Введение к работе
Актуальность проблемы
Помимо известной связи увеличенного содержания холестерина плазмы с развитием атеросклероза и ишемической болезни сердца, роль увеличенного содержания триглицеридов (ТГ) как независимого фактора риска становится все более очевидной (Austin, 2000). Гипертриглицеридемия часто ассоциирована с пониженным содержанием холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛВП) (Chapman et al., 2004). В метаболизме ТГ-богатых липопротеинов очень низкой плотности (ЛОНП) и ЛВП ключевое значение играют апобелки апоЕ (Brown, 2007) и апоА-1 (Frank and Marcel, 2000) соответственно. Патофизиологическая и прогностическая значимость отдельного метаболического компартмента (про- или анти-атерогенный эффект в развитии атеросклероза) тесно зависит от состояния сети метаболизма липопротеинов в целом. Действительно, существующая неопределенность оценки роли апоЕ связана с концентрационно-зависимыми эффектами промотирования клиренса ремнантов триглицерид-богатых частиц в области физиологических концентраций апобелка и индукции гипертриглицеридемии его большими концентрациями (Kypreos and Zannis, 2007). Аналогично, хорошо известная атеропротективная роль ЛВП может сменяться их про-атерогенной активностью в некоторых условиях (Florentin et al., 2008; Kontush and Chapman, 2006; Norata et al., 2006). Становится необходимым использование интегративного подхода в вычленении вкладов отдельных компартментов и относительной роли отдельных метаболических реакций (гидролиз триглицеридов и фосфолипидов липазами, генерация и транспорт эфиров холестерина, рецептор-опосредованный клиренс). Роль апобелков-эффекторов этих реакций в пулированности компартмента может реализоваться на уровне структурной организации липидной фазы и апобелков, придавая частице и пластичность и устойчивость к изменению сети (Pownall and Ehnholm, 2006), например, через модулирование отношений апоА-1 : апоА-П в случае ЛВП и апоЕ : апоС-Ш в случае триглицерид-богатых частиц. Особенно актуальна предположенная ассоциация апоЕ как белка с внутренне-неупорядоченной структурой с развитием ишемической болезни сердца (Cheng et al., 2006). Помимо этого, постулированная роль апоЕ в биогенезе и метаболизме ЛВП (Kypreos and Zannis, 2007) предполагает участие апобелка в сопряжении метаболизма триглицерид-богатых частиц и ЛВП. Связь физико-химических свойств липопротеинов, их апобелков и параметров отклика сети при различных метаболических состояниях является одной из основных проблем липопротеомики (Alonzi et al., 2008; Brown, 2007).
Цель исследования
Изучение роли структуры апобелков и липидной фазы в эффективности основных реакций транспорта липидов и метаболизма липопротеинов плазмы крови человека при
нормо- и гипертриглицеридемии и системное построение метаболических цепей.
Задачи исследования
-
Изучить структуру и стабильность апобелков в растворе и липид-ассоциированном состоянии и роль индивидуальных доменов и частично-свернутых структур в связывании и обмене апобелков между липопротеинами.
-
Изучить особенности организации и динамики липидной фазы и связь с субстратными и лигандными свойствами липопротеинов разных классов.
-
Изучить влияние апобелков через белок-белковые и апобелок-липидные взаимодействия на эффективности гидролиза триглицеридов, генерации эфиров холестерина и связывания с ЛНП-рецептором.
-
Разработать и использовать метаболом-подобный подход для визуализации структурно-детерминированных компартментов системы транспорта липидов.
-
Оценить связи между липид- и апоЕ-содержащими компартментами и роль апоЕ в сопряжении метаболизма триглицерид-богатых липопротеинов и липопротеинов высокой плотности при нормо- и гипертриглицеридемии.
Основные защищаемые положения
-
Разработан и использован метаболом-подобный подход для анализа системы транспорта липидов с параллельной детекцией распределения апоЕ и аналога церамида между липопротеинами.
-
Меньшая стабильность и специфическое междоменное взаимодействие в молекуле апоЕ4 приводят к накоплению апоЕ4 в ЛОНП.
-
Радиальная гетерогенность динамики дипальмитоилфосфатидилхолина в реконструированных дискоидальных ЛВП с апоА-I, имевшаяся в бинарных комплексах при температурах ниже температуры фазового перехода 7J, присутствовала в тройных комплексах с холестерином при температурах выше и ниже Ть В трех холестерин-содержащих комплексах степень исключения холестерина из пограничного липида вблизи апобелка возрастала в ряду апоА-1 < апоЕ < апоА-П.
-
Схожесть локализации и упаковки а-спиралей в С-доменах молекул апоА-1 и апоЕ приводит к схожей природе взаимодействий двух апобелков с фосфатидилхолином и в условиях дефицита апоА-1 в дискоидальных пре|3-ЛВП апоЕ может играть заместительную роль в генерации эфиров холестерина.
-
АпоЕ является лигандом при взаимодействии ЛОНП с ЛНП-рецептором и эффективность взаимодействия возрастает при кластеризации нескольких молекул апобелка на поверхности частиц.
-
Белок-белковые взаимодействия в частицах ЛОНП возрастают при гипертриглицеридемии и апоС-Ш модулирует апоЕ-опосредованное взаимодействие частиц с ЛНП-рецептором.
-
С увеличением содержания триглицеридов плазмы конкуренция ЛОНП и ЛНП за ЛНП-рецептор in vivo нарастает.
-
АпоС-П активировал, а апоС-Ш бесконкурентно ингибировал гидролиз триглицеридов липопротеинлипазой коровьего молока in vitro.
-
Активация печеночной липазы и ингибирование липопротеинлипазы, наиболее выраженные для апоЕ2, приводят к дефициту а-частиц ЛВП при гипертриглицеридемии.
-
Эффективность клиренса триглицеридов плазмы реципрокно контролируется апоЕ и апоС-Ш. Сниженный клиренс триглицеридов плазмы у пациентов с апоЕ4 по сравнению с апоЕЗ и апоЕ2 ассоциирован со сниженным клиренсом ЛНП.
Научная новизна
Обнаружены двухдоменная организация апоЕЗ, апоЕ2 и апоЕ4 и сниженная стабильность апоЕ4. Выяснена природа накопления апоЕ4 в частицах ЛОНП и учтен вклад распределения апобелка между липопротеинами разных классов в соотношения путей катаболизма ЛОНП и ЛНП при нормо- и гипертриглицеридемии, различающиеся для трех изоформ. Ассоциация апоЕ4 с ишемической болезнью сердца может объясняться наибольшей внутренней неустойчивостью молекулы апоЕ4. Охарактеризованы пути влияния С-апобелков на рецептор- и липолиз-зависимые пути катаболизма триглицерид-богатых частиц. Выявлена саморегуляция липолитической деградации ЛОНП через изменение содержания эффекторных апобелков. Описаны молекулярные механизмы увеличенного связывания ЛОНП с ЛНП-рецептором и сниженной эффективности их липолитической деградации при гипертриглицеридемии, лежащие в основе атерогенного действия триглицерид-богатых частиц. Выявлен вклад физического состояния липидной фазы в динамику молекулы апоВ в ЛНП. Предположен и использован алгоритм системного анализа метаболических связей между индивидуальными липид- и апоЕ-содержащими компартментами и выявлены изоформ-специфичные ассоциации. Изучены молекулярная архитектура, динамика липидной фазы, локализация и структура апобелка в реконструированных частицах ЛВП дискоидальной формы, содержащих индивидуальные апобелки апоА-I, апоЕ и апоА-П и предположен вклад структурно-динамической неоднородности фосфолипида в обратный транспорт холестерина с участием пре|3-ЛВП.
Теоретическое и практическое значение
Изученные механизмы вклада структуры липопротеинов и их апобелковых компонент
в регуляцию метаболизма липопротеинов определяют феноменологию
гипертриглицеридемии как независимого фактора риска сердечно-сосудистых заболеваний. Эти механизмы определяют основы будущей генной и пептидной терапии дислипидемий при индукции специфичной экспрессии генов ферментов и апобелков-регуляторов, при использовании рекомбинантных апоА-I и апоЕ, их фрагментов и комплексов апобелка с фосфолипидом для увеличения эффективности обратного транспорта холестерина и сопряжения метаболизма триглицерид-богатых частиц и ЛВП. Обнаруженная липидная гетерогенность дискоидальных ЛВП будет определять стратегию поиска модуляторов физического состояния липидной фазы пре|3-ЛВП для увеличения сорбции холестерина частицами. Разработанный на основе капиллярного изотахофореза и набора метаболических правил метаболом-подобный подход можно использовать для экспресс-диагностики и поиска молекулярных мишеней при функциональном и структурном нарушениях метаболизма липопротеинов. Обнаруженный фенотип-чувствительный ответ баланса изменения содержания триглицеридов плазмы и холестерина ЛВП определяет эффективность терапии статинами с позиций фармакогеномики. Пути коррекции таких конформационно-чувствительных патологических состояний, ассоциированных с апоЕ4, как болезнь Альцгеймера и атеросклероз, могут включать влияние на различные стабильность и распределение изоформ апоЕ между липопротеинами.
Апробация работы
Материалы работы представлены на 9 отечественных и 36 международных симпозиумах, в том числе на 5 и 6 симпозиумах по биохимии липидов (Алма-Ата, 1987; Санкт-Петербург, 1994); III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); 10 международном биофизическом когрессе (Ванкувер, 1990); Европейских конференциях по спектроскопии биологических молекул (Йорк, 1991; Лутраки, 1993; Сан-Лоренцо де Эль Эскориал, 1997; Твенте, 1999); конгрессах Европейского общества изучения атеросклероза (Ницца, 1992; Иерусалим, 1993; Зальцбург, 2002; Хельсинки, 2007; Стамбул, 2008); международных симпозиумах по атеросклерозу (Монреаль, 1994; Париж, 1997; Хельсинки, 2000; Киото, 2003; Рим, 2006; Бостон, 2009); международных симпозиумах по препаратам, влияющим на метаболизм липидов (Хьюстон, 1995; Флоренция, 1998; Нью-Йорк, 2001; Венеция, 2004; Нью-Йорк, 2007). Результаты работы обсуждены на межлабораторном семинаре отдела изучения биохимических маркеров 24 марта 2009 года.
Публикации
По включенным в диссертацию материалам опубликовано 46 статей в рецензируемых научных журналах и изданиях.
Структура и объем работы
