Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ 1. Обзор литературы 18
Глава 1. Транспорт гормонов первой группы в плазме крови человека 18
1.1. Липокалины 21
1.2. Транспортные белки крови, не относящиеся к липокалинам
Глава 2. Гормондепонирующая функция эритроцитов и транс порт гормонов второй группы. 35
Глава 3. Особенности транспорта инсулина в крови человека. 39
Глава 4. Применение аффинной хроматографии в медицине и биотехнологии 43
4.1 .Виды аффинной хроматографии 44
4.2. Носители для аффинной хроматографии и методы их активации
4.3. Использование поливинилового спирта в медицине и биотехнологии
4.4. Аналитические системы на основе аффинных сорбентов 56
ЧАСТЬ 2. Экспериментальная часть 61
Глава 5. Объекты исследований, реактивы и материалы 61
5.1. Принципы формирования групп добровольцев при изучении системы транспорта инсулина в норме и при сахарном диабете первого типа
5.2.0сновные реактивы для синтеза аффинных сорбентов 62
5.3. Реагенты белковой природы и иммунологические препараты
Глава 6. Методы исследований 63
6.1. Химические методы 63
6.1.1. Синтез аффинных сорбентов 63
6.1.2. Качественное определение альдегидных групп активированного глутаровым альдегидом ПВС-носителя
6.1.3. Определение оксирановых групп ПВС-носителя 65
6.1.4 Получение диазопроизводного овальбумина 66
6.2. Хроматографические методы 66
6.2.1. Иммуноаффинное извлечение антигенных примесей из препаратов человеческого лейкоцитарного интерферона
6.2.2. Выделение иммуноглобулинов (иммунных комплексов) из фракций связывающих инсулин белков 68
6.2.3. Выделение антител к овальбумину на иммобилизованном антигене 68
6.2.4. Аффинное определение гликозилированного гемоглобина 68
6.2.4.1. Приготовление гемолизатов 68
6.2.4.2. Хроматографическое выделение гликозилированного гемоглобина на сорбенте, содержащем дигидроксиборильные группы 69
6.2.5. Определение фракции HbAic гемоглобина методом высокоэффективной ионообменной хроматографии 71
6.2.6. Иммобилизация инсулина на активированной бромцианом матрице 71
6.2.7. Проведение хроматографического выделения связы- вающих инсулин белков сыворотки человека 72
6.2.8. Проведение гельхроматографии 73
6.3. Иммуноферментный анализ 74
6.4. Иммунолюминесцентное определение гормонов 76
6.5. Количественная оценка инсулинсвязывающей активности сыворотки крови 76
6.5.1. Формалинизация эритроцитов 77
6.5.2. Приготовление эритроцитарных диагностикумов 77
6.5.3. Определение концентрации связывающих инсулин белков крови в реакции пассивной гемагглютинации
6.5.4.Титрование антител к овальбумину в реакции пассивной гемагглютинации 78
6.5.5. Определение овальбумина в реакции торможения пассивной гемагглютинации
6.6. Анализ спектров поглощения проб в ультрафиолетовой области спектра 80
6.7. Проведение электрофореза
6.7.1. Метод проведения электрофореза белков на ацетатцел- люлозных пленках 80
6.8. Изоэлектрическое фокусирование с иммунопроявлением 81
6.8.1. Подготовка стеклянной подложки 81
6.8.2. Формирование геля 82
6.8.3. Проведение изоэлектрического фокусирования 83
6.8.4. Фиксация и окраска белков 83
6.9. Качественное выявление углеводного, белкового и липидного компонентов в связывающей инсулин фракции сыворотки крови 85
6.9.1 .Метод определения холестерина в пробе 85
6.9.2. Метод определения триглицеридов 86
6.9.3. Определение концентрации глюкозы ферментативным методом 86
6.10. Оценка иммуномодулирующих свойств компонентов сыворотки, связывающих инсулин 87
6.10.1 .Изучение влияния связывающих инсулин белков крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом на титры мышиных антител к дифтерийному анатоксину 88
6.10.2. Оценка модулирующего действия хондроитинсульфата на действие инсулина на перитонеальные мышиные макрофаги in vitro 90
6.11 .Определение коэффициента распределения инсулина между поверхностью эритроцитов и плазмой крови 93
6.12.Определение oil - кислого гликопротеина и трансферина методом нефелометрии 95
6. 13. Разработка методов синтеза аффинных сорбентов на основе гелей поливинилового спирта 96
6.13.1. Стабилизация гелей ПВС
6.13.1.1. Стабилизация гелей ПВС глутаровым альдегидом
6.13.1.2. Стабилизация гелей ПВС эпихлоргидрином
6.13.2. Синтез аффинных сорбентов на основе Поливиналя и их использование в условиях лаборатории
6.13.2.1. Оптимизация условий иммобилизации белковых лигандов на Поливинале110
6.13.2.2. Оптимизация условий проведения аффинной хрома- тографии 113
6.13.3. Испытания сорбентов на основе Поливиналя в условиях биотехнологического производства 117
6.14. Использование сорбента на основе Поливиналя с дигидроксиборильными группами для количественного определения гликозилированного гемоглобина в капиллярной крови человека 135
6.14.1. Синтез и лабораторные испытания сорбента для количественного определения гликогемоглобина 136
6.14.2 Оценка достоверности и воспроизводимости количественного определения гликозилированного гемоглобина на полученном сорбенте 139
6.14.3. Исследование природы фракции гемоглобина, взаимодействующей с сорбентом Поливиналь-м-АФБК 149
6.14.4. Клинические испытания аффинного сорбента для определения гликогемоглобина в крови человека 145
6.15. Статистическая обработка экспериментальных данных 152
ЧАСТЬ 3. Результаты и обсуждение 153
Глава 7. Соотношение вкладов эритроцитарной и сывороточной систем в транспорт инсулина и ряда гормонов первой и второй групп. 153
7.1. Распределения инсулина между поверхностью эритроцитов и плазмой крови. 154
7.2. Изучение распределения между поверхностью эритроцитов и плазмой крови гормонов первой и второй групп. 157
Глава 8. Выявление, аффинное выделение и анализ гетерогенности связывающих инсулин компонентов плазмы крови 164
8.1. Сравнение инсулинсвязывающей активности плазмы крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом первого типа 164
8.2. Хроматографическое выделение связывающих инсулин компонентов плазмы крови человека. 168
8.2.1. Изучение роли ионов цинка в формировании комплекса инсулина и транспортных белков. 169
8.3. Спектрофотометрическое изучение связывающих инсулин фракций сывороток здоровых доноров и больных сахарным диабетом 172
8.4. Электрофоретические спектры связывающих инсулин компонентов сыворотки крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом 179
Глава 9. Структурный анализ связывающих инсулин белков плазмы крови 188
9.1. Углеводный, белковый и липидный компоненты связывающей инсулин фракции сыворотки крови
9.1.1. Особенности структуры белковой области связываю- щих инсулин компонентов плазмы крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом 189
9.1.2. Углеводный компонент инсулинсвязывающих белков крови в норме и при сахарном диабете 190
9.1.3. Липидный компонент связывающего инсулин комплекса белков крови 192
9.2. Изучение модулирующего действия инсулинсвязывающих белков крови 193
9.2.1.Влияние связывающих инсулин белков крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом на титры мышиных антител к дифтерийному анатоксину
9.2.2. Влияние хондроэтинсульфата на эффект добавления инсулина в культуру мышиных перитонеальных макрофагов 196
Глава 10. Гормоны, входящие в состав связывающего инсулин комплекса 200
10.1. Содержание в составе связывающего инсулин комплекса гормонов первой группы 200
10.2. Гормоны второй группы, входящие в состав связывающего инсулин комплекса 201
Заключение 203
Основные выводы 230
Список литературы 232
Приложение 1 295
Приложение 2 302
Приложение 3 324
- Транспорт гормонов первой группы в плазме крови человека
- Синтез аффинных сорбентов
- Иммобилизация инсулина на активированной бромцианом матрице
- Метод проведения электрофореза белков на ацетатцел- люлозных пленках
Введение к работе
Актуальность темы. Несмотря на то, что инсулин был первым белком с доказанной гормональной активностью (Abel, 1926), механизм его транспорта в крови во многом остается неясным до настоящего времени. Из данных литературы следует, что в транспорте инсулина принимают участие два механизма.
В сыворотке крови инсулин транспортируется в составе двух фракций: "свободного" и "связанного" инсулина (Касаткина, 1996). Состав и свойства белков, формирующих фракцию связанного инсулина, изучены недостаточно. По мнению Н.К. Грачевой и соавторов (Грачева и др., 1972), "связанный инсулин" формируется за счет взаимодействия гормона с транс-ферином. Однако, ввиду использования авторами физико-химических методов выделения содержащих инсулин фракций, возникает сомнение в том, что выделены все из них. Не ясно также, находится ли свободный инсулин, действующий на мышцы и печень, в истинно свободном состоянии, или же он формирует лабильный комплекс с белками крови (Старосельцева и др., 1983, Марри и др., 1993, Касаткина, 1996, Покровский, 2007).
Второй механизм транспорта инсулина, по данным литературы, заключается в доставке гормона к периферическим тканям в комплексе со специфическими рецепторами плазматической мембраны эритроцитов. В работах ряда авторов показано, что эритроциты крови человека и животных участвуют в транспорте инсулина наряду с плазмой и формируют его депо, из которого инсулин поступает в плазму крови и ткани в ответ на повышение уровня глюкозы, молочной кислоты и под влиянием физико-химических факторов (Сандуляк, 1972; Доломатов, 1999; Картун и др., 2000; Запорожан и др., 2001).
Соотношение между двумя системами транспорта инсулина в норме и при сахарном диабете до настоящего времени не получило своей оценки.
В то же время, несмотря, на успехи в изучении этиологии сахарного диабета и создание новых препаративных форм инсулина, сахарный диабет продолжает занимать третье место среди причин смертности после сердечно-сосудистых заболеваний и рака (Покровский, 2007; Chan, 2007; Neumil-ler et. al, 2008), что говорит о необходимости углубления знаний о механизмах синтеза, транспорта и биологического действия инсулина, а также о процессах, лежащих в основе формирования сахарного диабета.
Доказано, что диабет первого типа имеет аутоиммунную природу. Разрушение продуцирующих инсулин Р-клеток осуществляют собственные лимфоциты организма (Atkinson, 1990; Bach, 1994; Нот et. al., 1998; Espe et. al., 2007; Stefan et. al., 2007). По данным литературы, иммунный ответ специфичен ко многим антигенам Р-клеток, в том числе к инсулину. Однако, механизм формирования аутоиммунного процесса, направленного к антигенам Р-клеток не выявлен.
Известно, что развитие иммунного ответа к антигенным детерминантам зависит от свойств носителя, распознаваемого лимфоцитами (Галактионов, 2004). Роль носителя при антигенном распознавании инсулина могут играть молекулы, транспортирующие его к клеткам-мишеням. Из этого вытекает важность идентификации и изучения свойств компонентов крови, принимающих участие в транспорте инсулина к периферическим тканям в норме и выявления изменений, происходящих в системе транспорта инсулина при формировании сахарного диабета.
Цель работы — изучение инсулин - транспортирующих систем крови человека в норме и при сахарном диабете первого типа с использованием аффинных методов. Задачи исследования: 1. Оценить соотношение вкладов эритроцитарной и сывороточной систем в транспорт инсулина в сопоставлении с аналогичными соотношениями ряда гидрофильных и гидрофобных гормонов.
Разработать новый носитель для аффинной хроматографии, отличающийся повышенной стабильностью по сравнению с традиционно используемыми полисахаридными носителями, оценить свойства полученных на его основе аффинных сорбентов в условиях лаборатории, биотехнологического производства и при использовании в аффинных диагностических системах для оценки состояния системы регуляции углеводного обмена обследуемых.
Разработать метод количественного определения связывающих инсулин белков сыворотки крови человека и провести сравнение их концентрации в норме и при сахарном диабете первого типа.
На основе предложенного носителя синтезировать аффинный сорбент с иммобилизованным инсулином. Определить роль ионов цинка и других двухвалентных катионов во взаимодействии инсулина и транспортных белков сыворотки крови.
Оценить гетерогенность инсулинсвязывающих белков и провести идентификацию в их составе известных транспортных белков крови методами электрофореза, гельхроматографии, иммунохимии и классической биохимии в норме и при сахарном диабете первого типа.
Количественно оценить содержание липидов и гормонов первой и второй групп в составе связывающего инсулин комплекса.
7. Изучить иммуномодулирующие свойства инсулин - связывающих бел
ков сыворотки крови здоровых донов и больных сахарным диабетом.
Научная новизна.
Впервые установлено, что особенность транспорта инсулина, по сравнению с транспортом других белковых гормонов, заключается в сопоставимом использовании сывороточного и эритроцитарного механизмов. При сахарном диабете происходит достоверное снижение вклада сывороточной системы в транспорт инсулина, соответственно, возрастает вклад эритроцитарного транспорта.
Впервые показано, что в плазме крови человека инсулин взаимодействует со сложным комплексом белков, формирующих при физиологических значениях рН ядро транспортирующего гормоны комплекса. Для включения инсулина в транспортный комплекс необходимо присутствие ионов цинка. Показано, что в крови здоровых доноров в состав связывающего инсулин комплекса входят белки с доказанной транспортной функцией: альбумин, а-фетопротеин и трансферин.
Установлено, что при сахарном диабете первого типа состав белков транспортного комплекса достоверно изменяется: альбумин и а-фетопротеин, входящие в ядро комплекса в норме, вытесняются из него белком острой фазы воспалительной реакции - ai-кислым гликопротеином.
Доказано, что транспортирующий гормоны комплекс плазмы крови человека является универсальным: наряду с инсулином, он содержит как гидрофобные (тироксин, трийодтиронин, тестостерон), так и гидрофильные гормоны (лютеинизирующий гормон, тиреотропный гормон, пролактин).
Показано, что гликопротеиды, формирующие комплекс с инсулином в крови здоровых доноров, обладают способностью снижать иммунный ответ при добавлении к антигенам при иммунизации.
Практическая значимость работы
Разработан и запатентован метод получения носителя для аффинной хроматографии на основе поливинилового спирта (Поливиналь). Новый носитель не уступает по плотности активных групп бромциан - Сефарозе 4В, являющейся своеобразным эталоном носителя для аффинной хроматографии. Он обладает лучшими, по сравнению с полисахаридными матрицами, колоночными свойствами и превосходит их по химической стабильности, устойчив к действию органических растворителей, детергентов, ферментов микроорганизмов, крайних значений рН, выдерживает кипячение, стерили-
зуется в ходе приготовления (Гарипова М.И., и др., // Способ получения носителя для иммобилизации аминосодержащих соединений. Авторское свидетельство № 1789532 22.09.1992).
Иммуноаффинный сорбент на основе предложенного носителя с иммобилизованной глобулиновой фракцией антисыворотки к антигенам ал-лантоисной жидкости испытан в условиях производства человеческого лейкоцитарного интерферона в Отделении интерферона Предприятия по производству бактерийных препаратов НИИЭМ им. Н,Ф. Гамалеи на стадии удаления антигенных примесей из полуфабрикатов интерферона. Использование нового носителя позволило увеличить производительность очистки интерферона в 5 и более раз, снизило риск загрязнения препаратов фрагментами иммобилизованных иммуноглобулинов и позволило проводить не менее 100 циклов иммуносорбции без перебивки колонки (Гарипова и др., 1993). По результатам производственных испытаний, принято Дополнение к регламенту «Лейкинферон для инъекций. Стадия ВР-5.4. Иммобилизация иммуноглобулинов» и получен Акт об использовании предложения. Сорбент для очистки лейкоцитарного интерферона человека, синтезированный на основе запатентованного носителя для аффинной хроматографии, с ноября 1991 года до настоящего времени используется на производстве инъекционного препарата лейкоцитарного интерферона в отделении интерферона Предприятия по производству бактерийных препаратов НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи согласно утвержденному производственному регламенту (Акт об использовании предложения от 23 января 1992 года).
С использованием сорбента с иммобилизованными дигидроксибо-рильными группами на основе нового носителя разработана и запатентована диагностическая система для количественного определения гликозилиро-ванной формы гемоглобина в капиллярной крови человека (Гарипова и др. Сшитый поливиниловый спирт с иммобилизованной м-аминофенилбороновой кислотой в качестве сорбента для аффинного определения гликозилированного гемоглобина. // Патент на изобретение №
20935525.2002). Диагностическая система разрешена к применению для диагностики сахарного диабета в лечебно-профилактических учреждениях Республики Башкортостан решением Научно-технического Совета Министерства Здравоохранения Республики Башкортостан от 28 июля 1992 года.
На основе нового носителя получен сорбент с иммобилизованным инсулином и впервые проведено аффинное выделение связывающих инсулин белков сыворотки крови (транспортирующего гормоны комплекса) здоровых доноров и больных сахарным диабетом первого типа. Выделенный аф-финно комплекс, транспортирующий гормоны, может быть использован в качестве корректирующего гормональные нарушения препарата, а также при разработке новых препаративных форм инсулина с повышенной эффективностью доставки гормона к периферическим тканям.
Разработан метод определения концентрации в крови человека специфичных к инсулину транспортных белков сыворотки крови. Метод может быть использован для диагностики нарушений транспорта инсулина в крови пациентов.
Метод определения коэффициента распределения инсулина между рецепторами эритроцитов и плазмой крови может быть использован для диагностики нарушений системы транспорта инсулина в крови человека.
Основные положения, выносимые на защиту
Особенность транспорта инсулина, по сравнению с транспортом в крови человека большинства других белковых гормонов, заключается в равноценном вкладе в доставку гормона к периферическим тканям двух транспортных систем: системы сывороточных транспортных белков и эритроцитарной системы транспорта.
При формировании сахарного диабета первого типа происходит снижение роли сывороточного и повышение роли эритроцитарного транспорта в доставку инсулина к периферическим тканям.
В плазме крови человека инсулин включается в общий для гидрофильных и гидрофобных гормонов транспортный комплекс, основу которого составляют транспортные белки крови.
В норме ядро транспортного комплекса формируют: альбумин, а- фе-топротеин, а.2-глобулины и р- глобулины (в том числе трансферин). Для включения инсулина в транспортный комплекс необходимо присутствие ионов цинка.
При сахарном диабете первого типа состав белков транспортного комплекса достоверно изменяется: из него исчезает альбумин и а-фетопротеин, снижается содержание 0 — глобулинов, появляется фракция щ- глобулинов, в том числе, oci-кислый гликопротеин.
Белки транспортирующего гормоны комплекса крови в норме обладают иммуносупрессирующими свойствами.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на 1 Всесоюзной конференции «Аффинная хроматография антител -теоретические и прикладные аспекты» (Москва, 1983), на 1 Всесоюзной конференции «Новые направления в биотехнологии» (Пущино, 1984), на 5 Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), на 5 конференции молодых ученых социалистических стран по биоорганической химии (Пущино, 1988), на 1 съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992), на 33- ем Международном съезде физиологов (Санкт- Петербург, 1997), на 3-ем съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1997), на Всероссийской конференции «Морфологические основы гистогенеза и регенерации тканей» (Санкт - Петербург, 2001), на конференции «Экологические, морфологические особенности и современные методы исследования живых систем» (Казань, 2003), на Всероссийской конференции с международным участием «Достижения биологической функ-ционологии и их место в практике образования» (Самара, 2003), на кон-
ференции «Проблемы экологии Южного Урала» (Оренбург, 2007), на конференции «Проблемы биоэкологи и пути их решения» (Саранск, 2008).
Публикации. Основные материалы диссертации обобщены в монографии и изложены в 48 печатных работах, в том числе 9 статьях в журналах, рекомендованных ВАК, а также защищены 2 патентами и 2 авторскими свидетельствами.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 354 страницах, содержит 20 рисунков, 24 таблицы и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 539 работ, приложения.
ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Транспорт гидрофобных гормонов в плазме крови
человека
Гормоны гидрофобной природы не накапливаются в эндокринных железах, а секретируются в кровь сразу после завершения биосинтеза, при транспортировке в крови они связываются со специфическими плазматическими белками - переносчиками (Балаболкин, 1989). Транспортные белки создают резерв гормонов в крови, поскольку в связанном виде последние не подвергаются метаболизму и экскреции. Биологическая активность присуща только несвязанному (свободному) гормону (Марри и др., 1993). Установлено, что от половины до двух третей тироксина и трийодтиронина присутствуют в организме вне щитовидной железы, причём большая часть их находится в крови в комплексе с двумя белками плазмы крови: тироксин - связывающим глобулином (ТСГ) и тироксин - связывающим преальбумином (ТСПА). ТСГ- типичный транспортный гликопротеид крови. Он представляет собой гликопротеид с молекулярной массой 50 тысяч Д и связывает тиреоидные гормоны со сродством, в 100 раз превышающим сродство ТСПА, и ёмкостью, равной 20 мкг на 100 мл плазмы. При нормальных условиях ТСГ нековалентно связывает почти весь тироксин и весь трийодтиро-нин, содержащиеся в плазме. Тироксин - связывающий глобулин, как большинство транспортирующих гормоны белков крови, образуется в печени. Снижение продукции ТСГ имеет место при терапевтическом введении анд-рогенов или глюкокортикоидов и при некоторых болезнях печени, эстрогены стимулируют его продукцию. Известны примеры наследственного увеличения или уменьшения уровня ТСГ. Во всех случаях регистрируются сдвиги общего содержания тиреоидных гормонов, тогда как величина их свободной фракции не меняется.
Тироксин - связывающий преальбумин - это тетрамерный белок, состоящий из четырех идентичных субъединиц с молекулярным весом 55000,
обладающий широкой специфичностью: наряду с тироксином ТСПА связывает стероидные гормоны и множество синтетических молекул. В крови ТСПА комплексируется с ретинол - связывающим белком, относящимся к классу липокалинов, за счет чего происходит сопряжение двух транспортных систем — системы транспорта ретинола и тиреоидных гормонов (Wang et. al., 1997, Картун и др., 2000).
В плазме большинства млекопитающих, в том числе и человека, имеется Р - глобулин, специфически связывающий тестостерон с относительно высоким сродством и ограниченной ёмкостью. Этот гликопротеид носит название секс — гормон - связывающий глобулин (СГСГ) или тестостерон - эстроген - связывающий глобулин (ТЭСГ) и образуется в печени (Hulsmeier et. al., 2007). Он термолабилен, имеет молекулярную массу 290 000 дальтон и изоэлектрическую точку 6,02-6,04. Образование этого гликопротеида стимулируется эстрогенами (у женщин концентрация СГСГ в сыворотке вдвое выше, чем у мужчин), при определённых болезнях печени и при гипертире-озе; под влиянием андрогенов, с возрастом и при гипотиреозе образование данного белка уменьшается. Многие из этих факторов влияют также, на синтез кортикостероид - связывающего глобулина Поскольку СГСГ и альбумин связывают до 97-99% циркулирующего в крови тестостерона, лишь небольшая его часть находится в крови в свободной (биологически активной) форме. Основная функция СГСГ состоит, вероятно, как и в случае других связывающих гормоны гликопротеидов крови, в том, чтобы ограничивать концентрацию свободного гормона в сыворотке и создавать его депо. Тестостерон связывается с СГСГ с большим сродством, чем эстрадиол, поэтому при изменении концентрации СГСГ содержание свободного тестостерона меняется в большей степени, чем свободного эстрадиола. Увеличение концентрации СГСГ способствует росту соотношения связанный/свободный: тестостерон. Этот феномен имеет место при старении, циррозе печени и гипер-тиреозе (Kengni et. al., 2007).
Эстрогены и прогестины, подобно другим стероидам, связываются в различной степени с транспортными белками плазмы. Эстрогены связываются с СГСГ, а прогестины - с транскортином. Сродство СГСГ к эстра-диолу в пять раз ниже, чем к тестостерону; прогестерон и кортизол имеют очень низкое сродство к данному белку. В отличие от этого прогестерон и кортизол почти с равным сродством связываются с транскортином, который в свою очередь характеризуется низким сродством к эстрадиолу и еще более низким к тестостерону и эстрону (Картун и др., 2000).
Гормоны коры надпочечников - глюкокортикоиды, подобно другим гормонам первой группы, в плазме крови взаимодействуют с транспортными белками. Основной связывающий глюкокортикоиды белок плазмы - это а- глобулин, называемый транскортином (кортикостероид-связывающий белок) (Балаболкин, 1989). Транскортин образуется в печени, его синтез стимулируется эстрогегенами. Степень прочности связывания с транскортином определяет длительность периода полувыведения различных глюкокорти-коидов из организма. Так, кортизол прочно связывается с транскортином и его время полувыведения составляет 1,5—2 ч, тогда как кортикостерон, связывающийся слабее, имеет время полувыведения менее 1 ч. Транскортин связывает не только глюкокортикоиды. Дезоксикортикостерон и прогестерон взаимодействуют с этим белком с высоким сродством, достаточным для того, чтобы конкурировать с кортизолом (Балаболкин, 1989)..
Альдостерон - самый активный из природных минералокортикоидов, не имеет специфического транспортного белка в плазме, но образует слабые связи с альбумином. Кортикостерон и 11 -дезоксикортикостерон - стероиды, обладающие минералокортикоидным действием, связываются с транскортином. Гормоны мозгового слоя надпочечников (адреналин и норадрена-лин) циркулируют в плазме в слабоассоциированном с альбумином виде. Период их полувыведения из сыворотки крови составляет 10-30 секунд (Марри и др., 1993) .
Гормон, связанный с белками, находится в постоянном равновесии со свободной биологически активной формой гормона. По мере снижения уровня свободного гормона, он освобождается из связанной с белками формы, за счет чего поддерживается постоянная концентрация свободной фракции гормона в периферической крови. Кроме того, транспортные белки влияют на скорость клиренса гормона, который осуществляется в печени и почках (Балаболкин, 1989).
1.1. Липокалины
В настоящее время многие известные транспортные гликопротеиды сыворотки крови на основании сходства первичной и третичной структуры и функций объединяются в одно семейство - липокалины (Pervais et. al., 1985; Bourguignon et. al., 1985, Reisinger et. al., 1985, Flower et al., 1996). Pervais и Brew (1985) предложили общее для этого семейства название липо-- калины (от греческого «lipos» - жир, и «calyx» - чаша). Допустимо также использование названия - семейство 0С2и-глобулинов, по одному из первых открытых членов этого семейства (Reisinger et. al., 1985).
Семейство липокалинов - большая группа внеклеточных белков, характеризующихся рядом отличительных свойств: способностью связывать мелкие, преимущественно гидрофобные молекулы (подобные ретинолу), взаимодействовать с клеточными рецепторами и формировать макромоле-кулярные комплексы с другими белками крови (Wilting et.al., 1988; Kaikaus et. al., 1993; Glatz et. al., 1995; Londraville et. al., 1997). Липокалины характеризуются разнообразием в структурном и функциональном отношении. Хотя ранее их определяли прежде всего как транспортные белки, в настоящее время стало очевидно, что члены семейства липокалинов выполняют множество различных функций. Они участвуют в транспорте ретинола, в осуществлении функции обоняния, в транспорте феромонов насекомых, в
Таблица 1
Основные члены семейства липокалинов (Flower, 1996)
синтезе простагландинов (Spener et. ql., 1991; Borchers et. al., 1991; Nielsen et. al., 1993; Yang et. al., 1994; Huynh et. al., 1995; Gerhard et. al., 2004). Липо-калины также вовлечены в регуляцию иммунного ответа и клеточного го-меостаза (Sweetser et. al., 1987, Carroll et. al., 1990, Tanaka et.al., 1991, Wolf-rum et. al., 2001, Schroeder et. al., 2001, Cheon et. al., 2004, Hashimoto et. al., 2005).
Несмотря на общие функции, семейство липокалинов было выделено в значительной степени на основе сходства аминокислотных последовательностей (Borchers et. al., 1997; Murphy, 1998; Wolfrum et. al., 2000; Flower et al., 1996; Jones et. al., 2007; Smith et. al., 2007; Eichinger et. al., 2007).
Некоторые представители семейства липокалинов приведены в таблице 1.
Липокалины выявлены у представителей практически всех групп организмов (Wilting et.al., 1988, Kaikaus et. al., 1993). Описано десять различных липокалинов человека: ретинол-связывающий белок (РСБ) (Stephanou et. al., 1994; Zanotti, 2004), аполипопротеин D (АЛЛ - D) (Rassart et al., 2000), липокалин нейтрофилов (Goetz et al.2002), компонент системы комплемента C8y (Peitsch et. al., 1991; Ortlund et al.,2002), осі-микроглобулин (осі - МГ) (Akerstrom et я/,2000), слезный липокалин (Redl 2000), простаглан-дин-Н2-0-изомераза (Boguski et. al., 1991, Urade, 2000, Shimamoto et. al., 2007), одорат-связыающий белок (Briand et ah,2002), otr кислый гликопро-теин и гликоделин (Fournier et al., 2000, Gasymov et. al., 2007)
В пределах семейства липокалины демонстрируют необычно низкие уровни гомологии аминокислотных последовательностей. Однако, все липокалины имеют достаточное сходство в форме короткой консервативной последовательности (Mendez et. al., 1986, Nagata et. al., 1992). Именно наличие этой последовательности позволяет отнести данный сывороточный белок к семейству липокалинов (Reisinger et. al., 1985, Salier et. al., 1992, Flower et al., 1993, Kock et. al., 1994, Morel et. al., 1993, Flower et al., 1996,
Wang et. al., 1997, Strausberg et. al., 2003, Strausberg et. al., 2003, Lovelace et. al., 2008).
Семейство липокалины состоит из двух подсемейств: подсемейства типичные липокалины и меньшего подсемейства нетипичные липокалины (Flower et al., 1993).
Типичные липокалины имеют три консервативные последовательности аминокислот, которые соответствуют трем, главным структурно консервативным областям липокалинов (Kaumeyer et. al., 1986, Traboni et. al., 1986, Offiier et. al., 1988, Zaraiskii et. AL, 1990, Troxler et. al., 1994, Bartsch et al., 1995, et. AL, 1995, Zimmerman et. AL, 2001).
Рисунок 1. Предполагаемая третичная структура типичных липкали-нов (Cowan, et al., 1990).
Первый из этих трех характерных участков имеют все липокалины и он может использоваться как диагностический для определения принадлежности к семейству (Kaumeyer et. al., 1986). Нетипичные липокалины имеют один или два из этих трех участков и более разнообразны в структурном отношении.
К типичным липокалинам относятся: ретинол-связывающий белок (Cowan, et al., 1990), р-лактоглобулин (Р-ЛГ) (Brownlow et al., 1997), ин-секцианин (Holden et al., 1987), билин-связывающий белок (Huber et al., 1987), а2и-глобулин (Bocskei et al., 1992), и липокалин нейтрофилов (Coles et al., 1999). К нетипичным, пограничным липокалинам, относят одорат-связывающий белок (Tegoni et al., 1996), Bos d2 allergen, нитрофорин (Andersen et al., 1998), агкислый гликопротеин и гистамин - связывающий белок клеща Rhipicephalus appendiculatus (Paesen et al., 1999).
Несмотря на низкую гомологию аминокислотных последовательностей, третичная структура липокалинов высоко консервативна. Характер этой общей структуры хорошо описан (Chan et. al., 1985; Lowe et. al., 1985; Cowan et al., 1990; Keen et. al., 1991; Flower et al., 1993; Newcomer, 1993; Zhao et. al., 2004) и представлен на рисунке 1. Примером структуры типичного липокалина является структура ретинол-связывающего белка человека, специфически связывающего витамин А, имеющая восемь поворотов р-складчатой структуры (Cowan, et al., 1990).
Вторичная и третичная структура липокалинов характеризуется наличием восьми участков, соединённых друг с другом в антипараллельную Р~ складчатую структуру, стабилизированную водородными связями, которая свёрнута в симметричный цилиндрический «бочкообразный» домен. В пространстве этот домен может иметь расплющенную или эллиптическую форму. Внутри такой «бочки» находится лиганд-связывающий сайт (Zanotti et. al., 1992, Flower et al., 1995; Wang et. al., 1998, Chen et. al., 1998, Chaudhuri et. al., 2000, Strausberg et.al., 2003, Gerhard et. al., 2004, Gasymov et. al., 2007,
Orazine et. al., 2008). Благодаря жёсткости структуры, липокалины относительно легко кристаллизуются (Peeters et. al., 1991).
1.1.1. Связывание лиганда липокалинами
Широко известна способность липокалинов связывать небольшие гидрофобные лиганды. Способность к связыванию обеспечивается особенностями структуры глобулы липокалинов: в пределах Р-слоя они имеют большую чашеобразную впадину, имеющую петлю при входе, благодаря которым липокалины способны к связыванию лиганда (Godovac-Zimmermann, 1988; Wang et.al., 1998; Skerra et al., 2007). Аминокислотный состав кармана и петли, так же как его общий размер и конформация, определяют селективность связывания лиганда (Borghoft et al., 1990, Young et. al., 1994, Strausberg et. al., 2003). Структура связывающих участков липокалинов определяется их специфичностью по отношению к лиганду, и, поэтому сильно различается у отдельных представителей семейства. Так, а2и -глобулин мочи связывает свой маленький лиганд в глубине кармана, полностью закрывающего лиганд цепями со всех сторон. Билин-связывающий белок связывает свой большой и относительно гидрофильньный лиганд в участке, сформированном петлей (Huber et al., 1987). Эндогенные и экзогенные лиганды, связываемые членами семейства липокалинов, - молекулы с важными биологическими функциями: ретиноиды, арахидоновая кислота, различные стероиды. Связывание таких веществ имеет функциональное значение для некоторых из липокалинов, однако, следует отличать специфическое и неспецифическое взаимодействия липокалинов с лигандами. Связывание ретинола, доказанное для Р-лактоглобулина, например, вероятнее всего, отражает его общую аффинность к ряду различных небольших гидрофобных молекул и не является специфичным и необходимым для осуще-
ствления транспорта ретинола, так как ретинол в молоке транспортируется в составе капель жира (Flower et al., 1993).
Таким образом, способность некоторых липокалинов, подобных р~ лактоглобулину и орозомукоиду, к связываншо ретинола может отражать общую транспортную функцию этих липокалинов, обеспечивающую клиренс нежелательных эндогенных, или экзогенных, соединений (Wang et. al.,
1997, Kobayashi et. al., 2004, Ahn et. al., 2005). Связывание некоторых моле
кул может не иметь физиологического значения, и даже вести к патологи
ческим состояниям. Например, воздействие многими важными промышлен
ными и экологическими ядохимикатами, такими как компоненты неэтили
рованного бензина, может служить причиной токсического синдрома, из
вестного как нефропатия а2и-глобулина (Senoo et al., 1990, Wu et. al., 2008).
1.1.2. Взаимодействие липокалинов со специфическими мембранными рецепторами
Имеются многочисленные экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что липокалины связывается со специфическими мембранными рецепторами и могут поглощаться опосредованным рецепторами эндоцитозом. Показано, что, в паренхимных и звёздчатых клетках печени комплекс ретинол-связывающего белка с ретинолом поглощается по механизму рецептор - опосредованного эндоцитоза (Malaba et al., 1995). Экспериментально доказано, что кислый ссргликопротеин поглощается эндоцитозом через клатрин-окаймленные ямки. Специфические клеточные рецепторы к комплексу ретинол-связывающего белка с ретинолом выявлены в большом числе различных тканей (Fernandez-Luna et al., 1988, Kreutz et.al.,
1998, Despouy et.al., 2003, Budhu et. al., 2002, Lee et. al., 2007). Мембранный
рецептор для (Xi-микроглобулина также обнаружен (Hambling et al., 1992,
Gasymov et. al., 2008). Имеются данные, свидетельствующие о существова-
ний рецепторов к (3-лактоглобулину (Sivaprasadarao et al., 1993) и многих других липокалинов (Bocskei et al., 1992; Bonventre , 2008). Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что в связывании с рецепторами принимают участие консервативные аминокислотные последовательности липокалинов, находящиеся в области р-петли (Goodman , 1984; Morii et.al., 1985; Schreitmiiller et. al., 1987).
Биологическое значение существования специфических рецепторов к липокалинам, очевидно, заключается в формировании дополнительного механизма проникновения гидрофобных лигандов в клетку.
Описано также существование специфических клеточных рецепторов к транспортным белкам крови, не относящимся к классу липокалинов, например, церулоплазмину и транскортину, взаимодействующим с клеточными рецепторами, вероятно, за счет гетерополисахаридной области их молекул (Hook et. al., 1984).
1.1.2. Образование макромолекулярных комплексов с участием
липокалинов
Показано, что липокалины способны формировать комплексы с другими белками крови (Flower et al., 1995, Folkesson et. al., 2007, Cederfur et. al., 2008). Например, в плазме крови ретинол-связывающий белок встречается обычно в комплексе с другим белком, известным как тироксин-связывающий преальбу-мин или транстиретин (ТСПА). Это тетрамерный белок, состоящий из четырех идентичных субъединиц, с молекулярным весом 55000, связывающий тироксин, стероидные гормоны, и множество синтетических молекул. Ретинол-связывающий белок связывает ТСПА с константой диссоциации 1*10 М. Приблизительно 4% его общего количества в плазме свободны, остальной ретинол-связывающий белок является частью комплекса с транстиретином (Goodman et al., 1984, Tajtakova et. al., 2007). Транстиретин имеет более высокое
сродство к комплексу ретинол-связывающего белка с ретинолом, по сравнению со свободным белком. Взаимодействие чувствительно к ионной силе и рН: комплекс диссоциирует при низкой ионной силе и устойчив только между рН 5.0 и 9.0.
Описаны также другие примеры комплексообразования белков крови с участием липокалинов. Приблизительно 80 % всего плазматического аполипо-протеина D существуют в виде комплексов с аполипопротеином АН и липо-протеином В-100, образованных за счет дисульфидных связей (Blanco-Vaca et al., 1992). Показано, что человеческий липокалин нейтрофилов ковалентно связывается с желатиназой нейтрофилов через межмолекулярные дисульфидные связи (Treibel et al., 1992). Липокалин С8у - один из трех элементов С8 - предпоследнего компонента комплекса, атакующего мембрану, системы комплемента ковалентно связан с С8а межмолекулярной дисульфидной связью (Haefiiger et al, 1991). Половина сії - микроглобулина плазмы крови человека существует в свободной форме, остальная часть - в эквимолярном ковалентном комплексе с другими макромолекулами - альбумином (Tejler et al., 1976) и иммуноглобулином A (Grubb et al., 1986). Компоненты комплекса а і - микроглобулин -IgA связаны ковалентно между ai - микроглобулином и девятым аминокислотным остатком С-конца тяжелой цепи IgA (Hansch et al., 1988). Гетерогенность заряда свободного осі - микроглобулина обусловлена хромофором, придающим ему характерную желто-коричневую флуоресценцию (Akerstrom et al., 1990). Предполагается, что в молекуле имеется несколько хромофорных групп (Akerstrom et al., 1995), одна из которых ковалентно присоединена к цистеину 34. Комплекс ос і - микроглобулина с иммуноглобулином проявляет и активность антител и многие из биологических свойств свободного белка. Вероятно, что а,] — микроглобулин и другие липокалины осуществляют регуляцию активности белков плазмы крови, формируя с ними комплексы.
1.1.4. Некоторые представители семейства липокалинов 1.1.4.1. Ретинол - связывающие белки
Множество липокалинов связывают ретиноиды. Один из них - етинол-связывающий белок (РСБ), фактически единственный переносчик ретинола в плазме крови, был впервые выделен Kanai и соавторами в 1968. Человеческий РСБ - мономерный растворимый белок с молекулярной массой приблизительно 21000 Д. Его молекула не содержит углеводов и имеет три внутримолекулярные дисульфидные связи (Cowan et al. 1990, Gerhard et.al., 2004, Shea et.al., 2007, Bagshaw et. al., 2007, Kovacs et. al., 2007, Sell et. al., 2007, Petrakis et.al., 2008). РСБ имеет общий связывающий сайт для всех форм ретинола - его физиологического лиганда, который он связывает с высокой аффиностыо и специфичностью. РСБ присутствует в значительных количествах в печени, почках и сыворотке крови (Liu et. al., 1997, Flagiello et.al., 1997, Cabre et. al., 2007, Yu et. al, 2007, Sasaki et. al., 2007, Promintzer et. al. 2007). Этот липокалин присутствует в других тканях, таких как мышцы, мозг, кишечник и селезенка в намного более низких количествах (Bachorzewska-Gajewska et., al., 2007, Lee et. al., 2007). Описана взаимосвязь отклонений от нормы в концентрации ретинол-связывающего белка и развития различных патологических состояний: сосудистой патологии, нефропа-тии, сахарного диабета, рака (Phelan et. al., 1996, Huang et. al., 2003, Blaese et. al., 2004, Won et. al., 2004, Pfoertner et. al., 2005, Ziegelmeier et. al., 2007, Qi et al., 2007, Hirsch et. al., 2007, Stefan et. al., 2007, Kristensen et. al., 2007, Woo et. al., 2007, Schwartz et. al., 2007, White et. al., 2007, Aeberli et. Al., 2007, Hahn et. al., 2007, Lind et. al., 2007, Tanaka et. Al., 2007).
1.1.4.2. Микроглобулин ОСі
Анализ последовательности человеческого ai -микроглобулина свидетельствует о том, что этот белок - член семейства липокалинов (Pervaiz et al, 1985, Gebhard et. al., 1990, Vetr et. al., 1991, Espe et. al., 2007). Микроглобулин cti, также известный как белок гетерогенного заряда, является низкомолекулярным белковым компонентом плазмы, был открыт в патологической человеческой моче (Ekstrom et. al., 1977, Akerstrom et al., 1981). Несмотря на то, что в настоящее время достаточно известно о его структуре и свойствах, физиологическая роль а і - микроглобулина остается неясной, предполагается, что он участвует в регуляции иммунологических реакций (Akerstrom et al., 1981, Escribano et. al., 1991, Akerstrom et. al., 2007). Микро-глобулин- осі существует в плазме крови и в свободной форме и в комплексе с другим макромолекулами, например с иммуноглобулином класса A (IgA).
Свободный осі -микроглобулин человека- это мономерный белок, состоящий из 188 аминокислотных остатков, содержит три цистеина, два из-которых (остатки 75 и 173) формируют дисульфиднуїо связь (Akerstrom et al., 1981, Falkenberg et. al., 1990, Diarra-Mehrpour et. al., 1990). Микроглобулин -осі гликозилирован тремя отдельными углеводными цепями. Эти поли-сахаридные цепи составляют 3 %, 12 %, и 7 % соответственно полной молекулярной массы a,i -микроглобулина (Enghild et. al., 1881). Свободный а і -микроглобулин чрезвычайно гетерогенен и сильно связан с хромофором, обуславливающим его характерную желто-коричневую флюоресценцию в растворе (Akerstrom et al., 1981, Gasymov et. al., 2007). Микроглобулин-oti связывает ретинол как важный (но не единственный) лиганд. Этот белок выявлен у многих видов, включая человека, крысу, свинью, кролика, мышь, цыпленка и низших приматов. Белки разных видов высоко гомологичны, хотя их гликозилирование различно у разных видов. Основные места синтеза а і -микроглобулина - печень и почки. Белок транслируется с единой мат-
ричной РНК вместе с белком, названным гликопротеином Ш-30. Предшественник разрезается в зрелый oti -микроглобулин и гликопротеин HI-30. Функциональное значение этой коэкспрессии не известно. Микроглобулин-oti проявляет иммуносупрессивное действие (Akerstrom et al., 1981, Nazimova et. Al., 1990). Он подавляет стимуляцию культуры лимфоцитов белковыми антигенами и подавляет миграцию нейтрофилов in vitro. В то же время, осі -микроглобулин может проявлять митогенный эффект на лимфоциты.
1.1.4.3. Кислый гликопротеин аі
Кислый гликопротеин ai (АГП), или орозомукоид, состоит из 183 аминокислотных остатков, имеет молекулярный вес 40000. Его молекула имеет две дисульфидные связи (Ong, 1987; Arnaud et al., 1988; Astrom et. al, 1991; Astrom et. al., 1993; Thompson et. al., 1995; Eller et. al., 1992). Он имеет необычно высокое содержание углеводов- 45% и обладает очень высоким отрицательным зарядом. АГП относится к основным белкам острой фазы, концентрация которых резко возрастает при различных воздействиях на организм (Foumier et al., 2000, Wells et.al., 2008). Большая часть АГП синтезируется в печени, а остальная часть - в других органах, в том числе в очагах опухолевого роста. Индукторами синтеза АГП являются липополи-сахарид грамотрицательных бактерий, некоторые цитокины (интерлейкин -lb, фактор некроза опухолей, интерлейкин-6 и глюкокортикоиды) (Lacki et al., 1995; Afolabi et. al., 2007).
Другие цитокины (интерлейкин-la, интерлейкин-4, интерлейкин-10), наоборот, ингибируют синтез этого белка. Примечательно, что при воспалительных процессах синтезируется АГП, имеющий двухразветвленные углеводные цепи (Foumier et al., 2000; Новикова и др., 1991). Эта форма АГП (АГП-С) сильно связывается конканавалином A (Mackiewicz et al., 1995).
Биологические функции АГП очень многообразны и до конца не изучены. Показано его участие в регуляции иммунологических реакций, защите от бактериальных инфекций, стабилизации повышенной проницаемости капиллярного русла, ингибировании апоптоза клеток и многих других биологических процессах (Fournier et al., 2000; Jankovic et. al., 2008).
В последнее время все более важное значение придают транспортным свойствам АГП. Наряду с ретинол-связывающим белком и а і -микроглобулином аі-кисльш гликопротеин относят к семейству липокали-нов (Foumier et al., 2000). Все известные липокалины, обеспечивая транспорт и связывание с мембранными рецепторами различных веществ-биорегуляторов, играют значительную роль в регуляции процессов клеточного роста и метаболизма. В плазме крови АГП выступает основным переносчиком положительно заряженных лекарственных веществ (хлорпромази-на, пропранолола, лидокаина, верапамила, тамоксифена), кроме того, этот белок связывает стероиды (прогестерон, андростандион, кортизол), анионные лиганды (варфарин, фенобарбитал, ретинол), а также серотонин, мела-тонин, гистамин и фактор активации тромбоцитов (Kremer et al., 1988), Значительное увеличение уровня ai -кислого гликопротеина наблюдается при множестве состояний, таких как воспалительные заболевания, острый инфаркт миокарда, травмы, беременность, хирургические вмешательства (La-cki et al., 1995).
1.2. Транспортные белки крови, не относящиеся к липокалинам
Несомненно, превосходящим количественно все остальные транспортные белки плазмы крови является альбумин, составляющий от 52 до 68% всех белков плазмы. Альбумин синтезируется в печени и его единственная негликозилированная полипептидная цепь состоит из 610 аминокислот. Альбумин транспортирует билирубин, жирные кислоты, многие лекарственные соединения (Akker et.al., 2007, Bunt et. al., 2007). Четыре лиганд-
связывающих участка, имеющие форму карманов, являются высокоспецифическими и насыщаемыми, другие же, обладают этими свойствами в меньшей степени (Kaneko et. al., 2008, Pasman et.al., et. al., 2008).
К транспортным гликопротеидам сыворотки, структурно не относящимся к липокалинам, принадлежат церулоплазмин, связывающий ионы меди (содержание в плазме крови составляет от 25 до 43мг%), трансферин, переносящий ионы железа (содержание в плазме крови - 44,7- 73,4 мкмоль/л), гаптоглобин. Эти гликопротеиды мигрируют при электрофорезе во фракциях а - и (3- глобулинов (Yasukawa et. al., 2006, Kita et. al., 2007, Hulsmeier et. al., 2007).
Фетотопротеин а (АФП) - транспортный гликопротеид крови, содержащий до 4% углеводов с молекулярной массой 70000 Д (Krusius et. al., 1982; Nakabayashi et. al., 1985; Sakai et. al., 1985; Godbout et. al., 1988; Morinaga et. al, 1991; Zhang et. al., 1991). По составу аминокислот и их последовательности а-фетопротеин сходен с альбумином (Radanyi et.al., 1977, Innis et. al., 1980, Krumlauf et. al., 1985, Breborowicz et. al., 1985, Tratner et. al, 1987, Nahon et. al, 1988, Spear et. al., 1990, Pare et. al., 2001). На молекуле АФП идентифицировано от 3 до 7 различных эпитопов (Belayew et. al,m 1982, Buamah et. al., 1986, Yamamoto et. al., 2001). Подобно альбумину и липокалинам, а-фетопротеин способен связывать жирные кислоты и другие гидрофобные молекулы (Parmelee et. al., 1978, Hirohashi et. al., 1979, Savu et. al., 1981). При электрофорезе он мигрирует в зоне а-глобулинов (Alpert et. al., 1972) и обладает высокой эстроген-связывающей способностью (Kirkpatrick et. al., 1977). При беременности фетопротеин вырабатывается клетками желточного мешка, позднее - печенью эмбриона (Peyrol et. al., 1977, Andrews et. al. 1982, Tyner et. al., 1990), а также клетками желудочно-кишечного тракта плода (Gitlin et. al., 1972, Toftager-Larsen et. al., 1980). В настоящее время постулированы следующие основные функции а-фетопротеина: 1) поддержание онкотического давления крови плода (Mize-
jewski et. al., 2007); 2) предохранение плода от иммунной системы матери и иммуномосупрессия (Lester et. al., 1976, Sheppard et. al., 1977, Sell et. al., 1977, Lu et. al., 1984, Fleischer et.al., 1988, Pinheiro et. al., 1992, Mizejewski, 2004, Cavin et. al., 2004, Smith et.al., 2006); 3) связывание эстрогенов, содержащихся в материнском кровотоке (Melbye et. al., 2000; 4) участие в органогенезе печени (Eleftheriou et. al;.,1977, Sato et. al., 1993, Lin et. al., 1995, Da-beva et. al., 1998); 5) влияние на становление половой и эндокринной системы в онтогенезе (Musa et. al., 1989, Mizejewski et. al., 1992, Khamzina et. al., 1998, Lam et. al., 1999, Mees et. al.2006). Нормальные значения АФП в сыворотке крови здорового человека (у мужчин и небеременных женщин) не превышают 15 нг/мл (Stone et. al.1979, Forest et.al., 1993, Schefer et. al., 1998, Hosokawa et. al., 1989, Fournier et al., 2000, Coakley et. al., 2005). АФП является онкофетальным маркером (Beilby et. al., 1979; Koen et. al., 1983; Nakajima et. al., 1985; Urbach et. al., 1987; Scoazec et. al., 1989; Waller et. al., 1991; Satomura et. al., 2002; Kitao et. al., 2006; Vij et. al., 2008). Умеренно повышенный уровень АФП имеет место при циррозе печени и у 70% пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой (Kroes et. al., 1972; Young et. al., 1984; Ng et. al. 1995; Lin et. al., 1995; Phillips et. al., 1996; Richardson et. al, 1998; Poon et. al., 2002; Gupta et. al., 2003; Ayaru et. al., 2007). Уровень АФП повышается у 60-70% мужчин с опухолями яичек, особенно при наличии метастазов (Mclntire et. al., 1975, Camper et. al., 1989, Kasuga et. al., 1998, Mizejewski et. al., 2003, Liang et. al., 2004). Очевидно, что а -фетотопротеин в функциональном отношении близок к транспортным гликопротеидам крови (Lester et.al., 1977; Uriel et. al., 1987; Fujii et. Al., 2003; Mizejewski et. al., 2003).
Транспорт гормонов первой группы в плазме крови человека
Гормоны гидрофобной природы не накапливаются в эндокринных железах, а секретируются в кровь сразу после завершения биосинтеза, при транспортировке в крови они связываются со специфическими плазматическими белками - переносчиками (Балаболкин, 1989). Транспортные белки создают резерв гормонов в крови, поскольку в связанном виде последние не подвергаются метаболизму и экскреции. Биологическая активность присуща только несвязанному (свободному) гормону (Марри и др., 1993). Установлено, что от половины до двух третей тироксина и трийодтиронина присутствуют в организме вне щитовидной железы, причём большая часть их находится в крови в комплексе с двумя белками плазмы крови: тироксин - связывающим глобулином (ТСГ) и тироксин - связывающим преальбумином (ТСПА). ТСГ- типичный транспортный гликопротеид крови. Он представляет собой гликопротеид с молекулярной массой 50 тысяч Д и связывает тиреоидные гормоны со сродством, в 100 раз превышающим сродство ТСПА, и ёмкостью, равной 20 мкг на 100 мл плазмы. При нормальных условиях ТСГ нековалентно связывает почти весь тироксин и весь трийодтиро-нин, содержащиеся в плазме. Тироксин - связывающий глобулин, как большинство транспортирующих гормоны белков крови, образуется в печени. Снижение продукции ТСГ имеет место при терапевтическом введении анд-рогенов или глюкокортикоидов и при некоторых болезнях печени, эстрогены стимулируют его продукцию. Известны примеры наследственного увеличения или уменьшения уровня ТСГ. Во всех случаях регистрируются сдвиги общего содержания тиреоидных гормонов, тогда как величина их свободной фракции не меняется.
Тироксин - связывающий преальбумин - это тетрамерный белок, состоящий из четырех идентичных субъединиц с молекулярным весом 55000, обладающий широкой специфичностью: наряду с тироксином ТСПА связывает стероидные гормоны и множество синтетических молекул. В крови ТСПА комплексируется с ретинол - связывающим белком, относящимся к классу липокалинов, за счет чего происходит сопряжение двух транспортных систем — системы транспорта ретинола и тиреоидных гормонов (Wang et. al., 1997, Картун и др., 2000).
В плазме большинства млекопитающих, в том числе и человека, имеется Р - глобулин, специфически связывающий тестостерон с относительно высоким сродством и ограниченной ёмкостью. Этот гликопротеид носит название секс — гормон - связывающий глобулин (СГСГ) или тестостерон - эстроген - связывающий глобулин (ТЭСГ) и образуется в печени (Hulsmeier et. al., 2007). Он термолабилен, имеет молекулярную массу 290 000 дальтон и изоэлектрическую точку 6,02-6,04. Образование этого гликопротеида стимулируется эстрогенами (у женщин концентрация СГСГ в сыворотке вдвое выше, чем у мужчин), при определённых болезнях печени и при гипертире-озе; под влиянием андрогенов, с возрастом и при гипотиреозе образование данного белка уменьшается. Многие из этих факторов влияют также, на синтез кортикостероид - связывающего глобулина Поскольку СГСГ и альбумин связывают до 97-99% циркулирующего в крови тестостерона, лишь небольшая его часть находится в крови в свободной (биологически активной) форме. Основная функция СГСГ состоит, вероятно, как и в случае других связывающих гормоны гликопротеидов крови, в том, чтобы ограничивать концентрацию свободного гормона в сыворотке и создавать его депо. Тестостерон связывается с СГСГ с большим сродством, чем эстрадиол, поэтому при изменении концентрации СГСГ содержание свободного тестостерона меняется в большей степени, чем свободного эстрадиола. Увеличение концентрации СГСГ способствует росту соотношения связанный/свободный: тестостерон. Этот феномен имеет место при старении, циррозе печени и гипер-тиреозе (Kengni et. al., 2007). Эстрогены и прогестины, подобно другим стероидам, связываются в различной степени с транспортными белками плазмы. Эстрогены связываются с СГСГ, а прогестины - с транскортином. Сродство СГСГ к эстра-диолу в пять раз ниже, чем к тестостерону; прогестерон и кортизол имеют очень низкое сродство к данному белку. В отличие от этого прогестерон и кортизол почти с равным сродством связываются с транскортином, который в свою очередь характеризуется низким сродством к эстрадиолу и еще более низким к тестостерону и эстрону (Картун и др., 2000).
Гормоны коры надпочечников - глюкокортикоиды, подобно другим гормонам первой группы, в плазме крови взаимодействуют с транспортными белками. Основной связывающий глюкокортикоиды белок плазмы - это а- глобулин, называемый транскортином (кортикостероид-связывающий белок) (Балаболкин, 1989). Транскортин образуется в печени, его синтез стимулируется эстрогегенами. Степень прочности связывания с транскортином определяет длительность периода полувыведения различных глюкокорти-коидов из организма. Так, кортизол прочно связывается с транскортином и его время полувыведения составляет 1,5—2 ч, тогда как кортикостерон, связывающийся слабее, имеет время полувыведения менее 1 ч. Транскортин связывает не только глюкокортикоиды. Дезоксикортикостерон и прогестерон взаимодействуют с этим белком с высоким сродством, достаточным для того, чтобы конкурировать с кортизолом (Балаболкин, 1989)..
Альдостерон - самый активный из природных минералокортикоидов, не имеет специфического транспортного белка в плазме, но образует слабые связи с альбумином. Кортикостерон и 11 -дезоксикортикостерон - стероиды, обладающие минералокортикоидным действием, связываются с транскортином. Гормоны мозгового слоя надпочечников (адреналин и норадрена-лин) циркулируют в плазме в слабоассоциированном с альбумином виде. Период их полувыведения из сыворотки крови составляет 10-30 секунд (Марри и др., 1993) . Гормон, связанный с белками, находится в постоянном равновесии со свободной биологически активной формой гормона. По мере снижения уровня свободного гормона, он освобождается из связанной с белками формы, за счет чего поддерживается постоянная концентрация свободной фракции гормона в периферической крови. Кроме того, транспортные белки влияют на скорость клиренса гормона, который осуществляется в печени и почках (Балаболкин, 1989).
Синтез аффинных сорбентов
Иммобилизацию глобулиновой фракции кроличьей антисыворотки к антигенным примесям, присутствующим в полуфабрикатах человеческого лейкоцитарного интерферона (овальбумину), на бромциан Сефарозе 4В фирмы "Pharmacia" (Швеция) проводили согласно рекомендациям фирмы. Глобулиновую фракцию антисыворотки разводили 0,1 М карбонатным буфером рН 8,5, содержащим 0,5 М хлористого натрия, до концентрации 10 мг белка на 1 мл и добавляли к равному объему отмытого на стеклянном фильтре 1мМ соляной кислотой носителя. Смесь инкубировали при периодическом встряхивании при 4 С в течение ночи, отмывали избыток белка буфером связывания и блокировали остаточные активные группы 0,1 М мо-ноэтаноламином рН 9,0 в течение 18 часов при 4С. Затем проводили три цикла отмыва сорбента буферами с контрастными значениями рН. Первоначально сорбент промывали 10 объемами (по отношению к объему сорбента) 0,1 М ацетатного буфера рН 4,0, приготовленного на 0,5 М хлористом натрии, затем - 10 объемами 0,1 М трис-буфера, рН 8,0 с 0,5 М хлористым натрием. Сорбент хранили при -20С под 50% глицерином.
Получение аффинных сорбентов на основе ПВС -носителя проводили по ранее описанному методу (Гарипова др., 1992, Гарипова и др., 1993). К отмытому дистиллированной водой и буфером связывания носителю добавляли равный объем лиганда, разведённого 0,1 М карбонатным буфером, приготовленным на 0,5М хлористом натрии (буфер связывания). Значение рН буфера связывания несколько различалось в зависимости от выбранного для иммобилизации лиганда. Иммобилизацию протеина А золотистого стафилококка проводили при рН 8,0, м-АФБК, глобулиновую фракцию антисыворотки - при рН 9,0-9,5. Связывание проводили при 4 С в течение 18 часов. Непрореагировавшие с белком альдегидные группы носителя нейтрализовали добавлением 0,1 М Р-аланина в 0,1 М карбонатном буфере рН 8,0. После 4 часов инкубации при 22 С проводили восстановление азометиновых связей боргидридом натрия, добавляемым порошком из расчета 1 мг на 1мл геля, в течение 4 часов при комнатной температуре.
Приготовленный аффинный сорбент промывали 2 раза последовательной сменой буферных растворов с кислым и щелочным значениями рН: 0,1М ацетатным буфером рН 4,0; ОДМ трис - буфером рН 8,0. Оба буфера готовили на 0,5М хлористом натрии. Расход каждого буфера за один цикл промывки должен составлять 10 объемов по отношению к объему сорбента. Сорбенты хранили в 50% глицерине при -20С.
При применении для стабилизации и активаций ПВС - носителя эпи-хлоргидрина, получение геля ПВС проводили аналогично (Гарипова и др., 1992). Активацию ПВС - геля ЭХГ проводили по известной методике (Дин и др., 1988). Полученный гель промывали 20 объемами дистиллированной воды на стеклянном фильтре и переносили в равный объем 1М гидроокиси натрия. К 100 мл суспензии при перемешивании добавляли 2,5 мл ЭХГ и перемешивали при 20 С в течении 15 минут, затем повышали температуру до 60 С, продолжая перемешивание в течении 2 часов. Эпокси - активированный носитель промывали водой и 10 объемами 0,2М карбоната натрия рН 11 и переносили в тот же раствор, содержащий 5 мг лиганда на 1 мл носителя. Суспензию выдерживали при 4 в течении 18 часов и промывали 1М раствором хлористого натрия. Для удаления непрореагировавших эпоксидный групп, гель выдерживали в течение недели в 0,2 М карбонатном буфере рН 11. Длительное хранение сорбента проводили в 50% глицерине при -20С. 6.1.2. Качественное определение альдегидных групп активированного глутаровым альдегидом ПВС-носителя
Для качественного определения включенного в сорбент глутарового альдегида использовали реакцию альдегидов с фуксинсернистой кислотой (реактивом Шиффа). Фуксинсернистую кислоту готовили по известной методике (Филлипович и др., 1975).
К 0,2 мл активированного глутаровым альдегидом носителя добавляли 2 мл дистиллированной воды, 0,05 мл 0,1 Н соляной кислоты и 0,1 мл реактива Шиффа. При наличии включенных в гель альдегидных групп в течение 10 минут развивается малиновое окрашивание. В качестве контроля использовали неактивированный носитель. Определение оксирановых групп ПВС-носителя, активированного эпихлоргидрином Для количественного определения оксирановых групп, включенных в гель, использовали реакцию восстановления оксирановых групп тиосульфатом натрия (Туркова, 1980).
Выделяющуюся в ходе реакции щелочь титровали 0,1 М соляной кислотой. К 2 мл влажного носителя добавляли 1 ,5 мл 1,3 М тиосульфата натрия рН 7,0. Содержание оксирановых групп рассчитывали по результату титрования щелочи, выделяющейся в количестве, эквивалентном содержанию эпоксидных групп.
Микроколичественное определение бора и других элементов в сорбентах проведено в аналитической лаборатории Института органической химии Уфимского научного центра РАН. Получение диазопроизводного овальбумна
Получение окрашенного производного овальбумина проводили по известному методу (Блок и др., 1968). К 10 мл раствора овальбумина с концентрацией 2 мг/мл добавляли 1,5 мл свежеприготовленной пара-диазосульфокислоты и 3 мл 10% карбоната натрия. Полученный диазоовальбумин имеет максимум поглощения в области 380-400 нм.
Для получения пара-диазосульфокислоты растворяли 100 мг сульфа-ниловой кислоты в 1 мл дистиллированной воды. Перед постановкой реакции к раствору добавляли 2 мл 0,5% нитрита натрия.
Иммобилизация инсулина на активированной бромцианом матрице
Для выделения инсулинсвязывшощих белков сыворотки были приготовлены аффинные сорбенты путем иммобилизации препарата инсулина (человеческий генно-инженерный инсулин ХУМУЛИН Р производства фирмы Lilly France S.A.) на активированной бромцианом Сефарозе 4В производства фирмы Pharmacia Fine Chemicals и поливиниловом носителе. Иммобилизацию белковых лигандов на активированной бромцианом Сефарозе 4В фирмы "Pharmacia fine chemicals" проводили согласно рекомендациям фирмы.
Для иммобилизации инсулина 5 мл активированной бромцианом Се-фарозы 4В отмывали 1л подкисленной дистиллированной воды (рН 5,0) от стабилизатора. Затем Сефарозу промывали 100 мл ОДМ карбонатного буфера рН 8,5 и добавляли раствор препарата инсулина на том же буфере из расчета 10 единиц гормона на 1 мл носителя. Таким образом, количество инсулина в расчете на 1 мл носителя при иммобилизации составляло 4 мг. Инкубацию проводили в течение 18 часов при 4С. Непрореагировавшие группы закрывали 0,1М моноэтаноламином в течение 4 часов при комнатной температуре. Сорбент отмывали от избытка инсулина двухкратной сменой 0,1 М раствора мочевины рН 5,5 на 0,5 М NaCl и 0,1М карбонатного буфера рН 9,0 на 0,5 М NaCl до отрицательной реакции на белок. Отмытый сорбент загружали в колонку объемом 5 мл и уравновешивали стартовым буфером (0,1М фосфатным буфером рН 7,2-7,4 на 0,1М NaCl).
Иммобилизацию инсулина на ПВС-носителе проводили по ранее описанному методу (Гарипова и др., 1998). К отмытому дистиллированной водой до отрицательной реакции на альдегиды носителю добавляли равный объем раствора инсулина, приготовленный на 0,1М карбонатном буфере рН8,5 с 0,5М хлористым натрием из расчета 10 единиц гормона на 1 мл носителя. Реакцию связывания лиганда с ПВС-носителем проводили при 4Св течение 18 часов. Непрореагировавшие альдегидные группы носителя нейтрализовали добавлением 0,1М (З-аланина в 0,1М карбонатном буфере рН 8,0. После 4 часов инкубации при 22 С проводили восстановление азомети-новых связей боргидридом натрия в течение 4 часов при комнатной температуре, добавляя его порошком из расчета 1 мг на 1 мл геля. Сорбент с иммобилизованным инсулином хранили при -20С в 50% растворе глицерина. Проведение хроматографического выделения связывающих инсулин белков сыворотки человека
Аффинную хроматографию проводили следующим образом: на колонку с аффинным сорбентом, уравновешенную физиологическим раствором, забуференным фосфатом с рН 7,2-7,4 (ЗФР), объемом 5 мл наносили 5 мл разбавленной в 10 раз испытуемой сыворотки. После проникновения сы диабете первого типа, полученные препараты были разделены гельхромато-графией на колонке с Сефадексом G-75, откалиброванной при помощи маркеров молекулярного веса фирмы Serva (Швеция).
На колонку 1,5 40 см с Сефадексом G-75, уравновешенную ЗФР, наносили 1 мл пробы и проводили хроматографию при скорости тока буфера 2 мл в минуту. Детекцию поглощения фракций в области 280 нм проводили при помощи проточного спектрофотометра «Uvicord-2» и самописца фирмы LKB. Иммуноферментное определение овальбумина, иммуноглобулинов человека подклассов IgG, IgM, IgA и антител к овальбумину проводили по стандартному методу (Engval et. al., 1971).
При определении антител к овальбумину, плоскодонный планшет Dy-natech microtiter сенсибилизировали овальбумином из расчета 200 мкл раствора, содержащего 10 мкг овальбумина на 1 мл 0,01М карбонатного буфера рН 9,6 в течение 18 часов при 4 С или 2 часа при 37 С. Затем планшет отмывали 4 раза забуференным фосфатом с рН 7,2-7,4 физиологическим раствором, содержащим 0,05% Твина 20, после чего в лунки планшета наслаивали 100 мкл титруемых антител, разведённых с шагом 2. Планшет инкубировали 1 час при 37С и вновь отмывали 4 раза ЗФР с 0,05% Твина 20, рН 7,2 - 7,4. Коньюгат антител к IgG кролика с пероксидазой хрена в рабочем разведении наслаивали в количестве 100 мкл на лунку и инкубировали 1час при 37 С.
После отмыва планшета в лунки наслаивали по 100 мкл субстрата пе-роксидазы для проявления реакции. Время проявления составляло 30-60 минут. Считывание реакции проводили визуально при использовании стандарта с известным содержанием антител.
Для иммуноферментного определения альбумина человека, овальбумина, иммуноглобулинов человека классов IgG, IgM, IgA и иммуноглобули нов кролика, планшеты сенсибилизировали 200 мкл рабочего разведения глобулиновой фракций соответствующей антисыворотки, разведенной 0,01М карбонатным буфером рН 9,6, в течение 18 часов при 4 С или при 37 С в течение 2 часов. Планшет промывали 4 раза ЗФР с 0,05% Твина 20, рН 7,2-7,4 и наслаивали по 100 мкл титруемого антигена, разведенного ЗФР с 0,05% Твина 20, с шагом 2. Связывание проводили при 37 С в течении часа, отмывали планшет ЗФР 4 раза и добавляли в каждую лунку по 100 мкл коныогата соответствующих антител с пероксидазой хрена в рабочем разведении. Планшет инкубировали в течение одного часа при 37 С, отмывали ЗФР и проявляли реактивом на пероксидазу. Считывание реакций проводили визуально с использованием раститрованных стандартов антигенов.
В качестве субстрата для индикаторного фермента использовали 5-аминосалициловую кислоту в концентрации 0,8 мг/мл, приготовленную на 0,01М фосфатном буфере рН 6,0, содержащем 0,001М ЭДТА. Перед применением к 10 мл реактива добавляли 1 мл 0,05% перекиси водорода. В каждую лунку вносили по 100 мкл свежеприготовленного реактива и проводили проявление до появления четкого различия между положительным и отрицательным контролями.
Иммуноферментное определение трийодтиронина, тироксина, тирео-тропного гормона, тестостерона, пролактина и хориогонина человека в пробах, полученных методом аффинной хроматографии проведено с использованием диагностических наборов фирмы Иммунотех (г.Москва) по прилагаемой инструкции.
Иммуноферментное определение а-фетопротеина проводили при помощи наборов фирмы «НВО Иммунотех» по прилагаемой инструкции. Исследуемые образцы сыворотки крови инкубировали в планшете с иммобилизованными на твердой фазе антителами к АФП и одновременно с конъю-гатом моноклональных антител к АФП с пероксидазой. Количество связавшегося конъюгата выявляли с помощью раствора субстрата (3,3 ,5,5 тетраметилбензидин с добавлением перекиси водорода). Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации АФП, содержащемуся в анализируемом образце. Минимальная концентрация АФП, определяемая с помощью набора, составляет 3,0 МЕ/мл (1нг/мл).
Метод проведения электрофореза белков на ацетатцел- люлозных пленках
Электрофорез выделенных аффинно связывающих инсулин белков в ацетатцеллюлозных пленках проводился с использованием системы Microtech 648 PC фирмы Interlab, предназначенной для полностью автоматизированного проведения электрофореза. Разделение поводили в стрипах с аце-татцеллюлозной мембраной высокой разрешающей способности производства фирмы Mylar. Электрофорез проводился в течение 40 минут при реальном напряжении 133,2 в и силе тока 6,5 — 6,8 мА, электрическое сопротивление стрипа с ацетатцеллюлозной пленкой в камере электрофореза составляло 19-21 кОм. Температура охлаждающей платы поддерживалась в пределах 14±0,5С. При проведении электрофореза использованы буферные растворы, прилагаемые к системе Microtech 648 PC, объём пробы при нанесении составлял 40 мкл.
Окрашивание электрофореграмм проводили с использованием красителя пунцово красного. После окрашивания электрофореграммы сканировали при помощи денситометра системы Microtech 648 PC. Проведение изоэлектрического фокусирования с иммунопроявлением
Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) элюатов с сорбента с иммобилизованным протеином A St. aureus и инсулин-связывающих фракций крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом проводили по ранее описанному методу (Гарипова и др., 1984).
Для ИЭФ использовали амфолины фирмы "Pharmacia" (Швеция), обеспечивающие формирование широкого градиента рН от 3,5 до 10 единиц рН. В качестве подложки использованы стеклянные пластины толщиной 2 мм. Подготовка стеклянной подложки Для активации поверхности стекла, стеклянные пластинки 9 12 см толщиной не более 2 мм укладывали друг на друга, помещая по краям между стеклами полоски полиэтилена размером 90 5 0,1 мм для формирования капиллярного пространства, в которое вносили 0,5% раствор у- метакрило-ил-оксипропил-триэтоксисилана в ксилоле и выдерживали 20 минут. Активацию проводили после высушивания пластинок при 60-70 С в течение 2 часов. Активированную поверхность трижды промывали ксилолом и высушивали. В результате активации, на стеклянной поверхности формировался монослой акрилатных групп, включающихся в гель полиакриламида при его формировании, что предупреждает отслаивание геля при проведении ИЭФ, фиксации и окраске геля.
На активированную поверхность стекла по краям накладывали 2 полоски полиметилметакрилата размером 0,5 5 90 мм, сверху помещали пластину из полиметилметакрилата толщиной 20 мм с площадью, равной площади стекла В образовавшееся капиллярное пространство вносили пипеткой дегазированный раствор, содержащий в расчете на 1 мл 4,85 мг акрила-мида, 0,15мг бис-метиленакриламида, 200мг сахарозы, 2% амфолинов широкого градиента, 0,004мг рибофлавина. Для формирования геля использовали фотополимеризацию в ультрафиолетовом свете в течение одного часа.
После окончания полимеризации верхнюю пластинку из полиметилметакрилата снимали, полученный гель ополаскивали водой для удаления непрореагировавших мономеров. Толщина полученного геля не должна превышать 0, 4 мм. Проведение разделения в тонком слое геля позволяет повысить эффективность отведения тепла при проведении электрофореза и улучшить разрешающую способность разделения, а также сэкономить реактивы (Ansorge et.al., 1980).
Установлено, что наилучшие результаты разделения могут быть получены при толщине геля 0,4 мм, так как более тонкий гель подсушивается при проведении ИЭФ (Гарипова и др., 1984, Зайцев и др., 1985).
Пробы вносили в гель путем аппликации пропитанных исследуемыми растворами полосок беззольного фильтра размером 3 5 мм. По краям геля наносили индикаторный раствор гемоглобина, который готовили осмотическим гемолизом эритроцитов кролика, предварительно отмытых от сывороточных белков 5% сахарозой. Разделяемые белки диффундировали в гель в течение 18 часов при 4С, после чего полоски фильтра удаляли. 6.8.3. Проведение изоэлектрического фокусирования
Перед проведением ИЭФ на анодном конце геля помещали полоску беззольного фильтра размером 3 9 см, смоченную 1М ортофосфорной кислотой, а на катодном - 1М гидроокисью натрия. Смоченные электролитами полоски располагались с таким расчетом, чтобы обеспечивался надежный контакт между гелем и платиновыми электродами, вмонтированными в крышку платиновой камеры. Перед началом ИЭФ гель помещали на охлаждающую плату и закрывали крышкой с вмонтированными электродами. При размере геля 9 12 0,4 см процесс разделения начинали при напряжении 480 вольт. Исходная сила тока при указанной концентрации амфолинов в начале разделения составляла 10 миллиампер. Через 10 минут напряжение увеличивали до 500 вольт, а еще через 10 минут - до 600 вольт. Через 30 минут после начала ИЭФ напряжение доводили до 700 вольт. После встречи гемо-глобиновых метчиков в нейтральной зоне рН напряжение повышали до 800 вольт, затем, после четкой фокусировки подфракций гемоглобина, напряжение увеличивали до 1000 вольт и через 20 минут заканчивали разделение. Автоматическое регулирование проведения ИЭФ осуществляли при использовании прибора «Мультифор - 2117» (LKB, Швеция) при проведении разделения при мощности 5 ватт. После завершения разделения контактные полоски удаляли и проводили фиксацию и окраску белков одним из методов.
