., 1996). Все перечисленные пептиды активны в отношении грамотрицательных бактерий. Однако есть пептиды, обладающие комбинированной бактерицидной и фунгицидной активностью. К ним, в частности, относится мечниковин, выделенный из дрозофилы (Levashina et. al., 1995). У чешуекрылых обнаружены полипептиды с высоким содержанием глицина - аттацины (Boman, 1991). Существуют две формы аттацинов: кислые и основные. Гомология аминокислотных последовательностей между ними составляет около 79%. Для аттацинов характерен довольно узкий спектр антибактериальной активности, направленный против некоторых грамотрицательных бактерий, обитающих в кишечнике насекомых. Однако этот спектр, вероятно, может быть существенно расширен в присутствии других антимикробных факторов, секретируемых в гемолимфу одновременно с аттацинами.
Определение жизнеспособности культивируемых клеток
Строение нейроэндокринной системы насекомых вообще и высших двукрылых в частности детально освещено в литературе (Виноградова, 1984). Нервная система личинок мух отличается высокой концентрацией составляющих ее элементов. Крупная ганглионарная масса (далее – мозг) располагается в 3-ем грудном и 1-ом брюшном сегментах. Она включает большой надглоточный ганглий и синганглий, образовавшийся в результате слияния подглоточного, трех грудных и всех брюшных ганглиев. От этой структуры отходят нервы к различным органам личинки.
Доминирующее местоположение в эндокринной системе насекомых занимают нейросекреторные клетки мозга. Они синтезируют тропные факторы, регулирующие работу проторакальных желез (проторакотропный и проторакостатический гормоны) и прилежащих тел (аллатотропный и аллатостатический гормоны), а также ряд пептидов, модифицирующих скорость и направление метаболизма в жировом теле, мальпигиевых сосудах и других тканях (Черныш и др., 2007).
Перед выделением в гемолимфу секреторные продукты мозга обычно накапливаются в кардиальных телах. Помимо запасающей функции кардиальные тела личинок выполняют функции секреторного органа: нейросекреторные клетки кардиальных тел синтезируют ряд гормонально активных пептидов и биогенных аминов. Активность этих клеток находится под непосредственным контролем нейронов надглоточного ганглия. Кардиальное тело служит главным нейрогемальным органом. По аллатальным нервам секрет из кардиального тела выводится к прилежащему телу и проторакальным железам (Черныш и др., 2007).
Прилежащие тела – источник ювенильного гормона, проторакальные железы продуцируют экдистероиды. Личинкам высших двукрылых свойственно слияние прилежащих тел с кардиальными телами и проторакальными железами в сложное образование – кольцевую железу. Она прилегает к надглоточному ганглию сзади, располагаясь вокруг аорты
Экдистероиды синтезируются проторакальными железами. Из гормонов этой группы наибольшее распространение у насекомых получили 20-гидроксиэкдизон и его предшественник – экдизон. Наиболее полно изучено участие экдистероидов в морфогенетических процессах, а именно – в регуляции линек, метаморфоза и репродукции. Уровень синтеза этих гормонов характеризуется строгой цикличностью: в период эмбриогенеза и в межлиночный период у личинок титр экдистероидов минимален, а за несколько часов до линьки происходит повышение титра этих гормонов. У куколки экдистероиды инициируют лизис тканей и развитие зачатков из крыловых дисков, у имаго – стимулируют развитие половых желез.
Ювенильный гормон синтезируется прилежащими телами. Он регулирует обмен веществ в организме насекомого и опосредует морфогенетические процессы, а также индуцирует вителлогенез и управляет половым поведением у имаго. Ювенильный гормон вызывает задержку метаморфоза и определяет переход насекомого в диапаузное состояние. Метаморфоз всегда проходит при пониженном уровне этого гормона. На эмбриональной и куколочной стадиях ювенильный гормон практически не обнаруживается. На стадии личинки уровень синтеза этого гормона максимален и имеет четко выраженную цикличность: увеличение титра ювенильного гормона наблюдается в предлиночный период. На имагинальной стадии повышение титра происходит в период спаривания и яйцекладки. Кроме того, ювенильный гормон обладает проторакотропной активностью, стимулируя синтез экдистероидов проторакальными железами (Раушенбах, 1990).
Мобилизация липидов, депонированных в жировом теле насекомых, осуществляется адипокинетическим гормоном – олигопептидом, синтезируемым преимущественно железистой долей кардиальных тел. Функция этого гормона заключается в энергетическом обеспечении длительных физических нагрузок, в особенности работы крыловой мускулатуры при полете. Помимо влияния на метаболизм липидов и углеводов установлено стимулирующее действие адипокинетического гормона на мотонейроны центральной нервной системы насекомых (Milde et al., 1995) – это может иметь значение для запуска или поддержания репертуара поведенческих реакций.
В мозге, кардиальных телах и ганглиях брюшной нервной цепочки насекомых синтезируются вещества из группы биогенных аминов: октопамин, допамин, тирамин, 5-гидрокситриптамин и норадреналин. Биогенные амины влияют на метаболизм углеводов и липидов в организме насекомого. Считается, что именно октопамин обеспечивает быструю мобилизацию запасных липидов, в то время как адипокинетический гормон подключается в более поздние сроки. Стимулируя расщепление гликогена, биогенные амины обеспечивают двигательные нейроны энергией (Steel, 1985). Биогенные амины контролируют секрецию адипокинетического гормона и других гормонов (Passier et al., 1995).
Иммуно-нейроэндокринные взаимодействия
Нейроэндокринная система регулирует и координирует деятельность всех органов и систем, обеспечивая адаптацию организма к меняющимся условиям внешней и внутренней среды. Изучение нейрогуморальной регуляции иммунных процессов представляет собой одно из главных направлений современной иммунологии человека и высших животных. Интерес обусловлен отчасти проблемой предупреждения и лечения аутоиммунных заболеваний, причиной которых является нарушение взаимодействия иммунной и нейроэндокринной систем.
Изучение иммуно-нейроэндокринных взаимодействий у беспозвоночных животных началось с опытов С. И. Метальникова (Brey, 1998). Им был исследован эффект оперативного выключения крупных отделов нервной системы на динамику иммунного ответа у инфицированных гусениц восковой моли Galleria mellonella. Полученные результаты свидетельствуют о том, что разрушение одного из грудных ганглиев нервной цепочки вызывает последующую гибель всех опытных насекомых от заражения. Количество фагоцитов в гемолимфе таких насекомых было чрезвычайно низким. Хотя результаты опытов, в частности, характер влияния грудного ганглия на иммунный ответ, не получили объяснения, именно благодаря этим исследованиям впервые была установлена важная роль нервной системы в инфекционных процессах у беспозвоночных.
В основе другого подхода к изучению иммуно-нейроэндокринных взаимодействий in vivo лежит изоляция иммунокомпетентных клеток от нейроэндокринного центра путем наложения лигатуры. Изолирующая лигатура позволяет оценить степень влияния нейроэндокринной системы на протекание различных иммунных реакций и, с другой стороны, – степень автономности иммунной системы. На том же модельном объекте – гусеницах восковой моли Galleria mellonella – было показано, что наложение лигатуры позади II сегмента тела приводит к двукратному уменьшению общего количества свободно циркулирующих гемоцитов в организме насекомого, в то время как наложение лигатуры позади головы не оказывает подобного эффекта (Jones, Liu, 1969). Техника лигатур была также использована при изучении взаимодействий «паразит-хозяин» у мухи Drosophila algonquin: наложение личинке изолирующей лигатуры после ее заражения паразитоидом Pseudeucoila bochei приводило к уменьшению количества образуемых гемоцитами капсул в задней части тела. При этом снижалась и фенолоксидазная активность (Nappi, 1975).
Нейроэндокринная регуляция иммунных процессов, по-видимому, имеет место при стрессорном воздействии. Так, например, длительное покачивание гусениц восковой моли Galleria mellonella приводит к увеличению количества свободно циркулирующих гемоцитов, также повышается уровень экспрессии антимикробного пептида галиомицина в иммунокомпетентных клетках (Mowlds et al., 2008). Таким образом, влиянию со стороны нейроэндокринной системы подвержены как клеточные, так и гуморальные защитные процессы.
Индукция антимикробной активности in vitro
Клетки насекомых сохраняют способность к росту и размножению в достаточно широком диапазоне температур: от 22 С до 34 С (Vaughn, 1984; Agathos et al., 1990; Reuveny et al., 1993). Однако в качестве оптимальной для размножения клеток и поддержания высокой метаболической активности (речь, главным образом, идет о продукции рекомбинантных белков in vitro) рекомендована температура 27 С (Vaughn, 1984; Agathos et al., 1990; Stockdale, Priston, 1981; Cruz et al. 1999). Повышение температуры с 27 С до 34 С приводит к заметному снижению уровня белкового синтеза (Reuveny et al., 1993).
Понижение температуры с 27 С до 22 С не сказывается на количестве выделяемого клеткой белка; зависимой от температуры является лишь скорость накопления белка в культуральной среде (Reuveny et al., 1993). При этом умеренное понижение температуры – с 27 С до 25 С – позволяет компенсировать нехватку растворенного в среде кислорода (Reuveny et al., 1993), что особенно актуально в нашем случае, когда жесткая регуляция газообмена в культуре отсутствует. Таким образов, для культивирования жирового тела личинки Calliphora vicina была выбрана температура +25 С – +27 С.
Существенным недостатком закрытого (непроточного) глубинного культивирования клеток является риск кислородного голодания культуры, перепадов температуры и рН среды, а также накопления токсичных продуктов метаболизма в межклеточном пространстве. Все эти факторы могут создавать стрессовые условия для клеток, что, в свою очередь, негативно сказажется на конечном выходе целевого продукта.
Гомогенность культуры достигается, главным образом, за счет ее непрерывного перемешивания. При эффективном перемешивании стерилизующие агенты, регуляторные молекулы плазмы и продукты метаболизма жирового тела, равномерно распределяются по всему объему культуральной среды. Клетки при этом находятся в одинаковых условиях. Кроме того, с ростом интенсивности перемешивания культуры увеличивается скорость абсорбции кислорода средой (по данным компании «Bioengineering», Швейцария). Для суспензионного культивирования клеток насекомых рекомендовано применение шейкеров с частотой вращения платформы 60-100 оборотов/мин (рекомендации компании «AB Vector», США). Рис. 23. Влияние перемешивания культуры на антимикробную активность клеток жирового тела (в культуральной среде без жирового тела антимикробной активности не зафиксировано). Достоверность различий при Р: 0.05, 0.01, 0.001.
В опыте по изучению влияния перемешивания культуры на метаболическую активность жирового тела C.vicina использовали диапаузирующих личинок, окончивших питание за две недели до начала эксперимента. Жировое тело извлекали из личинки и помещали в лунку планшета, заполненную 500 мкл культуральной среды с термически обработанной плазмой. Для предупреждения контаминации культуры в среду вносили пенициллин и стрептомицин (см. раздел IV.1.4.). В одном из вариантов опыта планшет с культурой был установлен на платформу орбитального шейкера OS-10 (ЗАО «Вектор-Бест», Россия) с заданной частотой вращения платформы 90 оборотов/мин. В другом варианте жировое тело культивировали в статичных условиях. Оба планшета хранили в температуре +25 С. Анализ антимикробной активности культуральной жидкости проводили на вторые сутки ведения культуры. Результаты анализа представлены на рисунке 23. На рисунке видно, что титр антимикробных пептидов, выделяемых клетками жирового тела при покачивании культуры, достоверно выше, чем в статичных условиях. При этом потери антимикробных пептидов во втором случае могут достигать более 30%, как в представленном эксперименте. Таким образом, перемешивание инкубационной среды является неотъемлемой составляющей культивирования жирового тела. В дальнейшем мы регулярно использовали орбитальный шейкер для перемешивания культуры.
Необходимым условием нормального роста клеток насекомых и продукции белка in vitro является поддержание постоянной концентрации кислорода в культуре – этого мнения придерживается большинство исследователей (Jain et al., 1991; Zhang et al., 1994; Agathos, 1996). С другой стороны, в литературе описаны результаты экспериментов, согласно которым концентрация растворенного в культуральной среде кислорода не влияет ни на скорость увеличения клеточной массы, ни на титр синтезируемого клетками насекомых белка (Hensler et al.,1994).
Согласно литературным данным, интенсивная аэрация культуры необходима не столько для сверхсинтеза целевого метаболита, сколько для наращивания биомассы продуцента. Оптимальной для роста культуры считается концентрация кислорода 50–60 % от полного насыщения, в то время как для биосинтеза целевых метаболитов достаточно 10–20 % (по данным компании «Bioengineering», Швейцария). Таким образом, если наша цель – изучение синтеза антимикробных пептидов in vitro, жесткая система поддержания газообмена нам, вероятно, не нужна, и умеренной вентиляции культуры будет достаточно для поддержания высокой метаболической активности продуцента.
Изучение газообмена в культуре жирового тела особенно актуально, поскольку данная проблема неразрывно связана с проблемой выбора культуральной посуды. На сегодняшний день для культивирования клеток наиболее широко используются изделия из полипропилена (микропробирки типа эппендорф, центрифужные пробирки) и полистирола (планшеты, чашки Петри, флаконы). Полипропиленовые пробирки закрываются герметично, в то время как посуда из полистирола в подавляющем большинстве случаев имеет зазоры или встроенные фильтры для вентиляции.
В работе по изучению влияния вентиляции культуры на антимикробную активность жирового тела использовали диапаузирующих личинок C.vicina, окончивших питание за две недели до начала эксперимента. Жировое тело извлекали из 20 личинок и помещали в центрифужную пробирку, заполненную культуральной средой – солевым раствором – на 2/3 из расчета 500 мкл среды на 1 жировое тело. В альтернативном варианте жировое тело, выделенное из 20 личинок, инкубировали в чашке Петри диаметром 9 см. Культуральной средой служила 30% ТОП. В контрольных вариантах плазму в среду не добавляли. Для предупреждения контаминации культуры в среду вносили пенициллин и стрептомицин (см. раздел IV.1.4.).
Термостабильность факторов активации, локализованных в покровах
Основываясь на полученных данных, мы выделили три этапа индукции синтеза пептидных антибиотиков у мясных мух (Рис. 33). На первом этапе происходит прямое или опосредованное распознавание бактериальных паттернов клетками жирового тела, на втором – поглощение жировым телом из гемолимфы аминокислот, на третьем – собственно, выделение иимунокомпетентными клетками антимикробных пептидов.
Теперь проанализируем эффект от септического заражения. Согласно результатам экспериментов, у личинок C.vicina отсутствует какая-либо специфичность иммунного ответа. Инфицирование личинок грамположительным кокком M.luteus приводит к накоплению в гемолимфе как антиграмположительных, так и антиграмотрицательных пептидов. Аналогично, следствием инфицирования грамотрицательной палочкой E.coli является синтез иммунокомпетентными клетками не только антиграмотрицательных, но и антиграмположительных пептидов. При этом ни титр антиграмположительных, ни титр антиграмотрицательных пептидов не зависят от типа иммуногена. Схожие результаты получены на каллифоре другими авторами (Гордя, неопубликованные данные). В то же время, данные по дрозофиле – самому изученному с точки зрения иммунологии представителю круглошовных мух – указывают на возможную дифференцировку иммунного ответа у плодовой мушки и зависимость количества синтезируемых иммунокомпетентными клетками бактерицидных молекул от типа патогена. Исследователи отмечают, что инфицирование личинки дрозофилы только лишь грамположительными или, наоборот, только лишь грамотрицательными бактериями запускает экспрессию всех антимикробных генов. Но при этом уровень экспрессии «антиграмположительных» генов значительно выше в случае инфицирования насекомого грамположительными бактериями. (Hoffmann, Reichhart, 2002). С другой стороны, из результатов более ранней работы той же группы авторов следует, что грамположительный кокк M.luteus является более слабым активатором экспрессии всех (!) антибактериальных генов, чем грамотрицательная палочка E.coli (Lemaitre et al., 1997). Но, так или иначе, ни те, ни другие результаты не согласуются с данными, полученными нами на синей мясной мухе.
Нетрудно заметить, что септическая травма представляет собой совокупность двух типов раздражителей: бактерий и травмирования покровов. При изучении влияния асептического сквозного повреждения покровов на синтез пептидных антибиотиков у мух, выяснилось, что даже в отсутствие бактерий травмирование сопровождается повышением титра антимикробных пептидов в гемолимфе, однако эффект от травмы несколько слабее, чем от септического повреждения. Тем не менее, «вклад» травмы в иммунный ответ может быть очень значительным. Особенно это касается активации синтеза пептидов с антиграмотрицательной активностью: в ряде случаев достоверных различий между титром антиграмотрицательных пептидов в гемолимфе травмированных и инфицированных личинок обнаружить не удалось. Что касается антиграмположительных пептидов, то инфицирование раны во всех случаях достоверно повышало активность иммунокомпетентных клеток. Данные по влиянию асептической травмы на антимикробную активность иммуноцитов у C.vicina согласуются с данными, полученными на мясных мухах другими авторами. Так, например, у мухи Phormia terranovae введение живых либо убитых грамположительных и грамотрицательных бактерий, липополисахаридов, пептидогликанов, дистиллированной воды и даже простое повреждение покровов в стерильных условиях приводило к продуцированию одних и тех же семейств антимикробных пептидов. Однако иммунный ответ при асептическом повреждении покровов, как и в нашем случае, был выражен слабее и, кроме того, имел более короткое время проявления, чем при инфицировании (Dimarcq et al., 1990; Hoffmann, Hoffmann, 1990).
Природа асептической травмогенной индукции синтеза антимикробных пептидов у насекомых неясна. Возможно, что у мух в случае стерильного повреждения покровов, как и при инфицировании, имеет место активация молекулярных факторов плазмы, стимулирующих синтез антимикробных пептидов иммунокомпетентными клетками. Тогда остается непонятным, чем инициируется распознающий каскад, поскольку патоген-ассоциированные молекулярные паттерны при стерильном повреждении в гемолимфе отсутствуют. Участие гормонов в иммунном процессе, по-видимому, также исключено: изоляция иммунокомпетентных клеток от нейроэндокринной системы не влияет на продуцирование ими антимикробных пептидов. Другим потенциальным источником регуляторных молекул при травме являются покровы. Причем в последнем случае может иметь место как активное (опустошение клеточных депо либо синтез de novo), так и пассивное (разрушение гиподермальных клеток или кутикулярного матрикса) выделение иммунотропных факторов в гемолимфу, прямо или опосредованно влияющих на антимикробную активность жирового тела. Но, в любом случае, если травмирование личинок приводит к активации синтеза
109 антимикробных пептидов, то плазма травмированных насекомых (либо выделенная через прокол стенки тела интактных насекомых) будет содержать иммуномодуляторные факторы – при добавлении такой плазмы к жировому телу антимикробная активность иммуноцитов повысится. Данное предположение подтверждается результатами экспериментов in vitro – плазма действительно стимулирует выделение бактерицидных компонентов клетками жирового тела.
Поиску и очистке плазматических факторов активации жирового тела в работе уделено особое внимание. Предварительный анализ позволяет предположить, что в плазме присутствуют несколько соединений с иммуномодуляторной активностью: одни имеют гидрофильную, а другие – гидрофобную природу. Плазматические факторы активации являются термостабильными соединениями с молекулярной массой в пределах 3 кДа, специфичными для мух семейства Calliphoridae.
Покровы личинки также являются источником факторов активации жирового тела. Установлено, что при инкубировании «цельных» покровов происходит накопление иммуномодуляторных факторов в культуральной среде. Так, культуральная жидкость, собранная через 4 часа культивирования покровов, стимулирует клетки жирового тела к синтезу антимикробных пептидов сильнее (достоверное влияние отмечено в 100% случаев), чем культуральная жидкость, собранная через 30 минут (достоверное влияние отмечено в 50% случаев). Это свидетельство того, что источником индуктора антимикробной активности жирового тела, возможно, является не кутикулярный матрикс, а именно живые клетки – эпителиоциты, которые при повреждении покровов активно выделяют регуляторные факторы в плазму. Характерно, что накопление фактора активации жирового тела в культуре покровов происходит уже в течение получаса – настолько короткий временной интервал наводит на мысль о депонировании активационного фактора в эпителиальных клетках.
Следующим вопросом является вопрос об изначальной локализации факторов активации жирового тела в организме личинки. Например, следует учитывать тот факт, что плазматические факторы активации могут как изначально присутствовать в плазме, так и попадать туда вследствие разрушения эпителиальных клеток, имеющего место при сборе гемолимфы. Кроме того, если индуктор локализован в плазме изначально, то неясно, активен ли индуктор в организме личинки в норме, либо же он представлен в виде неактивного предшественника, активация которого происходит в случае повреждения покровов.
